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Articolo metodologico

Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

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DOI:

10.3791/53570

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1 dicembre 2017

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1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è la forma più comune di malformazione dello sviluppo corticale (MCD) nell'età adulta, ma la base genetica rimane sconosciuta nei casi più sporadici. Recentemente abbiamo sviluppato una strategia per identificare nuovi geni candidati per MCDs e confermare direttamente loro ruolo causativo in vivo.

Abstract

Difetti di nascita che coinvolgono la corteccia cerebrale — conosciuto anche come malformazioni dello sviluppo corticale (MCD) — sono importanti cause di disabilità intellettiva e account per 20-40% dell'epilessia resistente alla droga nell'infanzia. Formazione immagine del cervello ad alta risoluzione ha facilitato l'identificazione in vivo di un grande gruppo di fenotipi MCD. Nonostante gli avanzamenti nella formazione immagine del cervello, analisi genomica e generazione di modelli animali, un semplice flusso di lavoro sistematicamente la priorità geni candidati e per testare gli effetti funzionali delle mutazioni putative è manca. Per ovviare a questo problema, una strategia sperimentale che consentano l'identificazione di nuovi geni causativi per MCD è stata sviluppata e validata. Questa strategia si basa sulla identificazione candidato regioni genomiche o geni mediante array-CGH o intero-dell'esoma sequenziamento e caratterizzare gli effetti della loro inattivazione o della sovraespressione di mutazioni specifiche nel roditore cervelli via in utero di sviluppo elettroporazione. Questo approccio ha portato all'identificazione del gene C6orf70 , che codifica per una proteina vescicolare, alla patogenesi di eterotopia nodulare periventricolare, un MCD causati da difetti di migrazione neuronali.

Introduzione

La corteccia cerebrale svolge un ruolo chiave nei processi cognitivi e intellettuali ed è coinvolta nella memoria come apprendimento e controllo emotivo. Pertanto, non è sorprendente che molte malattie neurologiche e psichiatriche derivano da malformazioni dello sviluppo corticale (MCD). L'eziologia di MCD è complesso poiché entrambi acquisito e fattori genetici sono coinvolti. La prevalenza cumulativa di geneticamente determinata proporzione di MCD è circa il 2% e sono nella maggior parte dei casi sporadici. Per esempio, l'incidenza di disgenesia cerebrale congenita è stata stimata per essere superiore all'1% nella popolazione umana, e alcune forme di MCD sono osservate in più del 14% di tutti i pazienti con epilessia e nel 40% di epilessia intrattabile o grave1, 2.

Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è uno della più comuni MCDs ed è causata da anomalie della migrazione dei neuroni dalla zona ventricolare (VZ) alla corteccia cerebrale in via di sviluppo. Il fallimento dei neuroni per migrare i risultati in gruppi di neuroni heterotopic lungo le pareti dei ventricoli laterali che di solito possono essere visualizzati usando la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI). Le caratteristiche cliniche, anatomiche e imaging dell'EPN sono eterogenee. I noduli possono variare da piccole e unilaterale bilaterale e simmetrica. Conseguenze cliniche comuni includono l'epilessia e intellettuale disabilità3. Le mutazioni nel gene Della filamina A (o FLNA), che associa in Xq28, sono state trovate nel 100% delle famiglie con EPN bilaterale X-collegato e nel 26% dei pazienti sporadici3,4. Una rara forma recessiva di PNH causata da mutazioni nel gene ARFGEF2 , che associa in 20q13, è stata segnalata in due famiglie consanguinee5. Recentemente, sono state identificate mutazioni bialleliche nei geni che codificano la coppia di cadherin recettore-ligando DCHS1 e FAT4 in nove pazienti affetti da un disordine multisystemic che include PNH6. PNH inoltre è stato associato con X fragile sindrome7, sindrome di Williams8, di sindrome da microdelezione 22q119, duplicazioni 5p1510, eliminazioni in 1 p 3611, 5q14.3-q1512, 6p2513 e 6q omissione terminale sindrome14,15,16,17,18,19, suggerendo che altri geni causativi sono sparsi in tutto il genoma. Tuttavia, per circa il 74% dei pazienti sporadici di PNH la base genetica rimane per essere delucidato17.

Mappatura genica classica si avvicina come matrice l'ibridazione Genomic comparativa (array-CGH) hanno dimostrato di essere un potenti strumenti per la rilevazione di anomalie cromosomiche submicroscopica, tuttavia, le regioni genomiche identificate utilizzando questo approccio sono spesso grandi e contengono numerosi geni.

L'avvento delle tecniche di sequenziamento massivo parallelo (cioè intero-esoma sequenziamento (WES) e Whole-Genome sequencing (WGS)) ha sostanzialmente ridotto sia il costo e il tempo necessario per un'intera dell'esoma umano o del genoma di sequenza. Tuttavia, l'interpretazione dei dati di WES e WGS rimane impegnativo nella maggioranza dei casi, poiché per varianti di ogni paziente decine di centinaia (o migliaia, a seconda del tipo di analisi) emergono dal filtraggio dei dati.

Per accelerare il processo di identificare nuovi geni causativi di MCD, una strategia sistematica romanzo combinando array-CGH, WES e nell'utero elettroporazione (IUE) screening di geni candidati è stato progettato. IUE permette di inattivare selettivamente (o dei overexpress) specifici geni o mutazioni nei cervelli del roditore, consentendo la rapida valutazione del loro coinvolgimento in corticogenesis18,19. RNAi mediata-atterramento o sovraespressione di uno o più geni candidati dovrebbe causare, quando il gene è associato con lo sviluppo della malattia, difetti localizzati nella migrazione neuronale e/o maturazione. Al momento l'identificazione di un gene di cui inattivazione (o sovraespressione) riproduce il fenotipo osservato nei pazienti in roditori, diventa un candidato eccezionale per lo screening in pazienti sporadici con MCD. Utilizzando questo approccio, abbiamo recentemente rivelato il contributo cruciale del gene C6orf70 (noto anche come ERMARD) nella patogenesi dell'EPN in pazienti che harbouring 6q27 delezioni cromosomiche16.

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Protocollo

Dichiarazione etica: Ratti Wistar erano accoppiati, mantenuti e utilizzati nelle strutture animale INMED, in accordo con la legislazione dell'Unione europea e francese.

1. DNA estrazione e quantificazione per Array-CGH e WES

  1. Estrarre il DNA genomico (gDNA) dai leucociti del sangue umano da pazienti che usando un robot automatico di isolamento del DNA o disponibili in commercio kit di estrazione del DNA manuale secondo il protocollo del produttore. Quantificare tutti i campioni usando uno spettrofotometro.

2. protocollo array-CGH

  1. Digestione di limitazione di gDNA
    1. Doppia digest 500 ng di gDNA purificato da un paziente e un controllo umano disponibile nel commercio del DNA con RsaI e AluI per 2 ore a 37 ° C. Utilizzare 0,5 μl di enzima U/μL 10 per ogni reazione. Incubare per 20 minuti a 65 ° C per inattivare gli enzimi e spostare le provette in ghiaccio.
  2. Esempio di etichettatura
    1. Aggiungere il volume appropriato di Random Primers necessario per il formato di microarray in uso a ciascuna provetta di reazione (ad es. 5 µ l per i microarrays 1-pack, confezione da 2 e 4-pack). Miscelare bene pipettando su e giù delicatamente.
    2. Trasferire un termociclatore provette. Incubare a 95 ° C per 3 min e poi a 4 ° C per 5 min.
    3. Preparare un cianina cianina 3 e un 5 etichettatura Master Mix su ghiaccio mescolando i seguenti volumi: 10.0 µ l 5 X tampone di reazione, 5,0 µ l 10 x dNTPs, 3,0 µ l cianina 3-dUTP o cianina 5-dUTP e 1,0 µ l Exo (-) enzima Klenow, 2.0 µ l Nuclease-Free Water. Scegliere il volume di ciascun reagente in base al formato di microarray in uso.
    4. Aggiungere il Mix Master etichettatura a ciascuna provetta di reazione contenente il gDNA. Miscelare bene pipettando delicatamente su e giù.
    5. Trasferire un termociclatore provette e incubare a 37 ° C per 2 h, 65 ° C per 10 min e poi mantenere i campioni a 4 ° C.
  3. Purificazione di gDNA etichettato
    1. Aggiungere 430 µ l di 1 x TE (pH 8.0) a ciascuna provetta di reazione.
    2. Inserire una colonna di purificazione in provette di raccolta da 2 mL ed etichettare correttamente le colonne. Ogni carico etichettati gDNA su una colonna di purificazione.
    3. Centrifugare per 10 min a 14.000 x g in una microcentrifuga a temperatura ambiente. Scartare il flusso continuo e posizionare la colonna indietro nel tubo di raccolta da 2 ml.
    4. Aggiungere 480 µ l di 1 x TE (pH 8.0) per ogni colonna. Centrifugare per 10 min a 14.000 x g in una microcentrifuga a temperatura ambiente. Scartare il flusso continuo.
    5. Invertire la colonna in un tubo di raccolta fresca 2 mL e centrifugare per 1 min a 1.000 x g in una microcentrifuga a temperatura ambiente per raccogliere il campione purificato.
    6. Portare il volume di campione a quello richiesto per il formato di microarray in uso utilizzando un concentratore o aggiungendo 1 x TE (pH 8.0). Ad esempio, per 1-pack microarray portare il volume a 80,5 µ l. Incubare il campione in ghiaccio per 5 minuti e quindi dispensare la soluzione su e giù per 10 volte.
  4. Preparazione di gDNA etichettato per ibridazione
    1. Combinare i campioni di prova e di riferimento utilizzando la cianina appropriato 5-etichettato campione e la cianina 3-etichettato campione in una provetta di fresco da 1,5 mL RNAsi-libera. Ad esempio, per microarray pack 1 Assicurarsi che il volume finale è 158 µ l. scegliere il volume di ogni campione in base al formato di microarray in uso.
    2. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare il rendimento, grado di etichettatura o specifiche attività misurando l'assorbanza a A260 nm (DNA), A550 nm (cianina 3) e A650 nm (cianina 5).
      1. Calcola rendimento utilizzando la formula: [DNA concentration(ng/µl) x volume di campione (µ l)] / 1.000 (ng / µ g). Calcolare l'attività specifiche utilizzando la formula: pmol per µ l di colorante / µ g / µ l di gDNA.
        Nota: ad esempio, 0,5 µ g di DNA di input, il rendimento dovrebbe essere 8 a 11 µ g e l'attività specifica (pmol / µ g) dovrebbe essere 25 a 40 per la cianina-3 etichettato campione e da 20 a 35 per l'esempio etichettato cianina-5.
    3. Per preparare la quantità di ibridazione Master Mix necessario per il formato di microarray in uso, mescolare i seguenti reagenti: 50 µ l DNA Cot-1 (1,0 mg/ml), 52 µ l 10 x aCGH agente bloccante e 260 µ l 2 x HI-RPM tampone di ibridazione.
    4. Aggiungere il volume appropriato di ibridazione Master Mix alla provetta da 1,5 ml RNAsi-libera che contiene il gDNA etichettato per ottenere il volume totale richiesto per il formato di microarray in uso. Ad esempio, per 1 confezione microarray, assicurarsi che il volume finale per ogni reazione è µ l 362.
    5. Mescolare il campione pipettando su e giù, poi rapidamente Centrifugare a 14.000 x g e incubare per 3 min a 95 ° C e a 37 ° C per 30 min.
  5. Assemblea di Chambers e ibridazione
    1. Caricare una diapositiva di guarnizione pulito nella camera base con l'etichetta di guarnizione rivolto verso l'alto e allineato con la sezione rettangolare della camera base. Assicurarsi che la diapositiva di guarnizione è a filo con la base di alloggiamento e non è socchiusa.
    2. Dispensare miscela campione ibridazione sul pozzo guarnizione, assicurandosi che il campione sia distribuito uniformemente.
    3. Mettere una diapositiva di microarray sulla diapositiva di guarnizione per valutare che la coppia di panino sia allineata correttamente. Quindi, montare la camera di reazione, mettere il coperchio sulle diapositive sandwich e il morsetto di serraggio manuale.
    4. Garantire vetrini bagnare ruotando la camera montata verticalmente. Assicurarsi che le bolle non sono presenti in aula. Se necessario, toccare il montaggio su una superficie dura per spostare bolle stazionarie.
    5. Mettere gli alloggiamenti di scivolo montato in un rack di rotatore istituito per ruotare a 20 giri/min. Mettere la camera di ibridazione in un forno ed effettuare l'ibridazione a 65 ° C per 24 o 40 h in base al formato di microarray in uso.
  6. Lavaggio di microarray e scansione
    1. Prendere la camera di ibridazione fuori forno e immergerlo nel tampone di lavaggio 1. Procedere al suo smontaggio.
    2. Rimuovere il vetrino di microarray e rapidamente messo in un cestello per i vetrini in tampone di lavaggio 1 a temperatura ambiente.
    3. Lavare il vetrino di matrice per 5 minuti mescolando (utilizzare una pulce e un agitatore magnetico). Regolare la velocità dell'agitatore a un'impostazione di 4 (velocità media), per ottenere buoni ma non troppo vigorosa miscelazione.
    4. Lavare il vetrino di matrice nel tampone di lavaggio 2 per 90 agitazione di s. Recuperare delicatamente il vetrino dal buffer (dovrebbe emergere asciutto) e caricarlo in un portavetrini con l'ausilio di un protettore di diapositiva.
    5. Caricare la diapositiva nello scanner array ed eseguire la scansione in base alle istruzioni del produttore della matrice.
    6. Analizzare i risultati utilizzando il software di estrazione fornito con lo scanner in uso secondo le istruzioni del produttore (V.9.1.3.1).

3. WES protocollo

  1. Arricchimento di destinazione
    1. Utilizzare il dsDNA BR analisi per determinare la concentrazione del campione gDNA secondo il protocollo di strumento.
    2. Diluire 5 µ g di alta qualità doppio filamento del DNA con 1x basso TE in un tubo di bind basso 1,5 mL in un volume totale di 50 µ l.
    3. Impostare un sonicatore e mettere una microprovetta nella stazione di carico e scarico secondo le istruzioni del fabbricante. Tenere il tappo sul tubo.
    4. Trasferire lentamente il 50 µ l di campione di DNA attraverso i setti pre-splii senza introdurre bolle.
    5. Taglio del DNA secondo le impostazioni suggerite dal produttore di sonicatore e valutare la qualità utilizzando un Bioanalyzer secondo le istruzioni del fabbricante. La dimensione del frammento di DNA di destinazione è 150-200 bp.
  2. Riparazione del DNA si conclude
    1. Preparare la miscela di reazione di riparazione fine con 40 µ l di fine riparazione enzima Mix con 10 µ l di fine riparazione Oligo Mix. Mescolare bene su un Vortex.
    2. Incubare i campioni a 20 ° C per 30 min in un termociclatore e poi tenerli a 4 ° C. Non utilizzare un coperchio riscaldato.
    3. Aggiungere 50 µ l della miscela di reazione di riparazione fine preparata al punto 3.2.1 a ogni 50 µ l Tosato campione di DNA bene. Mescolare bene pipettando su e giù o delicato nel Vortex.
    4. Purificare il campione con un kit di purificazione di perline basati secondo il protocollo del produttore.
  3. Poliadenilazione di 3' estremità.
    1. Aggiungere 20 µ l di Master Mix dA-Tailing per ciascun campione di DNA purificato, fine-riparato (circa 20 µ l).
    2. Mescolare bene pipettando su e giù o delicato nel Vortex.
    3. Incubare i campioni a 37 ° C in un termociclatore e poi tenerlo a 4 ° C. Non utilizzare un coperchio riscaldato.
  4. Legatura della scheda indicizzazione di pre-acquisizione.
    1. Aggiungere 5 µ l di legatura Master Mix per ciascun campione di DNA A coda.
    2. Aggiungere 5 µ l della soluzione appropriata di indice pre-capture per ogni campione.
    3. Sigillare i pozzetti e mescolare nel Vortex per 5 s. brevemente Centrifugare i campioni.
    4. Incubare i campioni a 20 ° C per 15 min in un termociclatore e quindi tenere a 4 ° C. Non utilizzare un coperchio riscaldato.
    5. Purificare i campioni con un kit di purificazione di perline basati secondo il protocollo del produttore.
  5. Amplificazione della raccolta indicizzata.
    1. Preparare il volume appropriato di miscela di reazione PCR pre-capture con 1 µ l di Primer Mix e 25 µ l di PCR Master Mix. Mescolare bene su un Vortex.
    2. Combinare 26 µ l di miscela di amplificazione in pozzetti separati di una piastra PCR e 24 µ l di ciascun campione di libreria gDNA indicizzata.
    3. Eseguire un programma PCR con le seguenti operazioni: 98 ° C per 2 min, 5 cicli a 98 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min e un'estensione finale a 72 ° C per 10 min. tenere i campioni a 4 ° C.
    4. Purificare il campione con un kit di purificazione di perline basati secondo il protocollo del produttore.
    5. Valutare la qualità con un Bioanalyzer secondo il protocollo del produttore.
  6. Pool di campioni di DNA indicizzati per ibridazione
    1. Per ogni pool di reazione di cattura, combinare il volume appropriato di ciascun campione di libreria gDNA indicizzata in un pozzetto di una piastra PCR. Ad esempio, per umani o Mouse All-Exon Capture librerie, combinare 8 librerie per ogni pool utilizzando 187.5 ng di ogni raccolta indicizzata. Garantire che ogni pool di reazione di cattura finale contiene 1.500 ng di gDNA indicizzata.
    2. Ridurre il volume in ogni bene a < 7 µ l utilizzando un concentratore a vuoto. Evitare l'essiccazione completamente il campione.
    3. Aggiungere sufficiente acqua priva di nucleasi a ogni pool gDNA concentrato per portare il volume finale di ben 7 µ l e poi vortice la piastra che contiene gDNA vigorosamente per 30 s. centrifuga in una casella di selezione centrifuga o mini-piatto per raccogliere il liquido sul fondo dei pozzetti.
  7. Ibridazione delle piscine biblioteca gDNA alla libreria di catturare
    1. Ogni pool di gDNA 7 µ l indicizzati, aggiungere 9 µ l di Mix di blocco. Pipettare su e giù per mescolare.
    2. I pozzi di Cap, trasferire la piastra sigillata contenente gDNA a termociclatore e incubare a 95 ° C per 5 min, quindi tenerlo a 65 ° C. Accertare che la piastra è fissata a 65 ° C per almeno 5 min.
    3. Preparare la diluizione appropriata di RNAsi blocco, sulla base delle dimensioni della libreria di cattura (10% diluizione per librerie < 3.0 Mb e 25% diluizione per librerie > 3,0 Mb).
    4. Secondo il formato di libreria Capture, combinare la quantità adeguata di Capture Library e diluire la soluzione di RNAsi blocco in un piatto PCR tenuto su ghiaccio. Mescolare bene il pipettaggio. Per le librerie cattura < 3,0 Mb, uso 2 µ l di biblioteca e 5 µ l di RNAsi blocco a 10% diluizione. Per le librerie di cattura > 3,0 Mb, uso 5 µ l di biblioteca e 2 µ l di RNAsi blocco a 25% diluizione.
    5. Aggiungere 37 µ l di tampone di ibridazione ad ogni pozzetto contenente 7 µ l di mix di catturare biblioteca/RNasi blocco. Miscelare bene pipettando e centrifugare brevemente la piastra che contiene il mix.
    6. Mantenere la piastra di piscina gDNA a 65 ° C durante l'utilizzo di una pipetta multicanale per trasferire l'intero 44 µ l di miscela Capture Library dal passaggio 3.7.5 a ciascun campione bene della piastra piscina gDNA. Miscelare bene pipettando lentamente su e giù per 8 a 10 volte.
    7. Sigillare i pozzetti con tappi di striscia a cupola. Assicurarsi che tutti i pozzetti siano completamente sigillati. Mettere un tappetino di compressione sopra il piatto PCR nel termociclatore.
    8. Incubare la miscela di ibridazione per 24 h a 65 ° C. Nota: Esempi possono essere ibridate per fino a 72 h, ma devono verificare che l'ibridazione estesa non causa evaporazione esteso in pozzetti.
  8. Preparazione di biglie magnetiche rivestite con streptavidina
    1. Preriscaldare il tampone di lavaggio 2 a 65 ° C in un blocco di calore o vasca di acqua.
    2. Risospendere vigorosamente la streptavidina biglie magnetiche su un Vortex. I branelli magnetici stabilirsi durante la conservazione.
    3. Per ogni campione di ibridazione, aggiungere 50 µ l di sedimento perline pozzetti di una piastra PCR.
    4. Lavare le perle e li risospendere in 200 µ l di Binding Buffer.
  9. Cattura del DNA ibridato utilizzando streptavidina perline.
    1. Stimare e registrare il volume di soluzione di ibridazione che rimane dopo la 24 ore di incubazione.
    2. Mantenere la piastra di ibridazione a 65 ° C e utilizzare una pipetta multicanale per trasferire l'intero volume (circa 60 µ l) di ogni miscela di ibridazione per i pozzetti della piastra contenente 200 µ l di streptavidina lavato perline. Miscelare bene pipettando lentamente su e giù per 3 a 5 volte.
    3. Tappare i pozzetti e incubare la piastra cattura un Nutator mixer o equivalente per 30 min a temperatura ambiente. Assicurarsi che i campioni sono correttamente miscelazione nei pozzetti.
    4. Centrifugare brevemente la piastra di bloccaggio in una casella di selezione centrifuga o mini-piastra.
    5. Mettere la piastra di cattura in un separatore magnetico per raccogliere le perle dalla sospensione. Rimuovere e scartare il surnatante.
    6. Risospendere le sfere in 200 µ l di tampone di lavaggio 1. Mescolare pipettando su e giù fino a quando le perline sono risospese completamente.
    7. Centrifugare brevemente in una casella di selezione centrifuga o mini-piastra.
    8. Mettere la piastra nel separatore magnetico.
    9. Attendere che la soluzione cancellare, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
  10. Esempio di elaborazione per il sequenziamento multiplex di post-acquisizione
    1. Preparare il volume appropriato di miscela di reazione PCR mescolando i seguenti: 9 µ l Nuclease-free acqua, 25 µ l Master Mix e 1 µ l Primer Mix secondo il numero di amplificazioni. Mescolare bene usando un miscelatore vortex e mantenere il ghiaccio.
    2. Per ogni reazione di amplificazione, posto 35 µ l della miscela di reazione PCR dal punto 3.10.1 nei pozzetti di una piastra PCR.
    3. Ogni pipetta dei campioni pool associato a tallone catturati biblioteca su e giù per assicurare che la sospensione della perla è omogenea.
    4. Aggiungere 15 µ l di ogni sospensione di perlina piscina biblioteca catturati alla miscela di reazione PCR appropriata. Mescolare accuratamente pipettando fino a quando la sospensione della perla è omogenea.
    5. Posizionare la piastra preparata al punto 3.10.2 in un termociclatore ed eseguire il seguente programma di amplificazione di PCR: 98 ° C per 2 min, 8 a 11 cicli a 98 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min, seguito da un'estensione finale a 72 ° C per 10 min. Tenere i campioni a 4 ° C.
    6. Purificare il campione con una purificazione di perline basati secondo il protocollo del produttore.
    7. Valutare la qualità con un Bioanalyzer secondo il protocollo del produttore.
  11. Preparazione di campioni per multiplex sequenziamento
    Nota: Gli ultimi campioni arricchiti contengono piscine di 8 o 16 librerie indicizzate, sulla base delle dimensioni di Capture Library e conseguente pre-capture pool di strategia. Il numero totale di indicizzata librerie che possono essere multiplexati in una corsia singola sequenza è determinato dalle specifiche uscita della piattaforma utilizzata, insieme con la quantità di dati di sequenziamento necessari per la libreria di catturare.
    1. Calcolare il numero di indici che possono essere combinati per corsia, secondo la capacità della piattaforma. Il numero totale di indicizzata librerie che possono essere multiplexati in una corsia singola sequenza è determinato dalle specifiche uscita della piattaforma utilizzata, insieme con la quantità di dati di sequenziamento necessari per la libreria di catturare. Ad esempio, per la libreria di v5 essone tutti gli umani, i dati di sequenziamento consigliato per raccolta indicizzata è di 4 Gb e i dati di sequenziamento consigliato per piscina pre-capture è 32 Gb (8-Indice piscine).
  12. Sequenza le librerie.
    1. Caricare le librerie sulla piattaforma di sequenziamento di nuova generazione di scelta ed eseguire il sequenziamento eseguito secondo le specifiche dello strumento.
  13. Analizzare dati di sequenziamento dell'esoma.
    1. Eseguire la pipeline e il software di scelta per la chiamata base. Ad esempio, è possibile utilizzare Denny mappare letture20, rimuovere i duplicati con Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) e identificare i polimorfismi a singolo nucleotide e inserimento o l'eliminazione delle basi (indels) con Platypus21. Filtrare sinonimi varianti e quelli osservati con una frequenza allele < 5% e confrontare i dati con quelli da exomes parentale per identificare varianti de novo .

4. miniprep di DNA per elettroporazione In Utero

  1. Progettare diversi breve tornante RNAs (shRNA) targeting la sequenza codificante o 3' UTR dei geni candidati come descritto in precedenza22.
  2. Per evitare fuori bersaglio effetti testare shRNA specificità ricerca BLAST contro il database utilizzando i metodi standard. Escludere shRNA visualizzati da più di 50% di complementarità con altri geni di ratto.
  3. Oligonucleotidi clone ricotto in un vettore di mU6-pro come descritto in precedenza23.
  4. Purificare il plasmide DNA con un Maxi-prep secondo le istruzioni del produttore e fare una concentrazione finale di 3 µ g / µ l.
  5. Aliquota 20 µ l di DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP o costruire da soli o con 1,5 mg/ml di shRNA) e aggiungere 2 µ l di Fast verde colorante (2 mg/mL) per consentire il controllo visivo dell'iniezione.

5. nell'Utero elettroporazione

  1. Procedura chirurgica
    1. Anestetizzare E15.5 incinto ratti femminili (E0 è stato definito come il giorno della conferma della plug vaginale sperma-positivi), utilizzando una combinazione con una miscela di chetamina/xilazina (0,1 e 0,01 mg al corpo peso, rispettivamente), che è dato tramite un intraperitoneale iniezione per l'induzione anestetica.
    2. Assicurarsi che l'animale è completamente anestetizzato osservando la scomparsa del riflesso di pizzico di punta.
    3. Radere l'addome più basso dell'animale con un clipper per rimuovere il pelo. Disinfettare la pelle con scrub di povidone-iodio e alcool al 70%. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia.
    4. Metti l'animale su una fonte di calore e mettere un telino sterile (con una finestra aperta di 4-5 cm in mezzo) sopra il sito di incisione. Indossare maschere, camice da laboratorio, Berretti e guanti chirurgici sterili. Mantenere la sterilità fino alla fine della chirurgia.
    5. Utilizzando delle forbici affilate per praticare un'incisione verticale (2-2.5 cm) in pelle lungo la linea mediana nella parte caudale dell'addome e poi fare un'incisione della parete muscolare sotto la pelle — anche di 2,5 cm — lungo la linea mediana.
    6. Esporre con attenzione un corno uterino dalla cavità addominale. Goccia di soluzione salina normale pre-riscaldato a 37 ° C per idratare gli embrioni. Mantenere l'utero umido tutto il tempo.
  2. Iniezione di DNA e di elettroporazione
    1. Uno dei corni uterini premere delicatamente con il forcipe anellato e spingere con cautela un embrione alla parete uterina. Tenere l'embrione in una mano e con l'altra mano inserto accuratamente tubi capillari in vetro 1 mm dalla linea mediana nel ventricolo laterale sinistro (2-3 mm di profondità) e iniettare circa 1 µ l di DNA con Fast Green per consentire il controllo visivo dell'iniezione utilizzando un microinjector.
    2. Goccia normale soluzione salina sulla superficie di elettrodi2 3 x 7 mm. Posizionare l'elettrodo positivo sterile sul lato iniettato (ventricolo laterale di sinistra) e l'elettrodo negativo sterile il ventricolo di destra. Fornire 5 impulsi elettrici a 950 ms intervalli con un pedale del piede-controllato (4000 condensatore mF 40 V con un electroporator a carico).
  3. Elettroporazione procedure post
    1. Rimettere i corni uterini alla cavità addominale, aggiungere gocce di soluzione salina normale alla cavità per permettere embrioni posizionati più naturalmente e per tenere conto per la perdita di fluido intraoperatoria.
    2. Chiudere la parete muscolare addominale con suture chirurgiche assorbibili, quindi la pelle usando un punto semplice-interrotto.
    3. Mettere il ratto torna alla gabbia e monitorare l'animale fino a quando emerge dall'anestesia.
    4. Per la gestione del dolore somministrare buprenorfina (0,03 mg/kg) all'animale mediante un'iniezione sottocutanea ogni 8-12 h, fino a 48 h.

6. preparazione del campione cervello

  1. Metodo di fissazione
    1. Sacrificare il ratto incinto 5 giorni dopo la procedura chirurgica usando l'anestesia di gas (isoflurano) seguita da una rapida dislocazione cervicale.
    2. Praticare un'incisione verticale di riaprire la cavità addominale.
    3. Esporre i corni uterini, rimuovere gli embrioni dall'utero e decapitare loro utilizzando delle forbici affilate.
    4. Rimuovere il cervello con minimo danno al tessuto: utilizzando delle forbici affilate, praticare una piccola incisione lungo la parte posteriore (cervelletto) / asse anteriore (lampadina olfattiva) della testa a forare la pelle e il cranio, quindi utilizzando un paio di pinze staccarsi il cranio per esporre il cervello e rimuoverlo utilizzando una piccola spatola.
    5. Immergere il cervello durante la notte a 4 ° C in un 4% paraformaldeide in 1x tampone fosfato salino (PBS).
  2. Cervello di sezionamento
    1. Lavare il cervello in 1X PBS per 10 min.
    2. Incorporare cervelli in 4% agar in plastica stampi di incorporamento.
      1. Preparare 50 mL di 4% agar in 1X PBS per l'incorporamento 5 cervelli embrionali. Garantire che disciolto dell'agarosi sono a non più di 50 ° C.
    3. Mantenere il cervello in agarosio per polimerizzare per almeno 1 h a 4° C. Rimuovere l'eccesso dell'agarosi intorno al cervello.
    4. Incollare il cervello per la piastra di base del vibratome, orientato quindi l'asse anteriore/posteriore del cervello è perpendicolare alla lama. Attendere alcuni minuti che la colla asciughi e posizionare la piastra con il cervello incollato nella camera del vibratome.
    5. Riempire il vibratome con PBS 1X. Affettare 100 µm sezioni spesse.
    6. Trasferire le fettine di cervello su diapositive, rimuovere il liquido in eccesso, aggiungere poche gocce di mezzo di montaggio e collocare un vetrino coprioggetto sopra cervelli

7. confocale Imaging e l'analisi quantitativa

  1. Permette il montaggio supporto a secco durante la notte prima di imaging. Sezioni di immagine a 10 volte su un microscopio confocale a scansione laser.
  2. Utilizzando software per analisi quantitativa delle immagini, convertire l'immagine in 8-bit, selezionare un rappresentante GFP positivo fluorescente delle cellule e definire manualmente la forma. A tale scopo, fare clic su "Preventivo" e disegnare il bordo della cella utilizzando lo strumento selezione a mano libera. In questo modo il diametro e la soglia di intensità della cella vengono mantenute automaticamente dal software.
  3. Fai clic su "Find cellule" per consentire al software localizzare le cellule transfected in tutta la corteccia. Quindi, se necessario, rimuovere manualmente falsi positivi.
  4. Dividere l'intero spessore della corteccia in 8 aree di interesse normalizzato in singole sezioni. A tale scopo, fare clic su "Strumento di regione", selezionare 8 "regione Stripes" dove il primo (1) e l'ultimo (8) strisce corrispondono rispettivamente a VZ e alla parte superiore del CP. Fare clic su "Applica" per consentire al software contare la posizione relativa delle cellule transfettate GFP nella corteccia intera. Infine clicca su "Salvare la quantificazione" per esportare i dati in un file di Excel per l'analisi.

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Risultati

La strategia sperimentale progettata per identificare nuovi geni causativi di MCD è ricapitolata nella Figura 1.

Eseguendo l'array-CGH in una coorte di 155 pazienti con anomalie dello sviluppo cerebrale combinando variamente PNH (Figura 2A), disgenesia del corpo calloso, colpocephaly, ipoplasia cerebellare e la polimicrogiria associata a epilessia, atassia e danno conoscitivo, abbiamo identifica...

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Discussione

MCDs sono importanti cause di disabilità intellettiva e account per 20-40% di epilessia resistente alla droga infanzia1,2. Interesse in MCDs sono aumentato drammaticamente durante la decade passata a causa di due fattori principali. Il primo è il miglioramento nel cervello (in particolare RMN), che consente a medici e scienziati di visualizzare molte malformazioni cerebrali che precedentemente non sono state riconosciute. L'altro è l'evoluzione di strumenti genet...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Si ringraziano il Dr. G. McGillivray, Pr. J. Clayton-Smith, Pr. W.B. Dobyns, Pr. P. Striano, cioè Pr. Scheffer, Pr. S.P. Roberston e Pr. S.F. Berkovic per fornire ai pazienti MCD. Si ringraziano il Dr. F. Michel e D. Mei per aiuto ed i consigli tecnici. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del programma quadro sette dell'UE, progetto di desiderio, numero di contratto: salute-F2-602531-2013, (per V.C., R.G., A.R., A.F. e C.C.), INSERM (di A.R. e C.C.), la Fondation Jérôme Lejeune (R13083AA Agostini, E.P.P e c. c) e Région Provence Alpes Côte d'Azur (APO2014 - DEMOTICO per C.C. e A.A.D). D.A.K è un EMBO Young Investigator ed è supportato da FWF concede (I914 e P24367).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Picospritzer IIIParker Hannifin CorpP/N 051-0500-900Sistemi di dispensazione per microiniezione intracellulare
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252Fast green consente il monitoraggio visivo dell'iniezione
BTX ECM 830 elettroporatoreBTX Harvard Apparatus45-0002L'ECM 830 è un generatore di impulsi a onda quadra progettato per applicazioni
in vitro e in vivoMicrotomo HM 650 VMicrom10076838Microtomo HM 650 V vibratomo 240V 50/60Hz con lama vibrante
FluoView 300OlympusL'Olympus FluoViewTM 300 è un microscopio a scansione laser confocale a scansione puntiforme, rilevamento puntiforme, progettato per applicazioni di ricerca biologica
Software eCELLenceGlance Vision TechnologieseCELLence è un software progettato per l'analisi quantitativa della migrazione cellulare
Agilent Microarray Scanner BundleVetrini
per 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K o 8 x 15KAgilentAgilent p/n G4900DA, G2565CA o G2565BA
per 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K o 8 x 60KAgilentAgilent p/n G4900DA o G2565CA
di ibridazione, inoxAgilentAgilent p/n G2534ACamera per l'ibridazione
dell'array CGHGuarnizioni per camera di ibridazione,array CGH
per microarray in confezione da 1 oAgilentAgilent p/n G2534-60003
per microarray in confezione da 2AgilentAgilent p/n G2534-60002
per microarray in confezione da 4AgilentAgilent p/n G2534-60011
per microarray in confezione da 8AgilentAgilent cod. G2534-60014
Forno di ibridazioneAgilentAgilent p/n G2545A
Rotatore del forno di ibridazione per Camere di ibridazione Agilent MicroarrayAgilentAgilent p/n G2530-60029
Termociclatore con coperchio riscaldatoAgilentAgilent p/n G8800A o equivalenteTermociclatore per incubazioni
1,5 mL Provetta Microfuge senza RNasiAmbionp/n AM12400 o equivalenteMicrocentrifuga
Barra di agitazione magneticaCorningp/n 401435 o equivalenteStrumento per agitare
Qubit FluorimetroLife Technologiesp/n Q32857Strumento per la quantificazione del DNA
Kit di analisi Qubit dsDNA BR, da utilizzare con il fluorimetro QubitInvitrogenp/n Q32850Kit per fluorimetro Qubit
UV-VIS spettrofotometroThermo ScientificNanoDrop 8000 o 2000, o equivalenteStrumento per la quantificazione del DNA
Pipette P10, P20, P200 e P1000Pipetman o dispensazione di DNA equivalente
Concentratore sottovuotoThermo Scientificp/n DNA120-115 o
equivalente		Strumento per concentrare il DNA
SureTag Kit completo di marcatura del DNAAgilentp/n Kit di marcatura del DNA 5190-4240(per campioni umani)
Colonne di purificazione (50 unità)Agilentp/n 5190-3391(per campioni umani)
AutoScreen A, piastre a 96 pozzettiGE Healthcarep/n 25-9005-98Kit di etichettatura del DNA (per campioni umani)
Kit di pulizia GenElute PCRSigma-Aldrichp/n NA1020(per campioni umani)
Genomica umana DNAp/n G1521Kit di etichettatura del DNA (per campioni umani)
Per microarray CGH:Promega(femmina) o p/n G1471 (maschio)Array CGH control DNA
Per microarray CGH+SNP:Coriellp/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878 o NA18579Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit oAgilentp/n 5188-5226Array CGH ibridazione e lavaggio
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 eAgilentp/n 5188-5221Array CGH ibridazione e lavaggio
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2Agilentp/n 5188-5222Array CGH ibridazione e lavaggio
Soluzione di stabilizzazione e asciugaturaAgilentp/n 5185-5979Array CGH ibridazione e lavaggio
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization KitAgilentcod. 5188-5220 (25) o cod. 5188-5380 (100)Ibridazione e lavaggio Array CGH
Cot-1 DNAAgilentp/n 5190-3393Ibridazione e lavaggio Array CGH
Scanner Agilent CScanner Agilentper vetrini array CGH
Kit di reagentiper l'arricchimento del target
Piattaforma HiSeq (HSQ), 16 campioniAgilentp/n G9621A
Piattaforma HiSeq (HSQ), 96 CampioniAgilentp/n G9621B
Piattaforma HiSeq (HSQ), 480 CampioniAgilentp/n G9621C
Piattaforma MiSeq (MSQ), 16 CampioniAgilentp/n G9622A
Piattaforma MiSeq (MSQ), 96 CampioniAgilentp/n G9622B
Piattaforma MiSeq (MSQ), 480 CampioniAgilentp/n G9622C
Kit DNA 1000Agilentp/n 5067-1504Kit per la separazione, il dimensionamento e la quantificazione di frammenti di dsDNA da 25 a 1000 bp.
Kit DNA ad alta sensibilitàAgilentp/n 5067-4626Kit per l'analisi di DNA frammentato o librerie di DNA.
Kit AMPure XP Kitper la purificazione automatizzata della PCR.
5 mLAgencourtp/n A63880
60 mLAgencourtp/n A63881
450 mLAgencourtp/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Isolamento e manipolazione di acidi nucleici biotinilati
2 mLLife TechnologiesCat #65601
10 mLLife TechnologiesCat #65602
Kit di analisi Quant-iT dsDNA BR, per il fluorimetroQuantificazione del DNA
100 saggi, 2-1000 ngLife TechnologiesCat #Q32850
500 saggi, 2-1000 ngLife TechnologiesCat #Q32853
QubitLife Technologiesp/n Q32856Quantificazione del DNA
Librerie di acquisizione SureSelec tXT2Agilenta seconda dell'esperimentoKit per l'acquisizione delle librerie
SureCycler 8800 Thermal CyclerAgilentp/n G8800A
Modulo piastra a 96 pozzetti per SureCycler 8800 Thermal CyclerAgilentp/n G8810AAmplificazione del DNA
Piastre a 96 pozzetti compatibili con SureCycler 8800Agilentp/n 410088Amplificazione del DNA
Striscia ottica tappiAgilentp/n401425 Amplificazione del DNA
Strisce di tappi per tubi, bombatiAgilentp/n 410096Amplificazione del DNA
Tappetini di compressioneAgilentp/n 410187Amplificazione del DNA
2100 Bioanalyzer Laptop BundleAgilentp/n G2943CAAmplificazione del DNA
2100 Bioanalyzer Electrophoresis SetAgilentp/n G2947CAAmplificazione del DNA
Sistema di preparazione dei campioni Covaris, serie E o serie SDNACovaris
PortacampioniCovaris p/n 520078Taglio del DNA
Miscelatore a piastre NutatorBD Diagnosticsp/n 421105 o equivalenteMiscelatore a piastre
GaIIxIlluminasequenziatore di nuova generazione
Camera guarnizione in confezione da 5 per o o Kit di etichettatura del DNA Human SureSelect XT2 Qubit Provette per saggi Taglio del

Riferimenti

  1. Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
  2. Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
  3. Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
  4. Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
  5. Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
  6. Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
  7. Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
  8. Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
  9. van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
  10. Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
  11. Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
  12. Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
  13. Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
  14. Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
  15. Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
  16. Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
  17. Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
  18. Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
  19. Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
  20. Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
  21. Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
  22. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
  23. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  24. Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).

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