Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

Sakthi D. Moorthy; Jennifer A. Mitchell

doi:10.3791/53552

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Articolo metodologico

Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

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DOI:

10.3791/53552

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2 aprile 2016

Sakthi D. Moorthy¹ , Jennifer A. Mitchell¹

¹Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

In questo articolo

Sommario

La convalida sperimentale dell'attività dell'enhancer è meglio affrontata dall'analisi della perdita di funzione. Viene presentato un protocollo efficiente che utilizza la delezione mediata da CRISPR/Cas9 per studiare la regolazione allele-specifica della trascrizione genica nelle cellule ES F1 che contengono un genoma ibrido (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus).

Abstract

Gli enhancer controllano l'identità cellulare regolando l'espressione genica tessuto-specifica in modo indipendente dalla posizione e dall'orientamento. Questi potenziatori sono spesso localizzati distalmente dal gene regolato nelle regioni intergeniche o anche all'interno del corpo di un altro gene. La natura indipendente dalla posizione dell'attività dell'enhancer rende difficile abbinare gli enhancer con i geni che regolano. La delezione di una regione enhancer fornisce una prova diretta dell'attività dell'enhancer ed è il gold standard per rivelare il ruolo di un enhancer nella trascrizione genica endogena. I metodi convenzionali di delezione basati sulla ricombinazione omologa sono stati superati dai recenti progressi nella tecnologia di editing del genoma che consente modifiche rapide e localizzate con precisione ai genomi di numerosi organismi modello. L'editing genomico mediato da CRISPR/Cas9 può essere utilizzato per manipolare il genoma in molti tipi di cellule e organismi in modo rapido ed economico, grazie alla facilità con cui Cas9 può essere mirato al genoma da un RNA guida da un plasmide di espressione su misura. La delezione omozigote di elementi essenziali di regolazione genica potrebbe portare alla letalità o alterare il fenotipo cellulare, mentre la delezione monoallelica di potenziatori trascrizionali consente lo studio della cis-regolazione dell'espressione genica senza questo problema di confusione. Qui viene presentato un protocollo per la delezione mediata da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali (ES) di topo F1 (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus). La delezione, lo screening e l'analisi dell'espressione monoallelica sono facilitati dai polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) tra i due alleli che si verificano in media ogni 125 bp in queste cellule.

Introduzione

Elementi regolatori trascrizionali sono fondamentali per la messa a punto spazio-temporale dell'espressione genica durante lo sviluppo ¹ e la modifica di questi elementi può portare a malattia a causa di espressione genica aberranti ^2. Molte regioni associate alla malattia identificati da studi di associazione genome wide sono nelle regioni non codificanti e hanno caratteristiche di esaltatori trascrizionale ^3-4. Identificare esaltatori e abbinandoli con i geni che regolano è complicato in quanto sono spesso trovano diversi kilobases lontano dai geni che regolano e possono essere attivati in maniera tessuto-specifica ^5-6.