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Articolo metodologico

Ortotopico degli arti posteriori del trapianto di mouse

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DOI:

10.3791/53483

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12 febbraio 2016

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University, 3Center for Vascularized Composite Allotransplantation, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chang Gung Memorial Hospital and School of Medicine, 4Department of General, Visceral and Transplant Surgery, Charite Berlin

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo nuovo modello per il trapianto degli arti posteriori ortotopico nel topo, applicando una tecnica bracciale non sutura per anastomosi super-microvascolare, fornisce un potente strumento per la ricerca in vivo meccanicistica immunologica relative al allotrapianto composito vascolarizzato (VCA).

Abstract

I sistemi di modelli animali in vivo, e in particolare i modelli murini, si sono evoluti in strumenti scientifici potenti e versatili indispensabili per la ricerca di base e traslazionale nel campo della medicina dei trapianti. In questo contesto è disponibile una vasta gamma di reagenti, tra cui anticorpi mono e policlonali sia per applicazioni diagnostiche che interventistiche. Inoltre, un vasto numero di ceppi genotipizzati, consanguinei, transgenici e knock out consente un'indagine dettagliata dei contributi individuali dei componenti umorali e cellulari alla complessa interazione di una risposta immunitaria e rende il topo il gold standard per la ricerca immunologica.

'L'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA) delinea un nuovo campo di trapianto utilizzando allotrapianti per sostituire "simile con simile" nei pazienti che soffrono di perdita di tessuto traumatica o congenita. Questo protocollo metodologico chirurgico mostra l'uso di una tecnica di cuffia senza sutura per l'anastomosi super-microvascolare in un modello di trapianto ortotopico di arto posteriore di topo. Il modello consente in particolare il confronto tra i paradigmi consolidati nel trapianto di organi solidi con una nuova forma di trapianto costituita da vari componenti tissutali diversi. In modo univoco, questo modello consente il trapianto di un compartimento e di una nicchia di midollo osseo vascolarizzati vitali che hanno il potenziale di esercitare un effetto benefico sull'equilibrio dell'accettazione e del rigetto immunitario. Questa tecnica fornisce uno strumento per studiare il riconoscimento degli alloantigeni e il rigetto e l'accettazione dell'allotrapianto, oltre a consentire il perseguimento di studi sulla rigenerazione funzionale dei nervi per far progredire ulteriormente questo nuovo campo dei trapianti.

Introduzione

La fine degli anni novanta ha segnato i giorni pionieristici del trapianto ricostruttivo con il primo trapianto di mano eseguito con successo in Francia nel 1998. Da allora, l'uso di VCA per la ricostruzione di difetti tissutali devastanti è stato impiegato con successo in un ampio spettro di pazienti. Ad oggi, il mondo conta 76 destinatari di 112 arti superiori e 31 volti 1-3. Inoltre, sono stati eseguiti diversi altri tipi di VCA come la parete addominale 4, la laringe 5, la trachea 6, le articolazioni vascolarizzate 7 e persino il pene 8. Inoltre, la nascita viva di un bambino è stata recentemente segnalata dopo il trapianto di utero 9. Questa crescente esperienza mondiale è indicativa di come il trapianto ricostruttivo sia diventato una valida opzione terapeutica per i pazienti affetti da difetti funzionali tissutali significativi non modificabili dalla chirurgia e dal trattamento ricostruttivo e restaurativo convenzionale.

Sebbene l'idea di sostituire "simile con simile" abbia suscitato entusiasmo clinico, lo scetticismo iniziale prevale ancora per quanto riguarda gli effetti collaterali dell'immunosoppressione convenzionale ad alte dosi necessaria per mantenere gli allotrapianti e la loro funzione 10,11. Tuttavia, come dimostrato dal lavoro seminale di Lee et al., questi innesti compositi hanno meno probabilità di rigettare rispetto ai suoi singoli componenti e, inoltre, alcuni dei componenti tissutali come il compartimento osseo vascolarizzato hanno alimentato l'ottimismo in quanto potrebbero esercitare effetti immunologici unici sull'equilibrio tra accettazione e rigetto immunitario 12.

Il nostro gruppo ha aperto la strada a diversi modelli animali microchirurgici per il trapianto di organi solidi, così come l'allotrapianto composito vascolarizzato 13-19. Qui descriviamo una nuova procedura chirurgica che utilizza una tecnica di cuffia senza sutura per eseguire anastomosi super micro-vascolare in un modello di trapianto ortotopico di arto posteriore di topo. Questo modello di trapianto fornisce uno strumento utile per studiare i meccanismi di accettazione e rigetto immunitario, nonché il ruolo dei singoli componenti tissutali, come il compartimento vascolarizzato del midollo osseo, verso l'induzione della tolleranza nel contesto immunologicamente versatile della specie topina. Inoltre, il posizionamento ortotopico dell'arto apre le possibilità per la rigenerazione nervosa e gli studi sui risultati funzionali, che sono di fondamentale importanza per il contesto della VCA.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institute of Health (NIH) e sono stati approvati dal Comitato Johns Hopkins University Animal Care e Usa (JHUACUC). Le procedure specifiche sono state eseguite sotto la MO13M108 protocollo ACUC approvato.

Operazione 1. donatore

  1. Somministrare l'analgesia al punto momento opportuno per ogni formulazione farmacologica prima di un intervento chirurgico. Come per la cura degli animali approvato e l'uso l'uso del protocollo 0,1 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per via sottocutanea 1 ora prima della incisione cutanea.
  2. Sedare il donatore con isoflurano applicato attraverso una camera collegata ad un vaporizzatore isoflurano al 4%; mantenere la sedazione e l'anestesia al 2% attraverso un cono di naso. Eseguire punta pizzico ritiro di riflessione per monitorare la profondità dell'anestesia prima dell'inizio della procedura.
  3. Indossare maschere, abiti di isolamento monouso e guanti.
  4. Radere l'ar chirurgicaEA, in particolare l'arto posteriore e l'inguine, e preparazione con il 10% Povidone - iodio.
  5. Utilizzare un drappo campo sterile, strumenti in autoclave e un microscopio ad alto ingrandimento (40X).
  6. Rendere all'inguine incisione cutanea usando forbici prossimalmente alla metà coscia e circonferenzialmente collegare l'incisione per delimitare l'arto posteriore dal resto del corpo del mouse.
  7. Identificare e sezionare l'arteria femorale, vena e nervo. Separare tutte le tre strutture con pinze e micro-forbici.
  8. Una volta che il peduncolo vascolare è sezionato dividere i vasi a livello del legamento inguinale con le forbici micro.
  9. Successivamente, continuare a dividere i singoli ventrale (gracilis e muscoli della coscia mediale) e gruppi muscolari dorsali 20 prossimalmente a livello della metà coscia per separare l'innesto dal donatore con le forbici.
  10. Transect femore e tagliare a metà del femore con le forbici.
  11. L'eutanasia degli animali da isoflurano fol overdoselowed da dislocazione cervicale. Confermare la cessazione del battito cardiaco e la respirazione.
  12. Lavare l'arto con 2 ml eparinizzate (30 IE) fredda (4 ° C) saline utilizzando un 33 G lavaggio ago montato su una siringa (vedi Materiali Tabella).
  13. Posizionare un bracciale in poliimmide la vena femorale e l'arteria, rispettivamente.
  14. Avvolgere trapianto in garza di cotone bagnato, posto nella capsula di Petri e conservare a 4 ° C fino a quando nel riquadro.

2. Destinatario Funzionamento

  1. La rimozione del dell'arto posteriore
    1. Somministrare l'analgesia al punto momento opportuno per ogni formulazione farmacologica prima di un intervento chirurgico. Come per la cura degli animali approvato e l'uso l'uso del protocollo 0,1 mg / kg di peso corporeo di Buprenorfina SC 1 ora prima della incisione cutanea.
    2. Sedare il donatore con isoflurano applicato attraverso una camera collegata ad un vaporizzatore isoflurano al 4%; mantenere la sedazione e l'anestesia al 2% attraverso un cono di naso. Eseguire punta pizzico ritiro di riflessione per monitorare il repartoh di anestesia prima dell'inizio del procedimento.
    3. Usare pomata veterinario gli occhi del mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
    4. Radere l'area chirurgica, in particolare l'arto posteriore e l'inguine e preparazione con il 10% Povidone - iodio.
    5. Rendere all'inguine incisione cutanea usando forbici prossimalmente alla metà coscia e circonferenzialmente collegare l'incisione per delimitare l'arto posteriore dal resto del corpo del mouse.
    6. Identificare e sezionare l'arteria femorale, vena e nervo e separare tutte le tre strutture con pinze e micro-forbici.
    7. Una volta che il peduncolo vascolare è sezionato, bloccare i vasi femorali a livello del legamento inguinale.
    8. Tagliare i vasi distale a livello dell'arteria epigastrica superficiale.
    9. Successivamente, continuare a dividere i singoli ventrale (gracilis e muscoli della coscia mediale) e dorsali gruppi muscolari 20 prossimalmente a livello della metà coscia per separare il hind li nativamb dagli animali destinatario utilizzando le forbici.
    10. Transect il femore nel mezzo della diafisi femorale con le forbici.
    11. Cauterize muscoli della coscia precedentemente sezionati per prevenire le emorragie del sito dissezione e, quindi, la perdita di sangue destinatario.
  2. Impianto
    1. Minimizzare la perdita di fluido irrigando il campo operatorio con soluzione fisiologica tiepida (37 ° C) e l'iniezione di 0,3 ml di soluzione salina calda prima e dopo l'operazione.
    2. Inserire l'innesto in modo da riflettere la posizione anatomica accurata dell'arto posteriore nativa allineando dell'osso femore del destinatario e l'innesto e collegate con un ago spinale 20 G come un chiodo endomidollare.
    3. Coapt i gruppi muscolari ventrale e dorsale con materiale di sutura riassorbibile (6-0 Polysorb).
    4. Collegare vasi femorali con la tecnica bracciale non suture; in dettaglio, tirare il lato ricevente della nave sui polsini precedentemente montate sulla nave estremità del graft. Utilizzare una sutura in nylon 10-0 ed eseguire una cravatta circonferenziale per fissare la nave ricevente sul bracciale.
    5. Successivo rilasciare le fascette. In questa fase verificare visivamente la rotazione bracciale e un posizionamento ottimale per evitare errori di rotazione e piegamento dei vasi.
    6. Eseguire emostasi meticolosa con cauterizzazione electro con una particolare attenzione per l'interfaccia del donatore ricevente muscolare e le estremità delle ossa.
    7. Chiudere la pelle con punti di sutura in nylon non assorbibili (6-0 ETHILON).
    8. Stabilire condizioni normotermici consentendo all'animale di recuperare nella sua gabbia sotto una lampada riscaldante. Continuare monitoraggio regolare per almeno 4 ore prima di ritornare alla struttura alloggiativa.
    9. Fornire analgesia post-operatoria con buprenorfina alla dose di 0,1 mg / kg SC ogni 6-8 ore per 3 giorni.

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Risultati

Esecuzione vascolarizzato allotrapianto composito in un modello di topo usando una tecnica bracciale non sutura consente di ottenere eccellenti e lungo graft termine e animali sopravvivenza come mostrato in Figura 1. Inoltre, rappresenta un metodo affidabile per ottenere risultati riproducibili di graduale rifiuto allograft in composito vascolarizzata allotrapianto come documentato dalle immagini mostrate in figura 2. H & e istologic...

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Discussione

Vascolarizzato Composite allotrapianto, come ad esempio arti superiori e il trapianto di faccia per la ricostruzione di difetti del tessuto devastanti, si è evoluto come opzione di trattamento valido per i pazienti non modificabili a procedure ricostruttive tradizionali. I progressi tecnici nel campo della microchirurgia ricostruttiva, nonché una vasta esperienza con immunosoppressori potenti e le terapie modulatori del sistema immunitario a trapianto di organo solido, ora permette la sopravvivenza del trapianto a lungo...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Esercito, Marina, NIH, Aeronautica, VA e Health Affairs per sostenere lo sforzo AFIRM II, sotto Premio n W81XWH-13-2-0053. L'US Army Medical Research di acquisizione di attività, 820 Chandler Street, Fort Detrick MD 21.702-5.014 è l'Ufficio acquisizione assegnazione e la gestione. Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle dell'autore e non sono necessariamente condivise dal Dipartimento della Difesa.

Gli autori desiderano ringraziare Jessica Izzi, DVM, Caroline Garrett, DVM e Julie Watson, DVM per il loro eccellente supporto veterinario nel corso di questo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sutura, 6-0 NylonMWI31849
Sutura, 6-0 PolisorboMWI72667
Sutura, 10-0 NylonAero SurgicalTK-107038
Tubo in poliimmide, misura 25Vention Medical141-0023
Tubo in poliimmide, misura 27Vention Medical141-0015
Morsetti microvascolari (singolo)Synovis00396
Morsetti microvascolari (doppi)Synovis00414
Micro-forbiciSynovisSAS-18
Micro-PinzeSynovisFRS-15 RM-8
Micro-dilatatoriSynovisFRS-15 RM-8D.1
Micro-NeedledriverSynovisC-14
Applicatore Micro-ClampSynovisCAF-4
Ago per microlavaggioHamilton10MM, 30°, 33G
Soluzione di ringer lattatiFisherScientific NC9968051
BuprenorfinaNumero DEA richiesto; Ottenuto da farmacia ospedaliera.
Enrofloxacina; BaytrilBayer Health Care186599
eparinaottenuta da farmacia ospedaliera

Riferimenti

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