Vi presentiamo un metodo per isolare l'organo del Corti adulta come tre turni intatte cocleari (apice, il medio e basso). Abbiamo anche dimostrare una procedura per immunocolorazione con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio di cellule ciliate, cellule di supporto, e altri tipi di cellule trovato nella coclea.
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Articolo metodologico
Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'organo di Corti, alloggiato nella coclea dell'orecchio interno, contiene cellule ciliate meccanosensoriali e cellule di supporto circostanti che sono organizzate a forma di spirale e hanno un gradiente tonotopico per la rilevazione del suono. La coclea del topo è lunga circa 6 mm e spesso divisa in tre giri (apice, centro e base) per l'analisi. Per studiare la perdita cellulare, la divisione cellulare o l'espressione genica a mosaico, è utile l'intera montatura o la preparazione della superficie della coclea. Questo metodo di dissezione consente la visualizzazione di tutte le cellule all'interno dell'organo di Corti se combinato con l'immunocolorazione e la microscopia confocale per visualizzare le cellule su diversi piani dell'asse z. Da queste immagini z-stack è possibile ottenere anche più sezioni trasversali ottiche. Inoltre, il metodo di dissezione dell'intera montatura può essere utilizzato per la microscopia elettronica a scansione, sebbene sia necessario un metodo di fissazione diverso. Qui, presentiamo un metodo per isolare l'organo di Corti sotto forma di tre giri cocleari intatti (apice, medio e base). Questo metodo può essere utilizzato per topi di età compresa tra una settimana e l'età adulta e differisce dalla tecnica utilizzata per i campioni neonatali in cui la calcificazione della coclea è incompleta. Una versione leggermente modificata può essere utilizzata per la dissezione della coclea di ratto. Dimostriamo anche una procedura per l'immunocolorazione con anticorpi marcati in fluorescenza.
Introduzione
La coclea a forma di spirale dell'orecchio interno, contenuto all'interno l'osso temporale, ospita l'organo del Corti, l'organo sensoriale uditivo fine nei mammiferi. La coclea è tonotopically organizzato e comunemente suddivisa in apicale, centrale e basale giri corrispondente alle regioni di frequenze diverse con rilevamento del suono ad alta frequenza nella base e il rilevamento a bassa frequenza nel vertice 1. Le cellule cigliate, le cellule meccanosensoriali dell'organo di Corti, eseguire la lunghezza della coclea, della lunghezza di circa 6 mm in topi 2,3. Queste cellule convertono l'energia meccanica delle onde....
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Protocollo
Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali istituzionale e del Comitato uso alla Southern Illinois University School of Medicine.
1. Estrazione di temporali Ossa
- Identificare ossa temporali nella base del cranio del mouse 13 e raschiare via nervi cranici con pinze modello standard.
- Posizionare forcipe modello standard con la punta della capsula otica e con il pollice della mano opposta stampa verso il basso sul canale semicircolare posteriore per rimuovere la coclea incapsulato.
- Liberare la metà inferiore dell'osso temporale da....
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Risultati
Presentiamo un metodo per isolare l'organo del Corti come tre giri intatte cocleari (apice, medio e base) dal tessuto cocleare che è calcificata, con gradini dissezione chiave presentati in Figura 1. Durante la prima settimana postnatale dello sviluppo, calcificazione Mouse coclea è incompleta e più semplice metodo di dissezione 13 può essere utilizzato. Utilizzando l'intero metodo di dissezione monte neonatale con coclea da P7 e anziani topi risultati.......
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Discussione
Ci sono diversi passaggi critici per il successo dell'intero dissezione mount e immunocolorazione. Tuttavia prima di uno di questi metodi vengono eseguiti, è necessaria un'adeguata fissazione del tessuto cocleare. Si consiglia di utilizzare metanolo gratuito, ultra-pura, grado EM PFA. PFA ottenuta dalla polvere può avere tracce di metanolo e un pH instabile che diminuisce la qualità di immunofluorescenza. Altri gruppi hanno anche dimostrato che le dissezioni simili sono possibili utilizzando fissativi che .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte da una sovvenzione dell'Office of Naval Research (N000141310569). L'attrezzatura della Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility è stata supportata dal National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Le pinze standard | Fine Science Tools | 11000-12 | possono essere acquistate da altri fornitori |
| Forbici fini da 10,5 cm | Fine Science Tools | 14060-11 | possono essere acquistate da altri fornitori Provette |
| microcentrifuga da 2 ml | MidSci | AVSS2000 | possono essere acquistate da altri fornitori |
| 16% formaldeide, senza metanolo, ultra puro, grado EM | Polysciences | 18814 | TOSSICO --indossare guanti e non possono essere gettati nel lavandino. Può essere acquistato da altri fornitori. |
| PBS pH 7,4 | Sigma | P3813-10PAK | può essere acquistato da altri fornitori EDTA |
| Fisher | BP118-500 | può essere acquistato da altri fornitori rotatore | |
| per tubi end-over-end | Fisher | 05-450-127 | può essere acquistato da altri fornitori Piastra |
| di Petri da 60 mm | Fisher | 50-202-037 | può essere acquistata da altri fornitori |
| Kit incapsulante in silicone Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0,5 kg | |
| carbone attivo | Fisher | AC134372500 | può essere acquistato da altri fornitori |
| microscopio per dissezione stereo | Zeiss | Stemi 2000 | può essere acquistato da altri fornitori Dumont |
| #4 pinza da gioielliere | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 pinza da gioielliere | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forbici a molla Vannas da 2,5 mm | Fine Science Tools | 15001-08 | curve |
| Forbici a molla Vannas-Tubingen da 5 mm | Fine Science Tools | 15003-08 | diritte |
| a 48 pozzetti | Fisher | 08-772-52 | possono essere acquistate da altri fornitori |
| Vetrini per camera a 8 pozzetti Fisher | 1256518 | possono essere acquistati da altri fornitori Triton | |
| X-100 | Sigma | X100-500 | può essere acquistato da altri fornitori |
| BSA, frazione V | Fisher | BP1605 | può essere acquistato da altri fornitori |
| NGS | Vector labs | S-1000 | può essere acquistato da altri fornitori NHS |
| Vector labs | S-2000 | può essere acquistato da altri fornitori | |
| Rotatore 3D | Midsci | R3D-710 | può essere acquistato da altri fornitori |
| Scatola di incubazione Western blot XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | può essere acquistato da altri fornitori Supporti |
| montaggio antisbiadimento in oro Prolong | Life Technologies | P36930 | possono essere acquistati da altri fornitori, ma i supporti di montaggio variano nella loro capacità di proteggere dal fotosbiancamento |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | può essere acquistato da altri fornitori |
| vetrini coprioggetti 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | può essere acquistato da altri fornitori smalto |
| trasparente | Farmacia | può essere acquistato da altri fornitori cartella | |
| per vetrini in cartone | Fisher | 12-587-10 | può essere acquistato da altri fornitori scatola |
| per vetrini in plastica | Fisher | 03-448-10 | può essere acquistato da altri fornitori |
Riferimenti
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information process....
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Ristampe e permessi
