Articolo metodologico

Un neonatale mouse Spinal Cord Injury compressione Modello

DOI:

10.3791/53498

⸱

27 marzo 2016

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research, Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo descrive un metodo per generare una lesione da compressione del midollo spinale (SCI) riproducibile nel topo neonatale. Il modello fornisce una piattaforma vantaggiosa per lo studio dei meccanismi di plasticità adattativa che sono alla base del recupero funzionale spontaneo.

Abstract

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lesioni del midollo spinale (SCI) provoca in genere deficit neurologici devastanti, in particolare attraverso i danni alle fibre che discendono dal cervello al midollo spinale. Un importante attuale area di ricerca è focalizzata sui meccanismi di plasticità adattativa che sono alla base di recupero funzionale spontaneo o indotto dopo SCI. recupero funzionale spontanea è segnalato per essere più presto nella vita, sollevando domande interessanti su come i cambiamenti di plasticità adattativa come il midollo spinale si sviluppa. Per facilitare indagini di questa dinamica, abbiamo sviluppato un modello SCI nel topo neonatale. Il modello ha rilevanza per pediatrica SCI, che è troppo poco studiato. Perché plasticità neurale nell'adulto comporta alcuni degli stessi meccanismi come plasticità neurale nella vita in anticipo 1, questo modello potrebbe potenzialmente avere una certa rilevanza anche per l'adulto SCI. Qui si descrive l'intera procedura per la generazione di un infortunio riproducibile compressione del midollo spinale (SCC) nel topo neonatalecome già postnatale (P) giorno 1. SCC è ottenuto eseguendo una laminectomia ad un dato livello spinale (qui descritto a livelli toraciche 9-11) e quindi utilizzando una versione modificata Yasargil aneurisma mini-clip per comprimere e decomprimere rapidamente il midollo spinale . Come descritto in precedenza, i topi neonatale infortunato può essere testato per deficit comportamentali o sacrificato per ex vivo analisi fisiologica di connettività sinaptica utilizzando tecniche di registrazione ottica elettrofisiologici e high-throughput 1. Precedenti e in corso studi che utilizzano la valutazione comportamentale e fisiologica hanno dimostrato un drammatico, insufficienza acuta di arti posteriori motilità seguito da un recupero funzionale completo entro 2 settimane, e la prima prova di cambiamenti nella circuiteria funzionale a livello di identificate decrescente connessioni sinaptiche 1.

Introduzione

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Durante l'ultimo decennio, l'aumento delle prove ottenute da diversi modelli di lesione del midollo spinale (SCI) ha dimostrato che le reti spinali possono riorganizzarsi spontaneamente per contribuire al recupero funzionale1-9. Di conseguenza, la plasticità adattiva è diventata un argomento importante nella ricerca sulle lesioni del midollo spinale. È stato dimostrato che la plasticità comprende la ricrescita degli assoni risparmiati, la germinazione di nuovi collaterali assonici e la formazione di nuove connessioni sinaptiche. Gran parte di queste conoscenze sono state ottenute da studi comportamentali o anatomici su animali adulti. Un importante limite degli studi sul midollo spinale negli adulti è la difficoltà di eseguire una valutazione fisiologica ad alto rendimento, che è più facile nelle preparazioni neonatali1. Una delle principali differenze è che le preparazioni ex vivo wholemount del tronco encefalico adulto e del midollo spinale hanno una bassa vitalità. Un altro è che il tessuto spinale adulto è più opaco alla luce perché è più spesso e mielinizzato. Sebbene i recenti progressi nell'imaging in vivo (vedi ad esempio, 10-12) possano parzialmente superare questi problemi, la possibilità di eseguire l'imaging ad alto rendimento a qualsiasi profondità dorso-ventrale desiderata in più siti lungo una data preparazione del tronco encefalico-midollo spinale è attualmente fattibile solo nei neonati. Lo stato immaturo della mielinizzazione degli assoni nel midollo spinale neonatale facilita la registrazione ottica ex vivo ad alto rendimento, consentendo così una valutazione dinamica delle connessioni sinaptiche funzionali13-17. In combinazione con reporter di calcio geneticamente codificati e strumenti di stimolazione optogenetica e farmacologia, gli approcci ottici possono contribuire a una comprensione più profonda dei meccanismi alla base della plasticità adattativa.

Si stima che tra l'1 e il 10% di tutte le lesioni del midollo spinale colpiscano neonati e bambinidi età compresa tra 18 e 22 anni. A differenza della LM adulta, la patogenesi e il potenziale di guarigione spontanea nella LM pediatrica sono meno studiati. L'utilizzo di un modello di LM neonatale può quindi fornire maggiori informazioni sulla LM pediatrica e contribuire a una migliore comprensione dei meccanismi patogenetici e di recupero coinvolti. Inoltre, si ritiene che la plasticità post-LM a supporto del recupero funzionale nel midollo spinale adulto coinvolga almeno in parte gli stessi meccanismi che governano lo sviluppo del sistema nervoso centrale come la crescita degli assoni, la ramificazione e la formazione di nuovesinapsi 23-26. Pertanto, l'utilizzo di un modello di lesione spinale neonatale potrebbe fornire importanti informazioni sui meccanismi che sono operativi anche nel midollo spinale adulto, o che potrebbero potenzialmente essere reintegrati nel midollo spinale adulto (ad esempio mediante impianto di cellule o tessuti fetali o di tessuto costruito de novo da cellule staminali pluripotenti) per facilitare il recupero.

Il topo neonatale fornisce quindi una piattaforma per un approccio integrativo e multi-metodologico allo studio della plasticità adattativa a seguito di lesione del midollo spinale, in cui una combinazione di metodi comportamentali, fisiologici, anatomici, molecolari e genetici può essere prontamente impiegata. La definizione di modelli standardizzati di lesioni neonatali è un passo importante nell'implementazione di tali studi.

Protocollo

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Questo protocollo sperimentale è stato approvato dall'Autorità di ricerca animale nazionale in Norvegia (Forsøksdyrutvalget, locale numero sperimentale di approvazione 12,4591) nel rispetto della normativa dell'Unione europea la cura degli animali (Federazione Laboratorio Europeo Animal Science Association). Gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e le loro sofferenze. In questo articolo la procedura usata in postnatale (P) giorno 1 wild-type ICR (imprinting regione di controllo) topi (Jackson, Stati Uniti d'America) è descritto, ma lo stesso approccio può essere utilizzato anche nelle fasi successive.

1. Costruzione di un sistema anestesia gas per topi neonati (Figura 1)

  1. Costruire un naso-maschera dalla punta di una siringa. Collegate questo al 3-way rubinetto con tubi di plastica (Figura 1 - tubi rosso e Figura 2A1).
  2. Praticare un piccolo foro nel lato della maschera naso e collegarlo a tubi di plastica per rimuovere l'overflow del gas dalmaschera. Terminare la tubazione sia ad una pompa a vuoto per impostare una leggera pressione negativa, o in una cappa aspirante (Figura 1 - luminoso tubi verde).
  3. Effettuare una camera di anestesia da un x 25 mm di plastica capsula di Petri 150 mm (Figura 2A2).
    1. Da un lato, un foro abbastanza grande per accogliere la testa del mouse e la maschera nasale.
    2. Sul lato opposto, fare due fori più piccoli attraverso il quale possono essere inseriti i tubi di plastica da e verso la maschera nasale (Figura 1 - rosso e brillante tubi verde, rispettivamente).
    3. Effettuare un terzo foro sulla parte superiore del coperchio e collegare a questo un terzo tubo di plastica che termina alla pompa a vuoto (Figura 1 - tubo verde scuro). Lo scopo di questo terzo tubo è di assicurare che il gas in eccesso che non è stato catturato dal uscita dalla maschera nasale viene rimosso.
  4. Costruire una camera sonno praticando un foro nella parte inferiore di qualsiasi tipo di laboratorio piatto che è abbastanza grande da contain il mouse e ha un bordo liscio e perfino (l'apertura del piatto deve trovarsi a filo con la tabella per evitare perdite di gas). Collegare il foro nella camera al rubinetto a 3 vie con tubi di plastica (Figura 1 - tubo marrone). Posizionare la camera di dormire sotto una cappa aspirante.
  5. Collegare un rubinetto a 3 vie per il tubo di uscita dal vaporizzatore (Figura 1 - tubo giallo e Figura 2A3).
  6. Collegare l'ingresso del vaporizzatore per la fornitura di ossigeno (Figura 1 - tubo blu).

2. Modifica di un Yasargil temporanea aneurisma mini-clip per creare lo strumento di compressione (Figura 2 e Tabella 1)

  1. Fissare la clip con decisione per uno stand con un morsetto. Utilizzando una lente binoculare per un controllo visivo, limare la superficie esterna della punta di ciascuna pala clip per uno spessore finale di circa 150 micron utilizzando una mola montata su un trapano (Figura 2B e C).
  2. Effettuare un tappo per la clip tagliando un breve tratto di polietilene capillare tubo (Tabella 1) sotto un stereomicroscopio utilizzando un micro-lama (Tabella 1), e collocarlo su una delle lame (Figura 2A4 e le figure 2B e C). Questo impedisce la chiusura completa del clip e crea dimensioni standardizzate compressione. Quando il clip è chiuso la distanza interblade è di circa 230 micron. Fare un nuovo tappo per ogni esperimento come il polietilene può comprimere durante l'uso, che possano modificare lo spazio interblade.
    Nota: La tensione della molla del fermaglio diminuisce nel tempo in modo tale che dopo circa 80 compressioni clip non chiude completamente il tappo e deve essere sostituito.

3. Preparazione prima dell'intervento chirurgico

  1. Posizionare il mouse nella camera di sonno (figura 1) ed iniziare l'anestesia con isoflurano 4% (Figura 2A5 ) Vaporizzato in ossigeno puro, utilizzando un vaporizzatore (Figura 2A3 e Tabella 1).
  2. Testare il riflesso di ritiro del mouse pizzicando delicatamente la rete di pelle tra le dita dei piedi con un sottile pinza di plastica. Procedere con cautela come topi appena nati sono facilmente feriti. Stringendo i risultati troppo dure in lividi immediato. Esecuzione di questo test all'inizio della sedazione innesca il riflesso e fornisce una buona indicazione della quantità di forza necessaria.
  3. Una volta che il riflesso è abolita, rimuovere il mouse dalla camera di sonno e collocarlo in una posizione prona sul tavolo operatorio con il muso inserito nella maschera nasale che fornisce una alimentazione continua del 4% isoflurano mescolato con ossigeno puro (Figura 1). Assicurarsi che il pad riscaldamento è acceso e impostato a 37-38 ° C come l'ipotermia durante l'intervento chirurgico può essere fatale.
  4. Per raggiungere la completa analgesia, iniettare per via sottocutanea 50 ml di anestetico locale bupivacaina (2,5 mg / ml, Figura 2A6) nel sito chirurgico (negli esperimenti qui riportati, questo è a livello toracico (T) 9-T11). Utilizzare una siringa da insulina (300 ml, 30 g, Figura 2A7 e Tabella 1) per eseguire l'iniezione.
  5. Ridurre la concentrazione isoflurano consegnato alla maschera del naso al 1-2%.

4. Dorsale Laminectomia

  1. Eseguire un intervento chirurgico sotto controllo microscopico.
  2. Dopo aver pulito la zona intervento chirurgico con clorexidina gluconato (Tabella 1 # 19) per almeno 30 secondi, fare un 1-2 mm incisione cutanea trasversale a T9-T11 utilizza un microknife (Figura 2A8).
    Nota: In ICR topi neonati la parte rostrale dello stomaco, quando visibile contiene il latte, si trova ad affrontare i livelli vertebrali T12-T13 (figura 3). Un altro punto di riferimento è la parte rostrale dell'aggregato del tessuto adiposo sottocutaneo toracica che termina a circa T8-9. Questo punto di riferimento è visibile solo dopo incisione cutanea.
  3. Utilizzare una pinza (Figura 2A9 e A10) per allargare l'apertura della pelle in una direzione trasversale a 8-9 mm tirando delicatamente la pelle rostralmente e caudale (la pelle strappa facilmente, creando una ferita liscio e dritto). Questo fornisce accesso laterale sufficienti alla colonna vertebrale.
  4. Ritrarre i bordi della incisione cutanea dalle strutture sottostanti inserendo pezzi sterili emostatico spugna di gelatina (Figura 2A11 e Tabella 1) per via sottocutanea rostrale e caudale all'incisione. Questo allarga l'apertura e impedisce alla pelle di retrazione e oscurando l'area durante l'intervento chirurgico. La spugna di gelatina emostatica non deve essere impregnato in soluzione salina prima dell'uso.
  5. Per esporre la colonna vertebrale, sezionare i muscoli paravertebrali con le forbici sottili (Figura 2A12, e Tabella 1). Tagliare gli allegati dei muscoli alla colonna vertebrale e esporre la lamina (Figura 4A). None anche che in questa fase del processo di midollo è sottosviluppato.
  6. Identificare la linea mediana e tagliare trasversalmente tra le due lamine (che in questa fase è cartilaginea) con le forbici sottili (Figura 4B). Posizionare con cura una lama di una sottile pinza tra la lamina e la dura (Figura 4C), afferrare la lamina con la pinza e sollevarlo con cautela fino a quando un pezzo si stacca, lasciando la dura intatto (Figura 4D). Ripetere questa operazione 2-3 volte per ottenere una lunga laminectomia 1-2 segmento.
  7. Utilizzando le pinze sottili come rongeurs, rimuovere parti delle faccette articolari bilateralmente per guadagnare spazio sufficiente per posizionare il clip all'interno del canale vertebrale. Pulire l'area chirurgica e controllare il sanguinamento con piccoli pezzi di spugna di gelatina emostatico.

5. Spinal Cord Injury Compression

  1. Aprire il mini-clip da aneurisma modificato nel supporto della clip (Figura 2A13 e Figura 2B) e ° postoe lame su entrambi i lati del midollo spinale negli spazi tra la sfaccettatura unisce e il cavo. Assicurarsi che le lame sono inseriti abbastanza profondamente influenzare la parte ventrale del midollo spinale. Se questo non è possibile, rimuovere più delle faccette.
  2. Rilasciare il mini-clip rapidamente, tenendolo in posizione con il titolare clip per evitare che scivoli. Mantenere la compressione per 15 sec.
  3. Aprire il mini-clip rapidamente e rimuoverlo. Per ottenere una compressione simmetrica, invertire l'orientamento del mini-clip, e utilizzando il segno facilmente visibile da parte dell'edema emorragica dalla prima compressione come guida, riposizionare la clip nell'orientamento inverso per un secondo compressione 15 sec (previo esperimento ha dimostrato che questo genera deficit istologici e fisiologici simmetrici, mentre singoli compressioni non 1). La dura non deve essere danneggiato dalla compressione.
  4. Pulire la zona e mantenere l'emostasi con pezzi di spugna di gelatina emostatico.
  5. Rimuovere i pezzi di emostatico spugna di gelatina che sono stati collocati sotto i bordi della incisione cutanea all'inizio della chirurgia e chiudere l'incisione pelle con sterile 6.0 suture e porta ago (Figura 2A14 e 15).
  6. Iniettare sottocutanea 0,75 mg / kg di peso corporeo buprenorfina (Figura 2A16) diluito in PBS sterile utilizzando una siringa da insulina (300 ml, 30 G).

6. Cura postoperatoria

  1. Rimuovere il mouse dalla maschera del naso e metterlo in un set camera a temperatura controllata di 30 ° C fino a quando l'anestesia svanisce e il mouse diventa avviso (1-3 ore è in genere sufficiente).
  2. Iniettare Diazepam (Figura 2B17) intraperitoneale nella madre (8 g / kg di peso corporeo). Questo crea un torpore che diminuisce il rischio di cannibalismo durante la prima notte, quando questo rischio è più elevato.
  3. Ritorna il mouse operato per la lettiera.
  4. Se la lettiera è lARGE (> 12 cuccioli), rimuovere alcuni dei cuccioli non operati, preferenzialmente gli animali più grandi se differiscono per dimensioni, per ridurre la concorrenza per il latte. cura materna dei cuccioli operato è migliore nella linea di ICR se la dimensione cucciolata è di circa 9 cuccioli.
  5. Per la gestione del dolore, amministrare Buprenorfina (0,75 mg / kg di peso corporeo) per via sottocutanea una volta al giorno durante i primi giorni dopo l'intervento, utilizzando una siringa da insulina (300 ml, 30 G). Un volume adeguato per iniezione sottocutanea è di 30-50 ml. In neonatale vocalizzazione topi e agitazione sono buoni indicatori di dolore.
  6. Eseguire un esame quotidiano dei topi feriti utilizzando una scheda di valutazione per valutare la nutrizione, il peso corporeo, la disidratazione, il dolore, la guarigione delle ferite, ritenzione urinaria e lo stato di infezione. Secondo il punteggio ottenuto, fornire cura speciale, come iniezioni di soluzione sterile pediatrica nutrizione (Tabella 1 # 18) in caso di alimentazione anormale. La scheda di valutazione anche0; definisce criteri endpoint umani. Una madre che non rifiuta i cuccioli feriti è il migliore caregiver.
  7. Nel caso insolito di disfunzione della vescica, eseguire il massaggio alla vescica due volte al giorno fino al ripristino della funzione. Questo viene fatto mettendo il mouse in posizione supina in una mano e massaggiare il basso addome delicatamente in senso rostro-caudale con un dito.

Risultati

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Lesioni compressione del midollo spinale e perdita di funzione

Come descritto in precedenza, ottimizzando le procedure preoperatoria, chirurgiche e postoperatorie, un modello SCI compressione riproducibile nel topo neonatale può essere ottenuta 1. Il tappo di polietilene posto su una lama della clip (Figura 2B e C) previene la chiusura completa del clip e mantiene la distanza inter-lama costantemente a circa 230 micron. Invertendo l'orientamento della clip tra i due risultati compressioni in una lesione simmetrico, come giudicato da sequele istologica (Figura 5A e 1). Subito dopo la rimozione mini-clip, il tessuto del midollo spinale compresso diventa più scura a causa della contusione emorragica ed edema. L'osservazione di sezioni seriali del midollo spinale danneggiato colorate per Eosin e ematossilina già un giornolesioni opo rivela progressivo deterioramento del tessuto quando si avvicina all'epicentro della lesione (Figura 5A). La presenza di cavità intraspinali o di sangue nella lesione non è inusuale.

Valutazione del comportamento, ad esempio tracciando traiettorie arti posteriori sotto non-peso condizioni che portano un paio d'ore dopo l'intervento chirurgico, mostra un deterioramento drammatico di arti posteriori motilità nei topi SCC feriti rispetto ai topi di controllo farsa in cui viene eseguita solo una laminectomia (figura 5b e 1) . Questo test può essere ripetuto fino a quando il mouse è in grado di eseguire altri test comportamentali che richiedono recanti il proprio peso 1.

La mortalità e di recupero dopo l'intervento chirurgico

mortalità intraoperatoria è dovuto principalmente apnea e arresto cardiaco causato dall'elevata concentrazione di isoflurano necessario per raggiungere anesthesi sufficientiun. Introdurre l'anestetico locale Bupivacaine nel protocollo chirurgico consente la riduzione della concentrazione di isoflurano e diminuisce così notevolmente la mortalità. In una recente serie di esperimenti tra cui più di 20 animali, il tasso di mortalità intraoperatoria è stato pari a zero. Al contrario, la sopravvivenza post-operatoria è principalmente influenzata dalla accettazione dei topi operati dalla madre. Un miglioramento significativo si è verificato quando l'ansia e l'aggressività è stata ridotta, fornendo una singola iniezione di Diazepam (ip 8 g / kg di peso corporeo) alla madre prima di tornare i topi operati per la lettiera 1. Accettazione e recupero postoperatorio dei topi operati possono essere controllati dalla presenza di latte nello stomaco. Lo stomaco di un mouse P1-P7 che ha latte drunken è chiaramente bianca e visibile attraverso la pelle addominale (Figura 3). Confronto di alimentazione nel operato, il controllo sham e topi non operato è utile per valutare lo stato nutrizionale di ferired topi. Valutare la crescita di azionamento contro topi non operato dimostra che, nonostante una piccola perdita di peso durante il primo giorno post-operatorio, la curva di crescita dei topi operato normalizza rapidamente dopo (figura 6). La mortalità correlata a disfunzioni della vescica o l'infezione non è mai stata osservata anche nei topi studiati per finchè 7 settimane.

Numero in Fig. 2 Nome Produttore / Fornitore Riferimento # collegamento Commento
1 siringa di plastica (30 o 50 ml)
2 Plastica capsula di Petri (150 x 25 mm)
3 Fortec vaporizzatore isoflurano CypraNE http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Usiamo e vecchio apparecchio fuori produzione, controllare il link per nuovo dispositivo
4a Yasargil aneurisma temporanea mini-clip Aesculap FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4b Belle foro polietilene capillare tubi ID 0.58 mm, OD 0,96 mm Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5 Isoflurano (Forene) Abbott GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6 Marcain (bupivacaina) AstraZeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7 Insuline siringa da 0,3 ml 30 G x 8mm VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8 Belle Micro coltello tagliente Ultra 5 millimetri Strumenti per le scienze Belle 10.315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1
9 Extra pinza sottile Graefe - 0,5 millimetri Tip Strumenti per le scienze Belle 1153-1110 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1 		Non è davvero necessario, spesso i denti sono troppo grandi
10 Pinze SuperGrip dritto Strumenti per le scienze Belle 00.632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1 		Due pinze sono necessarie
11 Spongostan speciale 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
12 Vännäs Spring Scissors - 2 lame mm dritto Strumenti per le scienze Belle 15.000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1
13 Vario clip L'applicazione di forcipe Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14 Vicryl 6-; 0 (Ethicon) Johnson and Johnson J105G
15 porta aghi micro Diethrich 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16 Temgesic (buprenorfina) Schering-Plough
17 Stesolid (diazepam) Actavis Conosciuto anche come Valium
18 Pedamix Fresenius Kabi http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ernæring/parenteral-ernæring
19 Klorhexidinsprit (clorexidina gluconato) Fresenius Kabi D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

Tabella 1. Elenco degli strumenti e delle attrezzature per la generazione di una lesione del midollo spinale compressione clip-guidato in un topo neonatale.

Schema dell'apparecchio per anestesia con vaporizzatore di isoflurano, camera di sonno, maschera antigas, pompa a vuoto.
Figura 1. Schema di installazione di anestesia. Questo schema presenta la configurazione anestesia progettato per il mouse neonatale, con una camera di sonno per l'anestesia iniziale e un dispositivo maschera nasale per continuare l'anestesia durante l'intervento chirurgico.

Allestimento di apparecchiature chirurgiche per microchirurgia; include autoclave, pinze, microscopi; diagramma etichettato.
Figura 2. strumenti principali e clip di compressione. (A) Strumenti utilizzati durante la procedura. I numeri corrispondono l'annotazione utilizzato in Tabella 1. (B e C) Un aneurisma Yasargil temporanea mini-clip con la punta di ciascuna pala tagliato manualmente fino a circa 150 micron di spessore. Un tappo di una fetta di polietilene tubo (Tabella 1) è posto su una delle lame per prevenire la chiusura completa del clip. Barra di scala: 2 mm. App: Clip applicatore (# 12 in A); St:. Stopper Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Cuccioli di roditore, stomaco visibilmente pieno di latte, etichettati T12-13, diagramma di studio anatomico.
Figura 3. Luogo d'interesse per la valutazione preoperatoria del livello spinale in neonatale topo ICR. (A) Vista laterale di un mouse P1 ICR con il latte bianco nelle s tomach. La parte rostrale dello stomaco corrisponde a T12-T13 livello spinale. (B) del mouse P1 ICR sotto anestesia in posizione prona. Anche se più difficile da visualizzare che in (A), lo stomaco pieno di latte è riconoscibile. La parte rostrale dello stomaco indica T12-T13 livello spinale. Barre di scala: 0,5 cm.

Procedura chirurgica che mostra la rimozione della lamina in chirurgia spinale, diagramma etichettato.
Figura 4. dorsale laminectomia. (A) dissezione dei muscoli paravertebrali. Si noti che a questa età il processo spinale è poco sviluppato. (B) trasversale sezionamento della lamina con le forbici sottili. (C) introduzione di una lama di una sottile pinza tra la lamina e la dura. Il punto di ingresso è indicata dalla freccia. (D) rimozione della lamina. Barra di scala: 2 mm.

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Figura 5. istologica e risultati comportamentali dopo la lesione compressione del midollo spinale in P1. (A) Eosina e ematossilina colorazione nelle sezioni del midollo spinale da un mouse ferito (1 giorno dopo l'infortunio) a diversa distanza dall'epicentro infortunio. (B) tracce rappresentativi di arti anteriori e arti posteriori traiettorie osservato 6 ore dopo il trauma o dopo una laminectomia di controllo farsa. Tracce sulla sommità rappresentano traiettorie visti da una vista laterale dell'animale. Tracce in basso rappresentano le traiettorie viste dal punto di vista ventrale dell'animale. Vedi anche 1. barra della scala: 250 micron. DH: corno dorsale; L, a sinistra; R: right; SCC: compressione del midollo spinale; VH:. Corno ventrale Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

"Figura Figura 6. curve di crescita comparativi. Istogramma che mostra l'aumento di peso dei topi feriti non operato e SCC dal giorno postnatale 1 a postnatale giorno 9.

Discussione

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In questo articolo vengono descritte le procedure per un infortunio SCC clip-generato nei topi P1. Le stesse procedure possono essere eseguite anche in fasi successive. Lesioni di compressione sono stati eseguiti con successo a P5, P7, P9 e P12 (Züchner, et al., Manoscritto in preparazione). In tutte le fasi postnatali, anestesia generale si ottiene con isofluorano vaporizzato in ossigeno puro, ma il risultato anestetico dipende molto dall'età. In tentativi iniziali P1-P4, prima dell'anestesia locale è stata introdotta nel protocollo, era difficile ottenere una sedazione profonda e prolungata causa di una stretta finestra dose-effetto tra la sedazione e sovradosaggio insufficiente. Inoltre, le preoccupazioni legate ad un effetto neurotossico di isoflurano negli animali appena nati sono stati sollevati 27-30. Una combinazione di isoflurano ei locali risultati anestetico Bupivacaine in anestesia profonda e più stabile pur permettendo una riduzione della dose isoflurano di un fattore 2-3. Diversi tipi di anestheSIA sono stati descritti per i roditori neonatale, compresi cryoanesthesia 31,32, ma una potenziale inconveniente di cryoanesthesia è il suo effetto neuroprotettivo (recensito da 33,34), che potrebbero complicare la generazione di un infortunio efficiente e riproducibile. Anestesia barbiturico-based è considerato di avere una minore efficienza in topi neonati a causa di bassi livelli di albumina sierica e il grasso corporeo rispetto agli adulti 35,36.

Anche se piuttosto invasiva e traumatica, una volta che la procedura è stabilito il tasso di mortalità durante l'intervento chirurgico è bassa. Tuttavia, ci sono passaggi critici durante la procedura che richiedono particolare attenzione per migliorare il recupero e la sopravvivenza dei topi operati. Un problema importante è quello di selezionare i cuccioli che avranno le migliori possibilità di sopravvivere alla chirurgia. Quando la lettiera è grande lo stato nutrizionale dei singoli cuccioli varia. Oltre al sanguinamento inevitabile che si verifica durante l'intervento chirurgico, cuccioli operati trascorrono ores lontano dalla madre, e spesso non bere latte prima del mattino successivo. È quindi un vantaggio per selezionare cuccioli che hanno già una certa quantità di latte nello stomaco. Questo è facilmente visibile attraverso la pelle addominale da P0 a P7.

Durante la prima notte il cucciolo operato è a grande rischio di essere cannibalizzato dalla madre. Durante lo sviluppo iniziale di questo modello più della metà dei topi operati mancavano la mattina seguente, con evidenti segni di sangue nella gabbia. Necrophagy, cannibalismo e infanticidio nei roditori sono stati studiati per decenni 37-40. In questo studio, il cannibalismo è stato testimoniato solo una volta, ma era considerata una spiegazione più probabile rispetto necrophagy perché i cuccioli che sono stati restituiti alla gabbia erano tipicamente così in forma che la morte per cause naturali durante la notte sembrava improbabile. Da qui l'idea di utilizzare un agente farmacologico reversibili come Diazepam per ridurre l'ansia e aggressività in la madre (rivisto da 41). iniezione intraperitoneale di Diazepam notevolmente migliorato la situazione, lasciando cadere la mortalità durante la prima notte da oltre il 60% a meno del 20%.

La riduzione delle dimensioni dei cuccioli da abbattimento e disturbare la lettiera il meno possibile dopo il ritorno post-operatorio sono elementi aggiuntivi che possono beneficiare gli animali operati. Tuttavia, lasciando cuccioli funzionare solo con la madre non è vantaggioso. Il miglior equilibrio tra gestite / cuccioli non operati possono variare a seconda della linea, ma per i topi ICR e SCID-ICR lasciando 4-5 cuccioli gestite (lesione o sham) insieme con 3-4 cuccioli non operato ha dato i migliori risultati.

In senso generale, il principale limite di questo modello SCI neonatale è che il midollo spinale neonatale differisce in molti aspetti dal midollo spinale adulto, e quindi non può fornire risultati sperimentali che sono paragonabili a quelli ottenuti dai modelli SCI adulti. Tali differenze includono la dimensione complessiva eil volume del midollo spinale, numero di cellulare, sottorappresentazione di tipi cellulari specifici come oligodendrociti, le risposte immunitarie immature e circuiti neuronali immature. Le conclusioni tratte da esperimenti in questo modello devono pertanto essere considerati con attenzione. D'altra parte, il modello è rilevante per lo scenario relativamente meno investigato di pediatrica SCI. Inoltre, la debolezza apparente rispetto ai modelli SCI adulti è anche un potenziale di forza in quanto può consentire il chiarimento dei meccanismi di plasticità che, anche se in minima parte ancora esistente nel midollo spinale adulto, potrebbero rappresentare un substrato terapeutica se reintegrato. È concepibile che il ripristino di condizioni neonatali o anche embrionali potrebbe essere attuato attraverso l'impianto di cellule meno sviluppati o tessuti o da un trattamento con reagenti che generano il tessuto adulto con caratteristiche evolutive precedenti. Usando enzimi per eliminare reti perineuronali è un esempio di quest'ultimo approccio 42,43.

Un importante problema quando si stabilisce un modello animale per SCI è quello di ottenere un infortunio standardizzata. Questo è un aspetto importante che è stato affrontato in diversi modelli SCI, ad esempio, transezione, hemisection, martelli, compressione a palloncino, schiacciare pinze, la compressione peso statico, ecc Per quanto riguarda i dispositivi impatto, gli sforzi in questa direzione sono portato a modelli SCI in roditori adulti dove più parametri di impatto come la velocità, la forza e la durata possono essere manipolati (recensito da 44). Un altro approccio, coinvolgendo meno attrezzature, impiega una modifica del clip dell'aneurisma Kerr-Lougheed 45,46. Questi 2 approcci sono complementari in quanto dispositivo di simulazione imita un infortunio contusione mentre i imita clip di un infortunio alla compressione con un certo grado di ischemia concorrente. A causa dei vincoli sostanziali size e una maggiore vulnerabilità dei topi neonatali, la maggiore mortalità associata a interventi chirurgici più lunghi così come i costi di sviluppo attrezzature scala più piccola, si è scelto di sviluppare una compressione clip-generato, piuttosto che un approccio contusione d'urto generate. Ciò è stato realizzato adattando un aneurisma mini-clip disponibile in commercio per adattarsi alle dimensioni della colonna vertebrale di topi neonati 1. Aggiunta di un tappo garantisce una larghezza di compressione standard, e fintanto che la tensione del clip comprime al limite del tappo, la forza di compressione durante la fase statica alla larghezza minima dovrebbe variare poco. Ciò che non è standardizzato è la velocità di compressione durante la fase dinamica, poiché questa varia al variare della clip tensione durante la sua vita. Poiché la fase statica della compressione dura molto più lungo della fase dinamica, e c'è poco da suggerire che il tessuto del midollo spinale esercita più di una controforza contro le pale mini-etere, è probabile che la gravità delle lesioni è più dipendente fase statica. Questo, tuttavia, rimane da testare. feritagravità possa dipendere da fattori diversi, tra cui la forza statica di compressione e durata, la velocità di compressione e decompressione, la posizione del mini-clip, ed il numero di compressioni eseguite nello stesso sito. Così, la variazione combinatoria in questi parametri potrebbe causare la generazione di uno spettro di gravità lesioni da debole a grave. Nonostante il potenziale di variabilità, nel nostro studio precedentemente pubblicato 1 abbiamo ottenuto risultati coerenti a istologico, livelli fisiologici e comportamentali, quindi c'è poco da suggerire che la standardizzazione accettabile è difficile da raggiungere. Notiamo che in questo studio abbiamo utilizzato più metodi di validazione a ciascun livello, inclusi test comportamentali come aria passo, come mostrato in Figura 5.

In questo modello SCI neonatale l'infortunio non risparmia una certa proporzione di assoni e, quindi, fornisce una situazione favorevole per suscitare la plasticità adattativa attraverso la ri-modeling di connessioni risparmiato e la formazione di nuovi circuiti. Inoltre, poiché il mouse neonatale è adatto per le indagini da molti metodi sperimentali, è possibile usare questo modello per studiare il recupero funzionale e la plasticità adattativa con un approccio integrato, inclusi test comportamentali, retrograda e anterograda tracing assonale, immunoistochimica, elettrofisiologia e alta registrazione ottica -throughput 1. A titolo di esempio, abbiamo approfittato di questo approccio integrativo per dimostrare la rete di ri-modellazione a livello di ingressi Discendente specifici utilizzando l'imaging di calcio ad alto rendimento in ex vivo preparati wholemount del tronco cerebrale e del midollo spinale danneggiato 1. Questo può essere spinto ulteriormente utilizzando strumenti di neuro-optogenetic e farmacologia optogenetic per valutare il rimodellamento delle connessioni sinaptiche tra sottopopolazioni specifici di neuroni spinali.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Autorità sanitaria regionale della Norvegia sud-orientale (JLB, 2014119; JCG, numeri di progetto 2015045 e 2012065), dal Consiglio norvegese delle ricerche (JCG, numero di progetto 23 00 00) e dall'Università di Oslo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa in plastica (30 o 50  ml)
Piastra di Petri in plastica (150 x 25  mm)
Fortec isoflurano vaporizzatoreCypraneUsiamo un vecchio dispositivo fuori produzione, controllare il link per il dispositivo più recente
Yasargil aneurisma temporaneo mini-clipÆ sculapFE681K
Tubo in polietilene a foro fine ID 0,58  mm, diametro esterno 0,96  mmSmiths Medical800/100/200
Isoflurano (Forene)Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacaina)AstraZeneca
Insulina seyringe 0.3  ml 30  G x 8  mmVWR80086-442
Micro coltello ultra fine 5  mm taglienteFine Science Tools10315-12
Extra Fine Graefe Forcipe - 0.5  mm PuntaFine Science Tools1153-10Non è realmente necessario, spesso i denti sono troppo grandi
Pinze SuperGrip DrittoFine Science Tools00632-11Sono necessarie due pinze
Spongostan Special 70 x 50 x 1  mmFerrosan
Vannas – 2  mm Lame DritteFine Science Tools15000-03
Vario Clip Applicazione PinzeAesculapFE502T
Vicryl 6– 0 (Ethicon)Johnson and JohnsonJ105G
Diethrich micro porta11-510-20
Temgesic (buprenorfina)Schering-Plough
Stesolid (diazepam)ActavisConosciuto anche come Valium
PedamixFresenius Kabi
Klorhexidinsprit (clorexidina gluconato)Fresenius KabiD08A C02
Forbici a molla aghi

Riferimenti

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