Qui, vi presentiamo un protocollo per le specifiche esaurimento mRNA siRNA-mediata seguita da analisi di immunofluorescenza per valutare il montaggio fuso meiotico e l'organizzazione in ovociti di topo. Questo protocollo è adatto a deplezione di trascritti in vitro e valutazione funzionale diverso mandrino e / o fattori MTOC associati in oociti.
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Articolo metodologico
Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli errori nella segregazione cromosomica durante la divisione meiotica nei gameti possono portare ad aneuploidie che vengono successivamente trasmesse all'embrione dopo la fecondazione. L'aneuploidia risultante negli embrioni in via di sviluppo è riconosciuta come una delle principali cause di aborto e difetti congeniti alla nascita come la sindrome di Down. L'accurata segregazione cromosomica dipende in modo critico dalla formazione dell'apparato del fuso dei microtubuli, ma questo processo rimane poco compreso negli ovociti dei mammiferi. Curiosamente, l'assemblaggio del fuso meiotico differisce dalla mitosi ed è regolato, almeno in parte, da centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) unici. La valutazione delle proteine associate a MTOC può fornire preziose informazioni sui meccanismi regolatori che governano la formazione e l'organizzazione del fuso meiotico. Qui, descriviamo i metodi per isolare gli ovociti di topo e depletare le proteine associate a MTOC utilizzando un approccio mediato da siRNA per testare la funzione. Inoltre, descriviamo le condizioni di fissazione degli ovociti e di analisi dell'immunofluorescenza per valutare la formazione e l'organizzazione del fuso meiotico.
Introduzione
La meiosi è un processo di divisione unica che si verifica in gameti (ovociti e spermatozoi) e coinvolge due divisioni successive senza intervenire sintesi del DNA per separare i cromosomi omologhi e cromatidi fratelli durante la meiosi I e meiosi II, rispettivamente, 1. Errori nella segregazione dei cromosomi durante la divisione meiotica in oociti possono causare aneuploidia, che viene ereditato dalla embrione durante la fecondazione. In particolare, l'incidenza di aneuploidie negli embrioni in via di sviluppo aumenta con l'avanzare dell'età materna, ed è una delle principali cause di difetti di nascita congeniti così come la perdita di gravi....
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Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) presso l'Università della Georgia.
1. Preparativi
- Per la cultura ovocita, acquisto o appena preparare Minimal Essential Medium (MEM) e integrare con 3 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA) come indicato nella tabella 1. Mettere una bottiglia di polistirene su una bilancia di carico (tara a zero). Aggiungi tutti i reagenti, ad eccezione di BSA, in ordine e portare il volume finale con MQ-acqua, in peso, per un totale di 250 g. Quindi aggiungere il BSA, permettere di sciogliere e filtro sterilizzare.
No....
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Risultati
Microiniezione di siRNAs fornisce un approccio efficace per la degradazione dell'mRNA e successiva deplezione proteica in oociti, che consente efficiente e altamente specifico collaudo funzionale di diversi fattori bersaglio in vitro. Successivamente, immunofluorescenza viene utilizzato per l'analisi specifica fenotipo e convalidare deplezione proteica in ovociti siRNA-iniettato. Nell'esempio corrente, marcatura fluorescente di ovociti individuali con DAPI insieme con anticorpi anti-tubulina ed anti.......
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Discussione
Mentre ci sono diversi metodi per esogena trasferimento di acidi nucleici nelle cellule somatiche, come elettroporazione e transfezione, microiniezione è il metodo ottimale per la consegna di molecole di RNA in ovociti trascrizionalmente quiescenti del mouse. Il protocollo attuale prevede un approccio efficace per esaurimento in vitro di specifici mRNA che consentono il collaudo funzionale di diverso fuso e / o fattori MTOC associate in ovociti. Questo approccio si traduce in efficienza esaurimento trascrizione.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata in parte dall'Università della Georgia e da una sovvenzione (HD071330) dal National Institutes of Health a MMV.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| Gonadotropina sierica di cavalla incinta (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Medium essenziale minimo (MEM) | *Ricetta descritta nella Tabella 1 | ||
| Soluzione salina bilanciata di Earle (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodio Bicarbonato | Sigma | S-5761 | |
| Acido piruvico, sale sodico | Sigma | P-5280 | |
| Penicillina G, sale di potassio | Sigma | P-7794 | |
| Streptomicina solfato | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutammina | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, sale disodico diidrato | Sigma | E-4884 | |
| Aminoacidi essenziali (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| Miscela vitaminica MEM (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Soluzione di rosso fenolo | Sigma | P-0290 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma M4659 | ||
| Siero fetale bovino (FBS) | Terreno di iclonazione | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 con Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNA che hanno come bersaglio la pericentrina | Qiagen | GS18541 | |
| siRNA di controllo negativo. | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldeide (soluzione al 16%) | Microscopia elettronica Scienze | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrina (coniglio) | Covance | PRB-432C | |
| A-tubulina anti-acetilata (topo) | Sigma | T-6793 | |
| Capra anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Capra anti-topo Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscopio (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscopio | Leica Microsystems | ||
| Microscopio invertito | Nikon | ||
| Sistema di micro-iniezioni Femtojet | Eppenforf | ||
| Micro manipolatori | Eppendorf | ||
| Aghi per micro-iniezione (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Pipette di tenuta (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm | Corning Life Sciences | 351008 | |
| Piastre a 4 pozzetti | Thermo Scientific | 176740 | |
| Piastre a 96 pozzetti | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0,45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
Riferimenti
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet.
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Ristampe e permessi
