In questo studio viene dimostrato un protocollo video passo-passo di resezione apicale. La resezione apicale è un approccio chirurgico recentemente evidenziato nella ricerca sulla rigenerazione cardiaca dei mammiferi. Questo studio può promuovere l'applicazione della resezione apicale come metodologia standard nella ricerca sul meccanismo alla base della rigenerazione cardiaca.
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Articolo metodologico
Modello apicale resezione mouse per primo studio Mammalian rigenerazione cardiaca
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le malattie cardiovascolari affligge tutto il mondo a causa di cambiamenti di lifestyle intensive. Rigenerazione del cuore una grande promessa per riparazione e ripristino cardiomiociti persi a causa di infortunio e malattia. In contrasto con la rigenerazione cardiaca robusta di alcuni vertebrati inferiori, cuori mammiferi adulti mostrano tipicamente una capacità minima di rigenerazione cuore e riparazione. Tuttavia, studi recenti hanno suscitato un notevole interesse scientifico con la constatazione che, tra il giorno postnatale 1-7 (P1 a P7), il cuore neonatale del mouse mantiene notevole potenziale rigenerativo dopo la resezione apicale (cioè, amputazione chirurgica e l'esposizione di sinistra apice ventricolare). Una polemica importante su questo risultato potrebbe essere dovuto alle diverse procedure di chirurgia legati utilizzati negli sforzi per replicare o espandere su questo importante risultato. Queste istruzioni presentano dinamicamente i materiali e la metodologia per la resezione apicale in un modello di topo. Le fasi salienti di questo roditore Survivachirurgia l coinvolge ipotermia anestesia, toracotomia, amputazione chirurgica del ventricolo cuore apice, e sutura e il recupero di topi. L'approccio descritto potrebbe espandere l'applicazione del modello di topo di resezione apicale per la ricerca cardiovascolare.
Introduzione
La prolungata durata della vita umana porta a varie malattie legate all'invecchiamento e allo stile di vita, tra cui l'insufficienza cardiaca, una delle principali cause di mortalità. Tuttavia, senza la sostituzione delle cellule muscolari cardiache perse o disfunzionali, le terapie attuali possono migliorare solo transitoriamente la funzione cardiaca1, 2. Pertanto, è necessario scoprire e sviluppare strategie innovative per la rigenerazione e la riparazione cardiaca. Il cuore di un mammifero adulto ha un potenziale rigenerativo limitato. Studi condotti su vertebrati inferiori, come gli anfibi urodele e i pesci teleostei, hanno fornito informazioni senza precedenti sui meccanismi molecolari e cellulari alla base della rigenerazione cardiaca3, 4. Recentemente, è emerso un modello murino neonatale di rigenerazione cardiaca che potrebbe consentire l'identificazione e la caratterizzazione di eventi fisiopatologici evolutivamente più conservati necessari per la rigenerazione del cuore umano5.
La resezione apicale si riferisce alla rimozione chirurgica dell'apice ventricolare sinistro. Questa procedura è limitata ai topi di età compresa tra 1 e 7 giorni (da P1 a P7) a causa della sua elevata letalità nei topi più anziani6. Si prevede che il processo di rigenerazione cardiaca nei topi neonatali dopo resezione apicale sia il seguente: (I) formazione rapida ed efficace di un ematoma per sigillare l'apice e prevenire il dissanguamento; (II) rigenerazione dei cardiomiociti e ripristino della funzione sistolica5, 7. Lavori recenti hanno stimolato il dibattito sul significato e l'efficienza di questo modello8-11. Pertanto, è importante presentare la resezione apicale in modo chiaro e dettagliato. A tal fine, questo protocollo descrive in modo vivido e specifico un video di come ho eseguito la resezione apicale basato su un precedente protocollo6.
Comprendere i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione cardiaca è importante per il trattamento delle malattie cardiache caratterizzate da perdita e/o danneggiamento dei cardiomiociti, come l'insufficienza cardiaca1, 2. Dati gli attuali e promettenti progressi della resezione apicale nella ricerca sulla rigenerazione cardiaca, questo studio potrebbe promuovere l'uso di questa tecnica e i suoi usi nella ricerca sulla rigenerazione cardiaca.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti di topo sono stati approvati dalla cura degli animali e Use Program presso il National Institutes of Health (NIH) con il numero di protocollo H0083R3. Il NHLBI IACUC ha approvato il protocollo, senza analgesici.
1. L'ipotermia Anestesia nei topi neonatale
- Sterilizzare spugne e apparecchi chirurgici in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Preparare tutti i materiali chirurgici e accendere un caldo tallone sterilizzatrice 15-20 minuti in anticipo per raggiungere 240 ° C a 270 ° C.
- Trasferire tutte C57BL / 6 cuccioli (età P1) dalla loro madre durante l'allattamento per una gabbia pulita mouse con biancheria fresca e materiali per i nidi. Una volta che i cuccioli sono presi in una sala operatoria, eseguire la chirurgia apicale prontamente per minimizzare il tempo trascorso separato dalla madre e per ridurre il rischio di cannibalizzazione materna.
- Mettere spugne su un letto di ghiaccio e poi mettere un cucciolo sulla spugna per ~ 3 min per raggiungere l'anestesia ipotermia. Confermare anestesia osservando apnea e acinesia e pizzicando un piede posteriore. Controllare lo stato dei neonati spesso perché troppo poco tempo non farà il akinetic cucciolo e apnea, e una durata eccessiva di anestesia può abbassare il tasso di sopravvivenza 12.
2. Toracotomia
- Trasferire il cucciolo dal letto di ghiaccio su una zona banco chirurgica e l'uso del nastro di immobilizzare le braccia, gambe e la coda in posizione supina.
- Disinfettare il petto con betadine e delicatamente pulire con un tampone imbevuto di alcool al 70%.
- Fare un incisione cutanea trasversale lungo la zona via intercostale della cavità toracica con una Vannas primavera forbice, e quindi smussare sezionare i muscoli intercostali avanti per facilitare l'accesso al cuore.
NOTA: I tassi di sopravvivenza migliorano quando la perdita di sangue è ridotto al minimo durante il processo chirurgico.
3. amputazione chirurgica del Cuore ventricolare Apex
- A mano, applicare delicatamente pressione sull'addome per esteriorizzare laapice del cuore. Assorbire sangue intorno l'area chirurgica con applicatori con punta in cotone sterili per la visualizzazione chiara. Per i neonati di controllo sham, procedere direttamente al punto 4 (Sutura e recupero dei Topi).
- Sotto una lampada di ingrandimento e con iridectomia forbici, eseguire delicatamente la resezione frammentaria del ventricolo sinistro (LV) finché la camera LV è esposto. Fare attenzione a ridurre al minimo le parti asportate del LV. Circa il 15% la resezione è necessaria per conseguire esposizione ottimale della camera di LV.
- Assicurarsi che il cuore ritorna alla cavità toracica appena la camera di LV è esposto.
4. Sutura e recupero dei topi
- Suturare le costole e muscoli insieme per sigillare la cavità toracica utilizzando sterili suture Proline 6-0, e quindi chiudere con cura il sito di incisione cutanea con colla pelle.
- Scaldare il neonato sotto una lampada di calore per ~ 3 minuti di recupero, e poi pulire il sangue e tracce di colla utilizzando un preparato alcolico pad 70% before reintroducendo ai suoi fratellini. Prova a completare l'intera procedura chirurgica entro 10 minuti perché riducendo al minimo il tempo trascorso separato dalla madre migliora la sopravvivenza dei cuccioli dopo resezione apicale.
- Dopo ogni intervento chirurgico, collocare gli strumenti chirurgici in contatto con i talloni del tallone sterilizzatrice a caldo per circa 20 sec per sterilizzazione completa. Lasciare gli strumenti chirurgici per raffreddare a TI prima di ogni intervento chirurgico.
- Dopo aver completato interventi chirurgici per tutti i cuccioli in una cucciolata, mescolare i cuccioli con biancheria da letto e gli escrementi della madre prima di tornare al nido della madre.
NOTA: In genere, ICR / CD-1 topi sono madri adottive meglio di C57BL / 6, ma anche tra le madri che allattano di uno stesso background genetico, gli istinti che favoriscono variano. In caso di sostituzione di una madre che allatta è necessario per ridurre la mortalità materna entro cannibalizzazione, rimuovere i cuccioli P0 ad una madre che allatta e quindi eseguire la resezione apicale in P1. Solo eseguire sia l'operazione simulata o r apicaleesection in una cucciolata di cuccioli, perché mescolando finzione e cuccioli chirurgiche potrebbero diminuire il tasso di sopravvivenza del gruppo chirurgico di cuccioli 6.
Analisi 5. post-chirurgica
- Un giorno dopo l'intervento chirurgico, monitorare i cuccioli, garantire che non vi è alcuna differenza tra finzione e gruppi chirurgici, e contare il numero di cuccioli per misurare il tasso di sopravvivenza. Se gli interventi vengono eseguiti correttamente, i tassi di sopravvivenza dovrebbero essere simili e superiore al 60% sia finto e gruppi chirurgici.
- Isolamento Cuore e fissazione.
- Eutanasia i cuccioli a giorni 1 e 2 post-operatorio tramite decapitazione e il giorno 21 post-operatorio da CO2, con una garanzia di morte da dislocazione cervicale, quindi pulire il petto con un preparato alcolico del 70%.
- Incidere la pelle linea mediana e muscoli del torace e poi aprire il torace.
- Asportare l'intero cuori dalla cavità toracica e fissare l'intero cuore di ogni campione in 5 ml di 4% paraformaldeide O / N a RT.
- Il giorno successivo, trasferire i campioni al 70% di etanolo. I campioni possono essere conservati fino a una settimana prima della paraffina.
- Slice sezioni di paraffina a 5 micron di spessore attraverso l'intero ventricolo ed eseguire ematossilina standard ed eosina (H & E) e la colorazione tricromica di Masson per esaminare la risposta rigenerativa 5, 7. In particolare, H & E macchia è utilizzato per esaminare la sostituzione del muscolo e macchia tricromica di Masson è utilizzato esaminare le risposte fibrotiche 5.
- Selezionare l'area di interesse e creare almeno tre focolai per campione manualmente utilizzando uno scanner di diapositive. Immagine e analizzare i vetrini di colorazione a 40 × ingrandimenti secondo le istruzioni del produttore con i parametri di default.
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Risultati
Cuccioli di topo sono stati sacrificati 1, 2, e 21 giorni dopo la resezione-apicale, e il loro cuore sono stati raccolti per H & E e macchia Trichrome di Masson. Colore blu a macchia tricromica di Masson indica la deposizione di matrice extracellulare epicardico 5. Con successo resezione apicale, un coagulo di sangue è effettivamente formata per sigillare il LV uno giorno post-resezione apicale, come mostrato nella Figura 1A. Un graduale riassorbimento del coagulo di sang...
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Discussione
La rigenerazione cardiaca mostra un potenziale per il trattamento e la prevenzione dell'insufficienza cardiaca1, 2. I modelli animali sono indispensabili e svolgono un ruolo fondamentale nella comprensione di come avviene la rigenerazione cardiaca3-6. Molti anfibi e pesci rigenerano il tessuto cardiaco in risposta a una lesione, fornendo informazioni sulla nostra comprensione delle malattie cardiovascolari umane13, 14. In termini di evoluzione, tuttavia, la fisiopatologia dovrebbe essere ...
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Dichiarazioni
Spese di pubblicazione per questo articolo sono stati sponsorizzati da un dono da Strumenti Belle Science il dottor Jian Hou.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Drs. James Hawkins, Zu-Xi Yu e Xuan Qu dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) per la loro assistenza con la chirurgia del mouse e la preparazione e la colorazione delle sezioni di paraffina. Gli autori sono grati al NIH Fellows Comitato Editoriale per l'assistenza editoriale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Portaaghi Olsen-Hegar con forbici, 1,5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Forbici a molla Vannas - Tagliente da 2 mm | Fine Science Tools | 15000-03 | Forbici per iridectomia |
| Sterilizzatore per perline calde Fine | Science Tools | 18000-45 | |
| Pinze per iride, dritte, seghettate | Strumenti per le scienze fini | 11064-07 | |
| Pinze per iride, Curvo, seghettato | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Forbici da karitè - Curvo/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Pinze per legare suture con manico rotondo, Dritte | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Forbici a molla Vannas con manico rotondo | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Emostatico fine | Strumenti | per la scienza fine13007-12 | |
| Lampada d'ingrandimento | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Lampada riscaldante | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Suture in prolene | Ethicon | 8889H | |
| Colla per pelle-Adesivo per tessuti Vetbond | 3M | 1469 | |
| Applicatori sterili in cotone | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medio 2 STRATI, 200/SCATOLA, Saturo con il 70% di alcol isopropilico |
| Curity All Purpose Spugne | Covidien | 9024 | Non tessuto a 4 strati, 4"x4" (10,2 cm&volte; 10,2 cm) |
| Foglio di protezione da banco | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19,5" (45,72 cm x 49,53 cm) x 50 |
| 0,9% cloruro di sodio, 250 ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Soluzione Tamponi | Purdue Products LP | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | STERILIZZATORE A VAPORE AD ALTA PRESSIONE |
| Scanner per vetrini | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
