Questo protocollo utilizza l'elettroporazione per introdurre ed esprimere proteine marcate in fluorescenza nelle fibre muscolari del topo. Dopo il recupero dopo l'elettroporazione, le fibre vengono isolate. Le singole fibre vengono quindi visualizzate utilizzando la microscopia confocale ad alta risoluzione per visualizzare la struttura muscolare.
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Articolo metodologico
Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il muscolo maturo ha una struttura unica che è suscettibile di imaging di cellule vive. In questo articolo, descriviamo il protocollo sperimentale per l'espressione di proteine marcate in fluorescenza nel muscolo flessore breve delle dita (FDB). Le condizioni sono state ottimizzate per fornire un gran numero di miofibre di alta qualità che esprimono il plasmide elettroporato, riducendo al minimo il danno muscolare. Il metodo impiega tag fluorescenti su varie proteine. La combinazione di questo metodo di espressione con la microscopia confocale ad alta risoluzione consente l'imaging di cellule vive, compreso l'imaging dopo un danno indotto dal laser. I coloranti fluorescenti combinati con l'imaging di proteine marcate in fluorescenza forniscono informazioni sulla struttura di base del muscolo e sulla sua risposta agli stimoli.
Introduzione
Miofibre individuali sono grandi, le cellule sinciziale altamente organizzati. Ci sono alcuni modelli di coltura cellulare per il muscolo; tuttavia, questi modelli hanno come principale limitazione che non fanno differenza completamente in fibre muscolari mature. Ad esempio, le linee cellulari C2C12 e L6 sono derivati da topi e ratti, rispettivamente 1-4. In condizioni di deprivazione di siero, i mononucleari cellule "mioblasti-like" cessano proliferazione, subiscono il ritiro del ciclo cellulare, ed entrano nel programma miogenico che formano le cellule multinucleate con sarcomeri, indicati come miotubi. Con condizioni di coltura prolungata, miotubi possono esibire proprietà contrattili e "contrazione", nella cultura. Linee cellulari umane hanno ormai stati istituiti 5. In aggiunta a queste linee cellulari immortalizzate, mioblasti mononucleate possono essere isolate dal muscolo e sotto le condizioni simili di deprivazione di siero formeranno miotubi. Queste linee cellulari e colture di mioblasti primari sono altamente usoFul perché possono essere trasfettate con plasmidi o trasdotte con virus e usate per studiare processi biologici cellulari di base. Tuttavia, queste cellule, anche se indotto a formare miotubi, mancano molte delle caratteristiche salienti di organizzazione muscolo maturo. In particolare, miotubi sono molto più piccoli singole fibre muscolari mature e non hanno la forma normale di miofibre. Criticamente, miotubi mancano trasversali (T-) tubuli, la rete membranosa richiesta per il rilascio del Ca 2+ efficiente in tutto il mioplasma.
Un metodo alternativo per mioblasti primaria o linee cellulari miogeniche comporta usando fibre muscolari mature. Transgenesi può essere impiegato per stabilire espressione delle proteine tag, ma questo metodo è costoso e richiede tempo. In vivo elettroporazione di muscoli del mouse è emerso come un metodo preferito per la sua velocità e affidabilità 6-10.
Metodi per elettroporazione in vivo e l'isolamento efficace di miofibre have stato ottimizzato per il mouse flessore brevis (FDB) muscolare 6. I metodi possono essere completate rapidamente e sono minimamente invasiva per indurre espressione vivo da plasmidi. Questo approccio è ora combinata con metodi di imaging ad alta risoluzione tra cui l'imaging dopo interruzione del laser del 6,7 sarcolemma. La combinazione di coloranti fluorescenti e espressione di proteine marcate fluorescenza può essere utilizzata per monitorare cellulari processi biologici miofibre mature.
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Protocollo
I metodi in questo studio sono stati eseguiti in conformità con l'etica Feinberg School of Medicine della Northwestern University Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) le linee guida approvate. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze.
Procedura sperimentale 1. per elettroporazione in vivo del flessore Brevis (FDB) Muscle Bundle in mouse
- Plasmidi di progettazione per l'espressione in vivo utilizzando un promotore saputo esprimere in cellule di mammifero (ad esempio, citomegalovirus, CMV) o nel muscolo (ad esempio, Muscolo Creatina chinasi, MCK) 6,7. Plasmidi più grandi possono esprimere a livelli inferiori. Il promotore CMV è stato ampiamente utilizzato 6,7.
- Purificare plasmidi da E. coli utilizzando condizioni di libero endotossine le istruzioni del produttore. Sciogliere il plasmide in sterili, endotossine tampone TE libero a 2-5 mg plasmide / ml.
- Diluire e un'aliquota il plasmide di una concentration di 20 mg di DNA in 10 ml di endotossine sterile libero TE (2 mg / mL) tampone per iniezione in una provetta sterile. Preparare un'aliquota per iniezione.
- Diluire lo stock di ialuronidasi a 1x con sterile tampone fosfato senza calcio e magnesio (PBS - / -), dando una concentrazione finale di 8 unità. Aliquota 10 ml di ialuronidasi diluito per iniezione in una provetta sterile.
- Anestetizzare il mouse utilizzando 2,5% isoflurano fino sedato e non risponde per la coda o pizzicare punta. Posto l'animale in posizione supina su una piastra elettrica o una tabella di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea normale.
- Pulire la zampa del mouse con un programma alternato di uno scrub povidone iodio e alcol tre volte utilizzando una tecnica di preparazione proveniente dal sito di ago e irradia verso l'esterno. Questa tecnica mantiene il sito ago in una condizione asettica, minimizzando introduzione patogeno.
- Iniettare zampa di the mouse con 10 microlitri della soluzione 1x ialuronidasi (2 mg / ml = 8 unità) tra la pelle e il muscolo utilizzando una siringa sterile da 1 ml. Ialuronidasi digerisce componenti della matrice extracellulare per permettere l'ingresso più efficiente del plasmide in miofibre. Invio alla base del tallone e far avanzare l'ago verso le dita. Rilasciare lentamente il liquido mentre l'ago viene retratto. Il sito di iniezione sotto la pelle si espanderà e inizia a diventare rosa.
- Ripetere i punti 1.6 e 1.7 sul piede controlaterale.
- Scollegare il anestesia e posizionare il mouse avanti nella gabbia. Lasciare che il mouse per riprendersi completamente dall'anestesia.
- Attendere 2 ore.
- Ripetere le procedure di sterilizzazione e anestetizzante piede, punti 1.5 e 1.6.
- Iniettare il DNA plasmidico diluita nella zampa nello stesso modo come la ialuronidasi. Assicurarsi che il volume massimo è di 20 ml o meno. Per l'espressione dual plasmide iniettare 20 ug di ciascun plasmide con un volume massimo di 20 &# 181; l o meno.
- Ripetere l'iniezione plasmide sulla zampa controlaterale o utilizzare il piede controlaterale per le iniezioni di controllo.
- Sul piede che è stato inizialmente iniettato, sollevare la pelle dal muscolo sottolineare con pinza sottile e mettere un ago 27 G attraverso le sfere di pelle vicino le dita in posizione perpendicolare alla linea di guarire-punta del piede. Prendete un secondo sterili 27 ago G e posizionarlo in orizzontale attraverso la pelle sul tallone. Inserire aghi paralleli tra loro ~ 1 cm di distanza.
- Utilizzando i morsetti a coccodrillo, elettrodi morsetto agli aghi paralleli assicurandosi gli aghi non siano a contatto tra loro. L'uso della modellazione argilla può garantire i morsetti in posizione.
- Collegare gli elettrodi di uno stimolatore elettrico.
- Elettroporazione il muscolo applicando 20 impulsi, 20 msec di durata / ciascuno, a 1 Hz, 100 V / cm. Le dita possono contrarsi con la stimolazione.
- Ripetere la procedura di stimolazione sul piede controlaterale, se necessario.
- Rimuovere gli aghi. Pulire la zampa con iodio povidone macchia.
- Spegnere l'anestesia. Ritorna il mouse per la gabbia di recupero e monitorare l'attività. Se la procedura è stata condotta come previsto, l'animale deve riprendere il normale deambulazione entro 30 minuti e mostra alcuna differenza di deambulazione o un'attività livello dal comportamento pre-iniezione. Pertanto, sono necessari analgesici post-procedura. Il recupero, rispedire l'animale verso il vivaio.
Nota: l'espressione della proteina può essere saggiato fin da 48 ore dopo l'elettroporazione. Tuttavia, per consentire il recupero più completo dopo l'elettroporazione, noi preferiamo l'isolamento e lo studio di miofibre 7 - 14 giorni dopo l'elettroporazione 10. Espressione può essere saggiato fintanto 4 settimane dopo l'elettroporazione.
Procedura sperimentale per 2. Isolamento delle flessore Brevis (FDB) Fibre
- Collagenasi disgelo. Per ogni pacchetto FDB allestire due pozzetti in una piastra di coltura tissutale 12-bene. In un bene aggiungere 1 ml di pre-riscaldato Modified Eagles media Dulbecco più Bovine Serum Albumin (DMEM + BSA) e nell'altra ben aggiungere 1 ml di pre-riscaldato soluzione Ringer. Inoltre, aggiungere freschi 10 ml di soluzione 1x Ringers ai 35 mm Sylgard piatto.
- Sacrifica l'animale attraverso CO 2 o inalazione di gas anestetico, seguita da dislocazione cervicale o un altro metodo per assicurare la morte.
- Rimuovere le zampe posteriori sopra la caviglia con una lama di rasoio pulito e immergere in soluzione 1x Ringers nei 35 mm Sylgard piatto.
- Pin un piede stretto, unico rivolto verso l'alto, sul piatto Sylgard con 30 aghi da G a ciascuna delle punte 5 punta e alla caviglia.
- Partendo alla caviglia, tagliare la pelle verso l'alto il lato del piede lungo l'attaccatura dei capelli verso le dita dei piedi, attenzione a non intaccare il muscolo sotto la pelle. Ripetere sull'altro lato del piede.
- Tenendo la pelle alla base della caviglia con una pinza sottile, tagliare la pelle attraverso il tallone.
- Sollevamento la pellepatta con una pinza, puntare le forbici verso la pelle per non nick il muscolo. Tagliare il tessuto connettivo sottostante, rimuovere efficacemente la pelle.
- Per rimuovere il fascio muscolare FDB tagliare il grande tendine del tallone per liberare il tendine dall'osso. Tenendo il tendine con una pinza, sezionare il fascio FDB dal grande tendine bianco rimuovere accuratamente qualsiasi tessuto connettivo attaccato al FDB con le forbici. Se fatto correttamente il bundle sarà facile sollevare dei tendini sottostanti rivelano tendini bianchi brillanti che portano alle singole cifre. Tagliare la FDB ai tendini vicino le dita liberando il fascio dal piede.
- Posizionare l'intero fascio muscolare nel pozzo contenente DMEM + BSA.
- Ripetere sul piede controlaterale.
- Una volta che tutti i muscoli FDB sono isolate, aggiungere 100 ml di collagenasi in ciascun pozzetto contenente DMEM + BSA e muscoli.
- Controllare il successo di elettroporazione con un microscopio a fluorescenza invertito prima della digestione. Se properl fattoy, verso l'alto di 90% efficienza di trasfezione possono essere raggiunti.
- Incubare la piastra in una umidificata, 37 ° C incubatore a 10% CO 2 per circa 1 ora. Il tempo di incubazione può variare a seconda del modello di malattia e lo sfondo e la sorte di collagenasi.
- Dopo 1 ora, trasferire accuratamente il fascio FDB al pozzetto contenente unica soluzione di Ringer.
- Triturare il fascio FDB nel pozzo con la soluzione Ringers con una pipetta 1 ml. Tagliare la fine della punta della pipetta con una lama di rasoio pulito in modo che il pacchetto può passare facilmente attraverso la punta della pipetta. Triturare delicatamente il muscolo (~ 15 volte) permettendo al fascio di passare su e giù parallelamente alla punta. Fibre intatte cadranno nella soluzione Ringers. Quando le fibre non facilmente cadere il fagotto, posizionare il muscolo posteriore in soluzione di collagenasi.
- Piastra le fibre isolate sul piatto ~ 500 microlitri per piastra.
- Lasciare il muscolo per digerire nel pozzo per 15 min.
- Ripetere i punti 2.152.17 fino a fascio diminuisce dimensioni e la maggior parte delle fibre sono dissociato dal fascio (di solito un totale di 2-3 volte). Una volta dissociato il muscolo passa facilmente attraverso un puntale 1 ml.
- Lasciate che le fibre si attaccano al piatto per un minimo di 15 min. Soluzione fresca Ringers può essere aggiunta alla piastra per diluire collagenasi residuo o cambiata a seconda vincoli di tempo.
Nota: Le fibre sono ora pronti per l'imaging.
Procedura sperimentale 3. per la visualizzazione di laser-indotta danni della membrana utilizzando Microscopia confocale
- Fibre carico immediatamente prima di imaging con 300 ml di 2,5 micron FM 1-43 di FM 4-64 colorante in soluzione di Ringer. In generale, le fibre di immagine 15 minuti a 2 ore dopo l'isolamento. Tuttavia, le fibre possono essere esposte fino a 24 ore dopo l'isolamento.
- Porre la capsula fondo di vetro su un microscopio confocale equipaggiato con un laser UV e un obiettivo 60X / 63X.
- Individuare una fibra. Assicurarsi che la fibra è saldamente collegatoal piatto toccando la base del microscopio. Escludere le fibre che sono stati danneggiati nel processo di dissociazione. Le fibre danneggiate possono contenere blebs membrana, alti livelli di assorbimento di colorante FM, ricciolo o piegare intensamente.
- Per indurre danni membrana sulla fibra, posizionare il sarcolemma al centro della finestra di esposizione con un campo libero di nuclei. Focus sul sarcolemma utilizzando il canale FM tintura in modo tale che il sarcolemma è estremamente tagliente.
- Posizionare i capelli ROI croce sul sarcolemma utilizzando il canale FM 4-64.
- Irradiare un punto di 1 pixel alla potenza di 80% per 3 secondi (~ 350 nm x 350 zona nm). Colorante FM entrerà nella cella nel sito di lesione. Potenza e ora possono essere modificate per aumentare o diminuire l'area di insulto.
- Cattura immagini della fibra prima danni, al momento del danno, ogni post-danni 2 sec, quindi ogni 10 sec per 5 min. Timing può essere regolata a seconda delle necessità. Le singole immagini possono essere convertite in filmati time-lapse in Image J.
- Ripetere i passaggi3.3 attraverso 3.7 su un massimo di 3 fibre per piatto.
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Risultati
Elettroporazione è una tecnica minimamente invasiva che introduce efficacemente purificato plasmide DNA nel flessore brevis (FDB) fascio muscolare (Figura 1A). Sette giorni dopo la transfezione fluorescently proteina tag viene visualizzato nella miofibre isolate (Figura 1B). Fibre isolate sono poi placcati e preparate per l'imaging su un microscopio confocale. Le fibre possono essere sottoposti a lesione indotta da laser. Colorante FM può essere util...
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Discussione
L'utilizzo di elettroporazione per studiare le proteine fluorescenti tag in vivo è ideale per lo studio del muscolo in assenza di opportuni modelli di linee cellulari che riproducono fedelmente l'intera struttura cellulare del muscolo. Questo protocollo descrive l'utilizzo di elettroporazione e ad alta risoluzione microscopia confocale a fornire immagini dettagliate di localizzazione delle proteine e la traslocazione dopo ferimento laser. Questo metodo può essere adattato per studiare altri proc...
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede NS047726, NS072027, e AR052646.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | Terreni di dissezione Diluizione: 50 ml +100 g |
| di collagenasi BSA, tipo II | Life Technologies | 17101-015 | Digestione delle fibre Diluizione: 160 mg / 4 ml DMEM (aliquota stock 40 mg/ml) |
| Piastre Falcon a 12 pozzetti | Fisher | Scientific 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Diluizione e imaging delle fibre: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O | ||
| 1 ml Pipette | Axygen | T-1000-C-R | Digestione |
| Lamette da barba | Personna | 94-120-71 | Digestione |
| Precision Glide 30 G ago | BD Biosciences | 305128 | Dissezione |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissezione |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | dissezione |
| FST di Dumont | #5/45 | per dissezione | |
| Roboz | RS-4913 | per dissezione | |
| World Precision Instruments | 500260 | Dissezione | |
| BSA | Sigma | A7906 | Terreni di dissezione Diluizione: 100 mg/50 ml DMEM |
| Falcon Piastre da 60 mm | Fisher Scientific | 08772B | Dissezione - utilizzato per contenere lo |
| elettroporazione | dell'argilla | ||
| Grass | s88x | elettroporazione | |
| Radio Shack | 270-356 | Elettroporazione | |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Elettroporazione |
| Precision Glide 27 G ago | BD Biosciences | 305136 | Simulatore di elettroporazione |
| Grass | SIU-V | elettroporazione | |
| Covidien | 2146 | Elettroporazione | |
| Ialuronidasi | Sigma | H4272 | Iniezione Diluizione: aggiungere 160 ul PBS (1x) a 40 µ l 5x |
| stock 1 cc Siringa da insulina U-100 (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Iniezione |
| di provette Eppendorf | Fisher Scientific | 02-682-550 | Iniezione |
| 35 mm fondo in vetro Piastra per micropozzetti | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopia |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopia Diluizione: Finale 2,5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | < br/> Diluizione: Maxi Kit Plasmidico Finale 2,5 ug/ml |
| Endotossine | Qiagen | 12362 | Purificazione Plasmidico |
Riferimenti
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34(2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306(2014).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
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