Articolo metodologico

Preparazione di Thermoresponsive Nanostrutturati Superfici Tissue Engineering

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DOI:

10.3791/53465

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1 marzo 2016

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1Department of Physics, Tokyo University of Science, 2Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University

In questo articolo

Sommario

Le superfici nanometriche di isole marine composte da copolimeri a blocchi termoresponsivi sono state fabbricate con il metodo Langmuir-Schaefer per controllare l'adesione e il distacco spontaneo delle cellule. Sono stati visualizzati sia la preparazione della superficie che l'adesione e il distacco delle cellule sulla superficie.

Abstract

Le superfici termoresponsive immobilizzate in poli(N-isopropilacrilammide) (PIPAAm) per il controllo dell'adesione e del distacco cellulare sono state fabbricate con il metodo Langmuir-Schaefer. I copolimeri a blocchi anfifilici composti da polistirene e PIPAAm (St-IPAAms) sono stati sintetizzati mediante polimerizzazione radicalica reversibile a trasferimento di catena di addizione-frammentazione (RAFT). Una soluzione di cloroformio di molecole di St-IPAAm è stata delicatamente lasciata cadere in un apparato a trogolo di Langmuir, ed entrambe le barriere dell'apparato sono state spostate orizzontalmente per comprimere il film e regolarne la densità. Quindi, il film di Langmuir St-IPAAm è stato trasferito orizzontalmente su un substrato di vetro modificato idrofobicamente da un dispositivo fissato in superficie. Le immagini al microscopio a forza atomica hanno rivelato chiaramente strutture di isole marine su scala nanometrica sulla superficie. La forza, la velocità e la qualità dell'adesione e del distacco cellulare sulla superficie preparata sono state modulate dalle variazioni di temperatura nell'intervallo di temperatura critica inferiore della soluzione delle molecole PIPAAm. Inoltre, una struttura cellulare bidimensionale (foglio cellulare) è stata recuperata con successo sulle superfici ottimizzate. Queste superfici PIPAAm uniche possono essere utili per controllare la forza di adesione e distacco delle cellule.

Introduzione

superfici nanostrutturate hanno recentemente attirato notevole attenzione a causa delle loro diverse applicazioni potenziali, tra cui patterning, colture cellulari, la pulizia, e la commutazione di superficie. Ad esempio, le superfici superhydrophobic ispirati al nanostruttura della foglia di loto e altre superfici sensibili sono in grado di reagire agli stimoli esterni 1-4.

Il film Langmuir è uno dei rivestimenti polimerici più studiati. Un film Langmuir è formato facendo cadere molecole anfifiliche su una interfaccia aria-acqua 5-8. Il film può poi essere trasferito su una superficie solida per adsorbimento fisico o chimico, e la conformazione molecolare su una superficie solida può essere controllato usando metodi di trasferimento verticali e orizzontali 9-12. La densità del film Langmuir può essere regolata con precisione comprimendo l'interfaccia aria-acqua. Recentemente, questo metodo si è dimostrato efficace anche per la realizzazione di nanoscaled structur mare-isolaes utilizzando copolimeri a blocchi anfifilici. Le nanostrutture sono considerata formata da un nucleo di segmenti idrofobi e un guscio di segmenti idrofili 13-17. Inoltre, il numero di nanostrutture su una superficie è regolata controllando l'area per molecola (A m) del copolimero a blocchi all'interfaccia.

Ci siamo concentrati su un originale, unico approccio di ingegneria tissutale senza patibolo, ingegneria strato di cellule, utilizzando una superficie cultura sensibile alla temperatura. La tecnologia sviluppata è stata applicata alle terapie rigenerative per vari organi 18. Una superficie coltura sensibile alla temperatura è stato fabbricato mediante innesto poli (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), una molecola sensibile alla temperatura, su una superficie 19-27. PIPAAm ei suoi copolimeri presentano una temperatura più bassa soluzione critica (LCST) in ambiente acquoso a temperature vicine a 32 ° C. La superficie di cultura anche esposto un alternati sensibile alla temperatura ON tra idrofobicità e idrofilia. A 37 ° C, la superficie PIPAAm innestate divenne idrofobi, e le cellule facilmente attaccata e proliferavano sulla superficie e sulla convenzionale polistirene coltura tissutale. Quando la temperatura è stata abbassata a 20 ° C, la superficie diventa idrofila, e le cellule spontaneamente staccato dalla superficie. Pertanto, le cellule confluenti in coltura sulla superficie potrebbero essere raccolti come un foglio intatto variando la temperatura. Queste proprietà di adesione cellulare e il distacco sono stati visualizzati anche da una superficie fabbricata da film di rivestimento Langmuir per il laboratorio dimostrativo 26, 27. Un film Langmuir di copolimeri a blocchi costituiti da polistirene (P (St)) e PIPAAm (St-IPAAm) è stato fabbricato. Il film Langmuir con una determinata A m potrebbe essere orizzontalmente trasferito ad un substrato di vetro idrofobicamente modificato. Inoltre, l'adesione cellulare su e distacco dalla superficie preparata in risposta alla temperatura sono stati valutati.

_content "> Qui, descriviamo protocolli per la realizzazione di un film Langmuir nanostrutturati composto di copolimeri a blocchi anfifilici termo-reattivo su un substrato di vetro. Il nostro metodo può fornire una tecnica di fabbricazione efficace per nanopellicole organici in vari campi della scienza delle superfici e può facilitare more controllo efficace di adesione cellulare su e distacco spontaneo da una superficie.

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Protocollo

1. Sintesi di Polystyrene- blocco -poly (N -isopropylacrylamide) da due fasi reversibile addizione frammentazione catena di trasferimento (RAFT) polimerizzazione radicale

  1. Sciogliere stirene (153,6 mmol), 4-ciano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) Acido sulfanylpentanoic (ECT; 0,2 mmoli), e 4,4'-azobis (acido 4-cyanovaleric) (ACVA; 0,04 mmoli) in 40 ml di 1, 4-diossano. Congelare la soluzione in azoto liquido sotto vuoto per 15-20 minuti per rimuovere le specie reattive e gradualmente scongelare a RT. Assicurarsi che la soluzione sia completamente scongelato e ripetere questo ciclo di degasaggio gelo-disgelo pompa-tre volte.
  2. Ottenere il polistirene (PST) (Mw: 13.500) come agente RAFT macro per polimerizzazione a 70 ° C per 15 h in un bagno d'olio.
  3. Precipitato PSt agente macro zattera con 800 ml di etere e secco sotto vuoto.
  4. Sciogliere IPAAm monomero (4,32 mmol), agente RAFT macro PSt (0,022 mmol), e ACVA (0,004 mmol) in 4 ml di 1,4-diossano.
  5. Cancellal'ossigeno nella soluzione dai cicli di degasaggio gelo-disgelo pompa come indicato nel passaggio 1.1.
  6. Eseguire una polimerizzazione a 70 ° C per 15 h in un bagno d'olio dopo degasaggio. Ottenere sintetizzato molecola St-IPAAm (Mw: 32.800) nello stesso modo come l'agente macro RAFT PSt.

2. Preparazione di Silanized idrofobo modificati substrati di vetro

  1. substrati di vetro Lavare (24 mm x 50 mm) con un eccesso di acetone ed etanolo e ultrasuoni per 5 minuti per rimuovere contaminanti.
  2. Essiccare i substrati in un forno a 65 ° C per 30 min. Quindi utilizzare plasma di ossigeno (400 W, 3 min) per attivare le superfici dei substrati a RT.
  3. Immergere i substrati in toluene contenente 1% hexyltrimethoxysilane notte a RT per silanizzare substrato.
  4. Lavare i substrati silanizzati in toluene e immergere in acetone per 30 minuti per rimuovere gli agenti non hanno reagito.
  5. substrati ricottura per 2 ore a 110 ° C per immobilizzare accuratamente le sla tua faccia.
  6. Tagliare i substrati silanizzati da una taglierina di vetro di 25 mm x 24 mm per adattarsi i piatti di coltura cellulare (dimensioni piatto: φ35 mm).

3. Preparazione di Langmuir Films e Film-trasferito Surface

  1. Posizionare lo strumento pellicola Langmuir in un armadio per impedire l'accumulo di polvere.
  2. Lavare la vasca Langmuir (dimensioni: 580 millimetri x 145 mm) e barriere con acqua distillata ed etanolo per rimuovere i contaminanti.
  3. Asciugare il canale e le barriere strofinando con un panno senza filaccia. Poi riempire la vasca con circa 110 ml di acqua distillata, e impostare le barriere su entrambi i lati del trogolo. Si noti che l'acqua distillata dovrebbe essere aggiunta senza versare nelle seguenti operazioni dal 3.5 al 3.13.
  4. Riscaldare platino Wilhelmy piastra (perimetrale: 39,24 millimetri) per il monitoraggio della tensione superficiale con un bruciatore a gas finché la piastra diventa rosso e poi lavare con acqua distillata per rimuovere i contaminanti. Sospendere la piastra Wilhelmy su un filo attaccatolo strumento superficie di misurazione della pressione.
  5. Azzerare lo strumento superficie di misurazione della pressione secondo il protocollo del produttore. Comprimere all'interfaccia aria-acqua trogolo dalle barriere su entrambi i lati del trogolo fino all'interfaccia raggiunge circa il 50 cm 2 senza gocce di polimero.
  6. Aspirare piccoli contaminanti fino alla pressione di superficie è quasi 0 mN / m.
  7. Riposizionare le barriere su entrambi i lati, e aggiungere acqua distillata per compensare la diminuzione di acqua distillata dal punto 3.6.
  8. Disciogliere 5 mg del sintetizzato molecole St-IPAAm in 5 ml di una soluzione di sviluppo di cloroformio.
    Nota: diclorometano o toluene può anche essere usato come solvente.
  9. Delicatamente cadere 27 ml di St-IPAAm disciolti in cloroformio sul trogolo con una microsiringa o micropipetta.
  10. Dopo un'attesa di 5 minuti per consentire la completa evaporazione del cloroformio, spostare entrambi barriere orizzontale per comprimere il molecu St-IPAAmle all'interfaccia. Mantenere il tasso di compressione delle barriere a 0,5 mm / sec fino alla zona di destinazione del 50 cm 2 è raggiunto.
    Nota: Un rapporto di compressione rapida provoca difetti nel film Langmuir.
  11. Misurare la pressione superficiale (π) -A m isoterme con il platino Wilhelmy piatto attaccato allo strumento superficie di misurazione della pressione durante la compressione secondo il protocollo del produttore.
  12. Dopo aver raggiunto le dimensioni dell'area di destinazione, mantenere la superficie per 5 minuti per consentire alle molecole di St-IPAAm per rilassarsi; le molecole non raggiungono l'equilibrio subito dopo la compressione.
  13. Trasferire il film Langmuir ad un substrato di vetro idrofobicamente modificato utilizzando un dispositivo di trasferimento per 5 minuti per adsorbire robusto film. Fissare il substrato di vetro idrofoba in parallelo sul dispositivo. Collegare il dispositivo a una fase di allineamento e spostare perpendicolarmente.
  14. Sollevare il substrato orizzontalmente con il dispositivo di trasferimento e asciugare per 1 giorno in un desiccator.

4. coltura di cellule e ottimizzazione adesione cellulare e distacco sulla superficie Langmuir Film Trasferito

  1. Per preparare sospensioni cellulari, cellule endoteliali cultura bovini carotide (BAECs) a un terzo confluenza a 37 ° C in 5% CO 2 e il 95% di aria in coltura tissutale polistirene (TCPS) con Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) contenente 10% fetale siero bovino (FBS) e 100 U / ml di penicillina.
  2. Dopo confluenza viene raggiunto, trattare BAECs con 3 ml di 0,25% tripsina-EDTA per 3 minuti a 37 ° C in 5% CO 2 e il 95% di aria.
  3. Disattivare la tripsina-EDTA aggiungendo 10 ml di DMEM contenente 10% FBS, e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 ml.
  4. Centrifugare a 120 xg per 5 min, e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule con 10 ml di DMEM.
  5. Posizionare le superfici St-IPAAm sotto luce ultravioletta su un banco pulito per la sterilizzazione per 5 min.
  6. Seme ce recuperatoLLS sulla St-IPAAm superfici ad una concentrazione di 1,0 x 10 4 cellule / cm 2 conteggiati da un emocitometro monouso e osservare le cellule sulle superfici da un microscopio dotato di un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e il 95% aria.
    Nota: Sterilizzare le superfici St-IPAAm dalla luce ultravioletta dotato di un banco pulito.
  7. Per registrare immagini time-lapse di BAECs aderenti per circa 24,5 ore a 37 ° C con un microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 10x. Dopo l'adesione BAEC, registrare distacco delle BAECs dalla superficie St-IPAAm a 20 ° C per circa 3,5 ore.

5. cellulare Foglio Fabrication sulle superfici Langmuir Film-trasferiti

  1. BAECs di coltura utilizzate nello stesso modo descritto nella Sezione 4.
  2. Seme un totale di 1,0 x 10 5 cellule / cm 2 su superfici St-IPAAm ed incubare per 3 giorni a 37 ° C in 5% CO 2. Confluenti BAECs spontaneamente staccato a 20 ° C.

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Risultati

Copolimeri a blocchi composti da polistirolo e poli (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) con pesi molecolari specifici sono stati sintetizzati in zattera polimerizzazione radicale. ECT è stato preparato come trasferitore di catena come descritto in Moad et al. 28. Due molecole St-IPAAm di diversa lunghezza di catena PIPAAm stati sintetizzati, ei polimeri a blocchi ottenuti sono stati caratterizzati da 1 H di risonanza magnetica nucleare (NMR) e cro...

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Discussione

Una superficie sensibile alla temperatura è stato fabbricato con il metodo Langmuir-Schaefer, e le proprietà di superficie per l'adesione cellulare / distacco e strato di cellule di recupero sono state ottimizzate. Quando si utilizza questo metodo per la realizzazione di superfici, diversi passaggi sono critici. La composizione molecolare delle molecole St-IPAAm ha un grande effetto sulla struttura superficiale e alla stabilità della superficie, e, per estensione, a adesione cellulare e distacco. In particolare, le ...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori hanno contribuito in egual misura alla stesura del manoscritto e hanno approvato la versione finale. Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dal Progetto per lo Sviluppo di Sistemi di Innovazione "Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)" del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT), Giappone.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
N-isopropilacrilammideKohjinNessun numero di catalogo
Azobis(acido 4-cianovalerico)Wako Pure Chemicals016-19332
StireneSigma-AldrichS4972
1,3,5-triossanoSigma-AldrichT81108
1,4-DiossanoWako Pure Chemicals045-24491
DMEMSigmaD6429
PBSNakarai11482-15
StreptomicinaGIBCO BRL15140-163
PenicillinaGIBCO BRL15140-122
Tripsina-EDTASigmaT4174
FBSGiappone BiosieroJBS-11501
BAECScience Reserch Resources BankJCRB0099
Occhiali di coperturaMatsunami Glass IndustryC024501
AFM NanoScope VVeeco
1H NMR INOVA 400Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPCTosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000Tosoh
Langmuir-BlodgettKSV InstrumentsKN 2002KSV NIWA Midium trogolo
Nikon ECLIPSE TE2000-UNikon
Health Abbeveratoi di deposizione di

Riferimenti

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