Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

Summary

Questo articolo descrive un metodo con cui l'architettura vascolare nel cervello può essere quantificata utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo ed ex vivo.

Abstract

'L'infezione da virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) provoca frequentemente disturbi neurocognitivi associati all'HIV-1 (HAND) ed è caratterizzata da uno stato neuroinfiammatorio cronico all'interno del sistema nervoso centrale (SNC), che si ritiene sia guidato principalmente dall'attivazione viralmente mediata della microglia e dei macrofagi residenti nel cervello. L'infezione da HIV-1 è anche accompagnata da cambiamenti nel flusso sanguigno cerebrovascolare (CBF), aumentando la possibilità che la neuroinfiammazione cronica associata all'HIV possa portare a cambiamenti nel CBF e/o nell'architettura vascolare cerebrale. Per rispondere a questa domanda, abbiamo utilizzato un modello murino per la neuroinfiammazione indotta dall'HIV e abbiamo testato se l'esposizione a lungo termine a questo ambiente infiammatorio può danneggiare la vascolarizzazione cerebrale e provocare la rarefazione delle reti capillari. In questo articolo descriviamo un metodo per quantificare i cambiamenti nella densità capillare corticale in un modello murino di malattia neuroinfiammatoria (topi transgenici HIV-1 Tat). Questo approccio generalizzabile impiega l'imaging in vivo a due fotoni dei capillari corticali attraverso una finestra corticale a cranio sottile, nonché l'imaging ex vivo a due fotoni dei capillari corticali nelle sezioni cerebrali del topo. Queste procedure producono immagini e file z-stack di reti capillari, rispettivamente, che possono essere sottoposti ad analisi quantitativa al fine di valutare i cambiamenti nell'architettura vascolare cerebrale.

Introduction

Virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) invade il cervello durante la fase acuta di infezione da virus, e infetta produttivo sia microglia e macrofagi residenti del cervello, portando a loro attivazione - e il rilascio di entrambi mediatori dell'infiammazione ospitanti di derivazione e l'HIV-1 solubile virotoxins come la Tat e gp120 (rivisto in ^1,2). Di conseguenza, uno stato cronico neuroinflammatory si stabilisce nel SNC, che è pensato per contribuire alla patogenesi di HIV-1 disturbi associati neurocognitivi (mano) ^3-5.

Sovraespressione cronica di HIV-1 Tat o interleuchina (IL) -17A nel SNC di topi....

Protocol

L'Università del comitato dell'Università di Rochester per le risorse animali ha approvato tutte le procedure eseguite in questo documento.

Preparazione 1. Pre-chirurgico (e mouse)

1. Preparare l'area chirurgica con tutte le attrezzature necessarie. Sterilizzare tutti gli utensili impiegati durante la procedura di anticipo utilizzando 70% di etanolo. Facoltativamente, utilizzare uno sterilizzatore vetro tallone o in autoclave per sterilizzare gli strumenti.
2. Posizionare il mouse in una camera di induzione isoflurano collegato ad un vaporizzatore isoflurano. Impostare i livelli isoflurano al 4% ad una velocità ....

Results

La finestra corticale sottile cranio permette in vivo due fotoni imaging capillari corticali (Figura 1). Una zona adatta per l'immagine mostra numerosi, capillari distinti (Figura 1A). Nello stesso campo di vista, non c'è arteriosa autofluorescenza parete cellulare, e ci possono essere altri segnali fluorescenti, quali il collagene, la fluorescenza indotte da generazione di seconda armonica ¹¹ (Figura 1B).

Discussion

Il metodo qui descritto può essere applicato per analizzare strutture microvascolari cerebrali in un'ampia gamma di modelli sperimentali / impostazioni. Per il successo di questo metodo, tre passaggi critici devono essere padroneggiato. In primo luogo, la finestra sottile cranio non deve danneggiare il cranio o cerebrale sottostante. E 'facile forare il cranio durante diradamento, o causare perdite di calore indotta vascolare. Questo può interferire con le immagini come il colorante fluorescente colerà nel piano.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio Leica	Leica Inc.	MZ8
Illuminatore ad Alta Intensità	Dolan-Jenner	180
Termoforo	Stryker	TP3E
T/POMPA	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Vaporizzatore di isoflurano	Datex Ohmeda	447
Gel lacrimale artificiale	Butler AHS	7312
Soluzione di iodio povidone	Aplicare	52380-1855-9
Forbici Bonn extra fini	Strumenti per la scienza fine	14084-08
Dumot #5 Pinze	Strumenti per la scienza fine	11295-10
Dumont # 5/45 Pinze	Strumenti per la scienza fine	11251-35
Soluzione di cloruro ferrico	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Gel adesivo istantaneo per prismi	Henkel	45404
Cemento dentale	Stoelting	51459
Kit manipolo Microtoruqe II	Pearson Dental	R14-0002
005 Fresa per Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Microblade dentale)	Salvin Dental	6900
Uretano	Sigma-Aldrich	U2500	Gruppo 2B cancerogeno
Sutura intrecciata	Ethicon	735G
Vannas Forbici a molla	Strumenti di scienza fine	15000-03
Catetere arterioso	SAI Infusion Technologies	MAC-01	L'estremità del catetere è stata allungata manualmente per diminuirne il diametro.
Pressione sanguigna Moniter	World Precision Instruments	SYS-BP1
Trasduttore di pressione sanguigna e cavo	World Precision Instruments	BLPR2
RAPIDLab Analizzatore di gas ematici	Siemens	248
40 μ l Tubo capillare	VWR	15401-413
Texas Red-destrano (70.000 MW, 10 mg/kg disciolto in soluzione salina)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Microscopio multifotone	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
Software ImageJ	National Institutes of Health (NIH)		Disponibile all'indirizzo
http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html Amira Software	Visage Imaging