Method Article

Sviluppo di un Backbone ciclico Peptide Biblioteca come potenziale Antiparassitaria Therapeutics Uso Microonde irradiazione

DOI:

10.3791/53589

⸱

January 26th, 2016

 , 
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viene delineato un metodo semplice e generale per la sintesi di peptidi ciclici utilizzando l'irradiazione a microonde. Questa procedura consente la sintesi di peptidi ciclici della spina dorsale con una raccolta di diverse conformazioni mantenendo le catene laterali e le frazioni farmacoforiche., e quindi, consente lo screening della conformazione bioattiva.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interazioni proteina-proteina (PPI) sono intimamente coinvolti in quasi tutti i processi biologici e sono collegati a molte malattie umane. Pertanto, vi è un grande sforzo per PPI nella ricerca di base e del settore farmaceutico bersaglio. Interfacce proteina-proteina sono di solito grandi, piatti, e spesso non hanno le tasche, complicando la scoperta di piccole molecole che hanno come target tali siti. Approcci di targeting alternativi utilizzando anticorpi hanno delle limitazioni dovute alla scarsa biodisponibilità orale, a bassa permeabilità cellulare, e inefficienza della produzione.

Utilizzo di peptidi per indirizzare le interfacce PPI ha diversi vantaggi. Peptidi hanno una maggiore flessibilità conformazionale, una maggiore selettività, e sono generalmente poco costoso. Tuttavia, i peptidi hanno i loro limiti, tra cui scarsa stabilità e inefficienza attraversare le membrane cellulari. Per superare tali limitazioni, peptide ciclizzazione può essere eseguita. Ciclizzazione ha dimostrato di migliorare la selettività peptide, Stabilità metabolica e biodisponibilità. Tuttavia, prevedere la conformazione bioattiva di un peptide ciclico non è banale. Per superare questa sfida, un attraente approccio a schermo una libreria mirato per schermo in cui tutti i peptidi ciclici backbone hanno la stessa sequenza primaria, ma si differenziano per i parametri che influenzano la loro conformazione, come la dimensione e la posizione dell'anello.

Descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi di una libreria di backbone peptidi ciclici mirati specifici PPI parassita. Utilizzando un approccio progettuale razionale, abbiamo sviluppato peptidi derivati ​​dalla proteina patibolo recettore L eishmania per C attivata-chinasi (mancanza). Abbiamo ipotizzato che le sequenze in MANCANZA che si conservano nei parassiti, ma non nel omologo mammifero ospite, possono rappresentare siti di interazione per le proteine ​​che sono fondamentali per la vitalità dei parassiti. I peptidi ciclici sono stati sintetizzati utilizzando irradiazione a microonde per ridurre i tempi di reazione e aumentareefficienza. Lo sviluppo di una libreria di backbone peptidi ciclici con misure degli anelli diversi facilita una schermata sistematica per la conformazione attiva più biologica. Questo metodo fornisce un modo generale, veloce e facile da sintetizzare peptidi ciclici.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale nella maggior parte dei processi biologici, da intracellulare trasduzione del segnale di morte cellulare 1. Quindi, il targeting PPI è di fondamentale importanza per la ricerca di base e applicazioni terapeutiche. PPI possono essere regolate da anticorpi specifici e stabili, ma anticorpi sono costosi e difficili da produrre e hanno scarsa biodisponibilità. In alternativa, PPI possono essere bersaglio di piccole molecole. Piccole molecole sono più facili da sintetizzare e poco costoso rispetto agli anticorpi; tuttavia, sono relativamente meno flessibili e si adattano meglio piccole cavità di grandi interfacce proteina-proteina 2,3. Diversi studi hanno dimostrato che i peptidi, che sono più semplici e meno costosi rispetto agli anticorpi e più flessibile di piccole molecole, possono legarsi interfacce proteine ​​e regolare PPI 4,5. Il mercato globale peptide terapeutico è stata valutata una quindicina di miliardi di dollari nel 2013 ed è in crescita del 10,5% annually 6. Inoltre, ci sono più di 50 peptidi commercializzati, circa 270 peptidi in diverse fasi di sperimentazione clinica, e circa 400 peptidi in fase preclinica avanzate 7. Sebbene numerosi peptidi vengono utilizzati come farmaci, peptidi pongono ancora diverse sfide che limitano la loro applicazione diffusa tra cui scarsa biodisponibilità e la stabilità, l'inefficienza nelle membrane cellulari di attraversamento, e la flessibilità conformazionale 8,9. Una alternativa per superare questi inconvenienti è applicare diverse modifiche come (D-amminoacido e N-alchilazione) locale e globale (ciclizzazione) vincoli 8,10-12. Queste modifiche si verificano anche in natura. Ad esempio, ciclosporina A, un peptide ciclico naturale immunosoppressore, contiene un singolo D-amminoacido e subisce N-alchilazione modifiche 13,14.

Modifica di aminoacidi naturali per indurre vincoli locali, come D- e N-alchilazione, spesso colpisce il peptide9; s attività biologica. Tuttavia, ciclizzazione, in cui la sequenza di interesse può rimanere lo stesso, è più probabile per preservare l'attività biologica. Ciclizzazione è un modo molto attraente per restringere peptide spazio conformazionale riducendo l'equilibrio tra le diverse conformazioni. Di solito aumenta l'attività biologica e selettività limitando il peptide alla conformazione attiva che media una sola funzione. Ciclizzazione migliora anche la stabilità peptide mantenendo il peptide in una conformazione che è meno riconosciuto da enzimi di degradazione. Infatti, peptidi ciclici hanno dimostrato di aver migliorato la stabilità metabolica, la biodisponibilità, e la selettività rispetto ai loro omologhi lineari 15-17.

Tuttavia, ciclizzazione può essere un'arma a doppio taglio poiché in alcuni casi la restrizione può impedire che i peptidi di raggiungere una conformazione bioattiva. Per superare questo ostacolo, una biblioteca focalizzato in cui tutti i peptidi hanno lo stesso SEQUENC primarioe di conseguenza costanti pharmacophores possono essere sintetizzati. Peptidi nella libreria differiscono parametri che influenzano la loro struttura, come la dimensione e la posizione dell'anello, in modo da schermare successivamente per la conformazione più bioattivo 9,18.

I peptidi possono essere sintetizzati sia in soluzione e da un approccio di sintesi peptidica in fase solida (SPPS), che ora è il metodo più diffuso sintesi peptidica e sarà discusso ulteriormente. SPPS è un processo mediante il quale trasformazioni chimiche vengono eseguite su un supporto solido tramite un linker per preparare una vasta gamma di composti sintetici 19. SPPS consente assemblaggio peptidi di accoppiamento consecutivo di aminoacidi in modo graduale dal C-terminale, che è attaccato ad un supporto solido, al N-terminale. Le catene laterali di acido N-alfa-ammino devono essere mascherati con gruppi protettivi che sono stabili nelle condizioni di reazione utilizzate durante peptide allungamento per garantire l'aggiunta di un amminoacido per step. Nella fase finale, il peptide viene rilasciato dalla resina e la catena laterale gruppi protettori sono contemporaneamente rimossi. Mentre il peptide viene sintetizzato, tutti i reagenti solubili possono essere rimossi dal peptide-solido matrice di supporto per filtrazione e lavato via alla fine di ogni fase di accoppiamento. Con tale sistema, un grande eccesso di reagenti ad alta concentrazione può guidare reazioni di accoppiamento a completamento e tutti i passaggi di sintesi può essere effettuato nello stesso recipiente senza trasferimento di materiale 20.

Sebbene SPPS ha alcune limitazioni, quali la produzione di reazioni incomplete, reazioni collaterali, reagenti impuri, nonché difficoltà di controllo della reazione 21, i vantaggi di SPPS hanno reso il "gold standard" per la sintesi peptidica. Questi vantaggi includono la possibilità di incorporare amminoacidi non naturali, automazione, facile purificazione, perdite fisiche minimizzate, e l'uso di reagenti in eccesso, con conseguentealti rendimenti. SPPS ha dimostrato di essere estremamente utile nella sintesi di sequenze difficili 21,22, modifiche fluorescenti 23, e librerie peptidiche 24,25. SPPS è anche molto utile per altri assembly poli-chain, come oligonucleotidi 26,27, 28,29, oligosaccaridi e peptide acidi nucleici 30,31. È interessante notare che, in alcuni casi, SPPS ha dimostrato di essere vantaggioso per sintetizzare piccole molecole che sono tradizionalmente realizzati in soluzione 32,33. SFF è utilizzato sia in piccola scala per la ricerca e l'insegnamento 34,35, così come su larga scala nel settore industriale 36-38.

Due strategie di sintesi che sono utilizzati principalmente nella metodologia SPPS per la sintesi di peptidi sono butilossicarbonile (Boc) e 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc). La strategia originale introdotte per SPPS era Boc, che richiede condizioni di acidi forti per rimuovere catena laterale gruppi protettori e fendere il peptide dal rEsin. Sintesi peptidica Fmoc-based utilizza tuttavia moderate condizioni di base ed è un mite alternativa al protocollo Boc acido labile 39. La strategia Fmoc utilizza ortogonale t-butile (tBu) Protezione catena laterale che viene rimosso nell'ultimo passaggio della sintesi mentre fende il peptide dalla resina in condizioni acide.

Il principio generale per la sintesi peptidica su supporto solido è presentato in Figura 1. L'aminoacido iniziale, mascherato da un gruppo di protezione temporanea sul N-α-terminale, viene caricato sulla resina dal C-terminale. Un gruppo protettivo semipermanente per mascherare la catena laterale è anche utilizzato se necessario (Figura 1, Passaggio 1). La sintesi del peptide bersaglio viene assemblato dal C-terminale all'N-terminale da cicli ripetitivi di deprotezione del gruppo protettivo N-α-temporaneo (Figura 1, fase 2) e accoppiamento del successivo amminoacido protetto (Figura 1 ong>, punto 3). Dopo l'ultimo aminoacido viene caricato (Figura 1, fase 4), il peptide viene scissa dal supporto di resina e dei gruppi protettivi semi-permanenti sono rimossi (Figura 1, fase 5).

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Figura 1. Schema generale di sintesi in fase solida del peptide. L'amminoacido N-α-protetto viene ancorato con il gruppo carbossilico tramite un linker alla resina (Passaggio 1). Il peptide desiderato viene assemblata in modo lineare dal C-terminale all'N-terminale da cicli ripetitivi di deprotezione del gruppo protettivo temporaneo (TPG) dal N-α (Fase 2) e accoppiamento aminoacido (Passaggio 3). Dopo realizzare la sintesi (passo 4), i gruppi protettori semipermanenti (SPG) sono deprotetto durante peptide clivaggio (Fase 5).ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dopo il montaggio della catena peptidica completa, ciclizzazione può essere ottenuto mediante diverse alternative: (A) testa-coda ciclizzazione - questo è un modo conveniente ma limitato in quanto fornisce una sola opzione per ciclizzazione (Figura 2A), (B) ciclizzazione utilizzando gli aminoacidi della sequenza di interesse che contengono gruppi funzionali bioattive - tuttavia, l'uso di questi aminoacidi può influenzare l'attività biologica (Figura 2B), e (C) ciclizzazione aggiungendo aminoacidi (o altri blocchi) senza disturbare la sequenza bioattivo. Introducendo queste molecole è diffuso in quanto consente produzione di librerie focalizzate senza modificare la sequenza di interesse (Figura 2C).

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FIGURA 2. strategie peptide Alternativa ciclizzazione (A) testa-coda ciclizzazione, attraverso un legame peptidico tra il C-terminale e N-terminale.; (B) ciclizzazione tra i gruppi funzionali come un legame disolfuro tra i residui di cisteina (1), o un legame ammidico tra le catene laterali di lisina per acido aspartico / glutammico (2), o catena laterale di N- o C-terminale (3 -4); (C) ciclizzazione con l'aggiunta di amminoacidi extra o derivati ​​degli aminoacidi o piccole molecole, ad esempio prima (R0) e dopo (R7) la sequenza bioattivo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Micro-onde sintesi utilizza irradiazione a microonde per riscaldare le reazioni, accelerando così chimico organico trasformazioni 40,41. Microonde chimica è basata sulla capacità del reagente / solvente per assorbire ilforno a microonde di energia e convertirla in calore 42. Prima che la tecnologia è diventata diffusa, grossi inconvenienti dovuti superare, compresa la controllabilità e la riproducibilità dei protocolli di sintesi e la mancanza di sistemi disponibili temperatura e di pressione adeguati controlli 43,44. La prima relazione di micro-onde sintesi peptidica è stato fatto utilizzando un forno a microonde cucina per sintetizzare diversi peptidi brevi (7-10 aminoacidi), con un significativo miglioramento della efficienza di accoppiamento e la purezza 45. Inoltre, l'energia a microonde ha dimostrato di diminuire aggregazione catena, ridurre le reazioni collaterali, limitare racemizzazione, e migliorare i tassi di accoppiamento, che sono tutti critici per difficili e lunghe sequenze 46-53.

Attualmente l'uso di irradiazione con microonde per la sintesi di peptidi o composti correlati su un supporto solido è ampia, tra cui (a) Sintesi di acqua invece di solvente organico 54; (B) sintesi di peptidi concomuni modificazioni post-traduzionali, come glicopeptidi 55-58 o 59-61 phosphopeptides, la cui sintesi è tipicamente difficile a causa della bassa efficienza di accoppiamento di derivati ​​amminoacidici stericamente impediti; (C) sintesi di peptidi con modifica del backbone, come azapeptides, che possono essere costituiti dalla sostituzione del C (α) di un residuo amminoacidico con un atomo di azoto 62, o peptoids, la cui catena laterale è collegato al azoto ammidico piuttosto che l'atomo Cα 63,64; (D) sintesi di peptidi ciclici 65-71; e (E) sintesi di librerie combinatoriali 51,72. In molti casi, gli autori hanno riportato una maggiore efficienza e ridotto tempo di sintesi usando irradiazione a microonde rispetto al protocollo convenzionale.

Utilizzando un design razionale 73-75, abbiamo sviluppato peptidi anti-parassiti che sono stati ottenuti da recettore L del eishmania ponteggio FOattivato r C-chinasi (mancanza). MANCANZA svolge un ruolo importante nella fase precoce dell'infezione Leishmania 76. Parassiti che esprimono bassi livelli di MANCANZA riescono a parassitare anche topi immunocompromessi 77 la mancanza è coinvolta nei processi parassita segnalazione essenziali e sintesi proteica 78. Pertanto, MANCANZA è una proteina impalcatura chiave 79 e un altro obiettivo prezioso. Concentrarsi sulle sequenze in MANCANZA che si conservano nei parassiti, ma non nel mammifero ospite omologo RACK, abbiamo identificato un peptide 8 aminoacidi (RNGQCQRK) che è diminuita di Leishmania sp. Vitalità nella cultura.

Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di peptidi ciclici backbone derivati ​​dalla sequenza proteica LACK sopra descritta. I peptidi sono stati sintetizzati su un supporto solido mediante riscaldamento a microonde dalla metodologia SPPS con protocollo Fmoc / tBu. I peptidi sono stati coniugati ad un TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) carrier peptidico attraverso un legame ammidico comeparte del SPPS. Trasporti con sede a TAT di una varietà di carichi nelle cellule è stato utilizzato da oltre 15 anni e la consegna della merce in organuli subcellulari è stato confermato 80. Quattro differenti linker, succinico e anidride glutarica nonché adipico e acido pimelico, sono stati usati per eseguire la ciclizzazione di generare linkers acidi carbossilici da due a cinque atomi di carbonio. Ciclizzazione è stato fatto utilizzando l'energia a microonde, e la scissione e della catena laterale fasi finali deprotezione sono stati fatti a mano, senza l'energia a microonde. L'uso di un sintetizzatore automatizzato microonde migliorato la purezza del prodotto, aumentato la resa del prodotto, e ha ridotto la durata della sintesi. Questo protocollo generale può essere applicato ad altri studi che utilizzano peptidi comprendere importante meccanismo molecolare in vitro e in vivo e sviluppare ulteriormente potenziali farmaci per malattie umane.

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Protocol

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1. Attrezzature e reagenti Preparazione

  1. Attrezzature Preparazione
    1. Eseguire tutti i passaggi all'interno di una cappa aspirante con un equipaggiamento di protezione personale.
    2. Chimicamente sintetizzare peptidi su supporto solido con un microonde Peptide Synthesizer con un modulo aggiuntivo di Discover dotato di una sonda di temperatura a fibre ottiche per il controllo della erogazione microonde alimentazione in un recipiente di reazione Teflon (30 ml, con una fritta di vetro) o in polipropilene monouso Cartuccia (12 ml, con una fritta ruvida).
    3. Per una corretta miscelazione, collegare l'alimentazione di azoto al recipiente di reazione, oppure sigillare entrambe le estremità della cartuccia polipropilene, e disporre su un agitatore rotante.
    4. Per scaricare miscele di reazione o lavaggi, collegare alla casa del vuoto attraverso un sifone.
    5. Posizionare la sonda in fibra ottica nel recipiente di reazione.
  2. Preparazione reagenti
    1. Preparare la resina pesando Rink Amide AM resina 100-200 mesh (0.204 mg), Aggiungere 5 ml di miscela 1: 1 di N, N -dimethylformamide (DMF) / diclorometano (DCM) alla cartuccia recipiente / polipropilene reazione per lavare la resina giù, agitare per 2-4 ore a gonfiarsi correttamente, e drenare.
    2. Preparare 0,2 M 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) ammino soluzioni acide sciogliendo il corrispondente acido Fmoc-ammino in DMF e agitare la miscela fino amminoacidi vengono sciolti (Tabella 1).
    3. Preparare 0,45 M attivatore mix soluzione sciogliendo 18,96 g O - (benzotriazol-1-il) - N, N, N ', N' esafluorofosfato -tetramethyluronium (HBTU) in 100 ml di DMF e vortex la miscela fino a quando il solido è sciolto (Tabella 1).
    4. Preparare 2 M di base attivatore mix soluzione combinando 34,8 ml N, N -diisopropylethylamine (DIEA) con 65,2 ml 1-metil-2-pirrolidinone (NMP) (Tabella 1).
    5. Preparare 0,1 M deprotezione mix soluzione sciogliendo idrato 3,37 g 1-idrossibenzotriazolo (HOBt)in 250 ml di una v / v soluzione al 20% di piperidina in DMF e vortex la miscela fino a quando il solido viene disciolto (Tabella 1).

2. Fmoc-protetti Amino Acid Accoppiamento

  1. Accoppiamento aminoacido
    1. Aggiungere amminoacido (2,5 ml) / attivatore (1 ml) / base attivatore (0,5 ml) per reazione cartuccia nave / polipropilene e lasciare che la reazione procede per 300 sec (25 W, 75 ° C, tabella 2). Scolare la soluzione.
    2. Lavare la resina con DMF. Aggiungere DMF alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, RT) e scaricare la soluzione. Ripetere cinque volte.
  2. Deprotezione Fmoc
    1. Aggiungere 7 ml di 20% piperidina in DMF con 0,1 M HOBt reazione cartuccia nave / polipropilene e incubare per 30 sec (45 W, 75 ° C, tabella 2).
    2. Scolare la miscela di reazione.
    3. Aggiungere 7 ml di 20% piperidina in DMF con 0,1 M HOBt di reazione cartuccia nave / polipropilene e incubare per 180 secondi (45 W, 75 ° C, tabella 2).
    4. Scolare la miscela di reazione.
    5. Lavare la resina con DMF. Aggiungere DMF alla resina per 120 secondi (7 ml 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere cinque volte.
      Nota: In alternativa, mettere in pausa la procedura qui e riprendere in un secondo momento.
  3. Dopo amminoacido fase di accoppiamento, lavare la resina con DCM e conservare per almeno alcuni giorni a 4 ° C (per un periodo più lungo deposito resina a - 20 ° C).
    1. Spostare la resina dal recipiente di reazione ad una cartuccia polipropilene.
    2. Lavare la resina con DCM. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte.
    3. Sigillare la cartuccia in polipropilene strettamente con un tappo superiore e rubinetto.
    4. Prima di iniziare una nuova sintesi, gonfiare la resina per 3-4 ore in DMF (7 ml).
  4. Monitoraggio sintesi
    1. Utilizzare il test Kaiser (ninidrina) o il test cloranile per determinare rapidamente il progresso dellasintesi. Facoltativamente, eseguire una reazione di scissione piccola scala per determinare la purezza e la massa del peptide sintetizzato. Vedere la sezione 9.
      Nota: Per ulteriori guasti vedi tabella 3.
  5. Ripetere i punti 2.1 e 2.2, se lo desideri di sintetizzare peptidi mirati: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Anidride / Acid Accoppiamento

  1. Accoppiamento Anidride
    1. Lavare la resina con NMP. Aggiungere NMP alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte.
    2. Sciogliere 10 equivalenti di anidride corrispondente in NMP (5 ml), aggiungere 1 equivalente 4-dimetilamminopiridina (DMAP) e 10 equivalenti DIEA alla soluzione (Tabella 1).
    3. Aggiungere 10: 1: 10 miscela di anidride / DMAP / DIEA alla resina e incubare per 300 sec (25W, 75 ° C, tabella 2). Scolare la soluzione.
    4. Lavare la resina con NMP. Aggiungere NMP alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte.
  2. Accoppiamento acido
    1. Lavare la resina con DMF. Aggiungere DMF alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte.
    2. Sciogliere 10 equivalenti del corrispondente acido bicarbossilico in DMF (5 ml). Aggiungere 1 DMAP equivalente e 10 equivalenti N, N '-Diisopropylcarbodiimide (DIC) alla soluzione (Tabella 1).
    3. Pre-attivare l'impasto mescolando per 30 minuti.
    4. Aggiungere la miscela alla resina e incubare per 300 sec (25 W, 75 ° C, tabella 2) e scaricare la soluzione.
    5. Lavare la resina con DMF. Aggiungere DMF alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere il passaggio tre volte.

4. N-methyltrityl (MTT) Proteggere Gruppo Deprotectione

Nota: La catena laterale lisina è stato protetto con N-methyltrityl (MTT) 81, un gruppo di protezione che può essere deprotetto selettivamente in condizioni acide labili 82,83. Deprotect Mtt gruppo protettivo manualmente su un agitatore senza energia a microonde.

  1. Trasferire la resina di una cartuccia in polipropilene dotato di spina tappo e rubinetto di arresto.
  2. Lavare la resina con DCM. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte.
  3. Aggiungere 15-25 ml di una miscela di 1% di acido trifluoroacetico (TFA), 5% Triisopropylsilane (TIS), e 94% DCM alla cartuccia polipropilene per grammo di resina.
    Nota: TFA è un acido forte e corrosivo ed è estremamente irritante per la pelle, occhi e tessuto polmonare.
    1. Mantenere soluzioni concentrate di TFA nella cappa in ogni momento.
    2. Usare un equipaggiamento di protezione personale (protezione per gli occhi, un camice da laboratorio e guanti) e lavorare in una cappa ben ventilata. Cambiare i guanti tempestivamentese vengono a contatto con TFA e subito clean-up tutte le cadute. Se la pelle o gli occhi entrano in contatto con l'acido, risciacquare immediatamente la zona interessata con acqua e lavare per altri 15 min.
  4. Posizionare la cartuccia polipropilene su un agitatore e agitare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Scolare la soluzione dalla cartuccia polipropilene applicando il vuoto.
  6. Ripetere i passaggi 4,3-4,5, tre volte.
  7. Lavare la resina con DCM. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere cinque volte.

5. La ciclizzazione del peptide lineare

  1. Lavare la resina con DCM. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere cinque volte.
  2. In una provetta di polipropilene da 50 ml, sciogliere 5 equivalenti benzotriazolo-1-ly-ossi-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) in Dibromomethane (DBM, 5 ml) e aggiungere 10 equivalenti DIEA alla soluzione (Tabella 1).
  3. Aggiungi la miscela di resina e incubare per 300 sec (25 W, 75 ° C, tabella 2). Scolare la soluzione.
  4. Lavare la resina con DCM. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetete per tre volte.

6. fenditura e Deprotezione di Side catena Gruppi

  1. Lavare la resina con DCM ed etere etilico.
    1. Aggiungere DCM alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere due volte.
    2. Aggiungi etere etilico alla resina per 120 secondi (7 ml, 0 W, rt) e scaricare la soluzione. Ripetere due volte.
  2. Essiccare la resina in essiccatore sotto vuoto a temperatura ambiente per almeno 3 ore su idrossido di potassio (KOH, 1-10 g).
  3. Pesare la resina essiccata e trasferirlo ad una cartuccia polipropilene.
  4. Aggiungere 10 ml di acido trifluoroacetico un (TFA) cleavage cocktail pre-raffreddata (per esempio, 90% TFA, 2,5% di acqua, 2,5% e 5% TIS fenolo) per ogni grammo di resina.
  5. Agitare per 3 orea RT.
  6. Raccogliere la soluzione scissione TFA filtrando la resina in un tubo di polipropilene da 50 ml. Per la filtrazione, utilizzare la fritta che è nella cartuccia polipropilene 12 ml.
  7. Aggiungere dietiletere freddo (35 ml) al tubo.
  8. Centrifugare per 5 minuti a 1207 xg a 4 ° C.
  9. Decantare lo strato di etere.
  10. Ripetere il passaggio 6,7-6,9, cinque volte.

7. Asciugare il Backbone ciclico Peptide

  1. Mantenere il peptide precipitato nello stesso tubo e asciugare in una cappa per 30 min.
  2. Sciogliere il peptide in una miscela 1: 1 di acqua e acetonitrile (ACN).
  3. Congelare la soluzione finale del prodotto in azoto liquido.
  4. Lyophilize il prodotto finale.

8. Caratterizzazione Backbone ciclico Peptide

  1. Sciogliere un piccolo campione (1 mg) del prodotto in acqua (400 ml).
  2. Iniettare il peptide disciolto (10-200 microlitri) ad una fase inversa liquida ad alta prestazione chromatography sistema (RP-HPLC) a verificare la purezza 34 peptide.
  3. Controllare la massa del peptide usando la spettrometria di massa matrix-assisted laser desorbimento di ionizzazione (MALDI-MS) 84.
    1. Mescolare 1 ml (100 mM) peptide in un 1: 1 (v / v) di acetonitrile: acqua con 1 ml di matrice (acido 5 mg / ml, α-ciano-4-idrossicinnamico) in rapporto 1: 1 (v / v) di acetonitrile: acqua con TFA (0,1%).
    2. Spot 1 ml sulla piastra MS-MALDI.
    3. Asciugare il campione e collocarlo nello spettrometro di massa.
  4. Pesare il peptide e calcolare la resa per cento.
  5. Conservare a -20 ° C.

9. Monitoraggio della sintesi

  1. Kaiser (ninidrina) prova di 85
    1. Preparare le soluzioni dei reagenti.
      1. Preparare una soluzione sciogliendo 16,5 mg di cianuro di potassio (KCN) in 25 ml di acqua distillata. Diluire 1 ml della suddetta soluzione con 49 ml di piridina.
      2. Preparare la Soluzione Bsciogliendo 1 g di ninidrina in 20 ml di etanolo.
      3. Preparare Soluzione C sciogliendo 40 g di fenolo in 20 ml di etanolo.
    2. Utilizzare il test Kaiser per controllare il completamento dell'accoppiamento amminoacido o la deprotezione del gruppo protettivo.
      1. Trasferire alcune perle dalla resina in una provetta.
      2. Aggiungere tre gocce (~ 100 microlitri) di ciascuna soluzione (A, B e C) e mescolare.
      3. Riscaldare la provetta su una piastra riscaldante a 110 ° C per 5 min.
        Nota: perline colorate blu (risultato positivo) indicano reazione di accoppiamento incompleto o deprotezione Fmoc gruppo protettivo.
  2. Test cloranile 86
    1. Preparare i seguenti reagenti freschi per ogni test.
      1. Preparare una soluzione di 2% cloranile in DMF, la soluzione A.
      2. Preparare una soluzione di 2% acetaldeide in DMF, soluzione B.
    2. Eseguire il test cloranile per verificare il completamento di accoppiamento aminoacido o tha deprotezione del gruppo protettivo.
      1. Miscelare 100 ml di soluzione A con 100 ml di soluzione B in una provetta da 1,5 ml.
      2. Cada le perline e agitare delicatamente per 5 minuti.
        Nota: perline colorate marrone scuro (risultato positivo) indicano deprotezione del gruppo protettivo Fmoc o una reazione giunto incompleto.
  3. Reazione scissione piccola scala
    1. Rimuovere una piccola quantità di resina ad una cartuccia polipropilene 3 ml equipaggiato con spina tappo e rubinetto.
    2. Trattare con una miscela 2 ml di 95% TFA, 2,5% di acqua e 2,5% TIS.
    3. Agitare la miscela per 30 minuti a RT.
    4. Rimuovere la resina per filtrazione usando la fritta della cartuccia polipropilene ed evaporare i solventi da un flusso di azoto.
    5. Riprendere il residuo con acqua e analizzare il prodotto mediante HPLC e / o MS.

10. Leishmania donovani promastigote vitalità in Cultura Assay

  1. Leishmania donovani (L. donovani) condizioni di crescita e di trattamento
    1. Cultura L. promastigoti donovani in Modifica di Dulbecco di Eagle (DMEM) con 4,5 g / L di glucosio, L-glutammina, e piruvato di sodio a 26 ° C.
    2. Trattare la L. donovani promastigoti con peptidi ciclici (100 micron) per 24 ore a 26 ° C.
  2. Leishmania donovani (L. donovani) saggio di redditività
    1. Valutare la vitalità del parassita con 20 microlitri alamarBlue secondo il protocollo del produttore.
    2. Determinare riduzione alamarBlue la fluorescenza di misura (a 570 nm di eccitazione e 590 nm di emissione). Valori di fluorescenza più alti indicano maggiore attività metabolica e una maggiore vitalità del parassita.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui si descrive lo sviluppo di una piccola biblioteca mirata di backbone peptidi ciclici che colpiscono specificamente PPI vitali del parassita Leishmania e agiscono come agenti antiparassitari (per opinione su peptidi che colpiscono PPI come agenti antiparassitari 87). Attraverso la sintesi di nuovi backbone peptidi ciclici, farmacofori sono conservati in un ponteggio di dimensioni estensibile. La forza della biblioteca focalizzato qui proposto è la possibilità di variare le dimensioni peptide impal...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sintesi di una libreria mirata di backbone peptidi ciclici derivati ​​dalla proteina LACK del parassita Leishmania usando un forno a microonde sintetizzatore automatizzato è descritto. Una libreria concentrato di peptidi ciclici è stato sviluppato con farmacofori conservate e diversi linker. L'aggiunta di vari linker come anidride glutarica, anidride succinica, acido adipico, acido pimelico, lisina, ornitina, e altri blocchi può essere utilizzato per aumentare la varietà dello spazio conformazionale dei ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang, e Daria Mochly-Rosen per le discussioni utili. Il lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) per NQ I finanziatori non hanno avuti ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Solid support, resina Rink Amide AM MLCBLBR-1330caricamento: 0,49 mmol/g
Fmoc-Ala-OHAdvanced ChemtechFA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OHAdvanced ChemtechFR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OHAdvanced ChemtechFN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OHAvanzato ChemtechFD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OHAvanzato ChemtechFC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OHAvanzato ChemtechFQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OHAvanzato ChemtechFE2237
Fmoc-Gly-OHAvanzato ChemtechFG2275
Fmoc-His(Trt)-OHAvanzato ChemtechFH2316
Fmoc-Ile-OHAvanzato ChemtechFI2326
Fmoc-Leu-OHAvanzato ChemtechFL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OHAvanzato ChemtechFK2390
Fmoc-Met-OHAvanzato ChemtechFM2400
Fmoc-Phe-OHAvanzato ChemtechFF2425
Fmoc-Pro-OHChemtech avanzatoFP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OHChemtech avanzatoFS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OHChemtech avanzatoFT2518
Fmoc-TRP(Boc)-OHChemtech avanzatoFW2527
Fmoc-Tyr(But)-OHChemtech avanzatoFY2563
Fmoc-Val-OHChemtech avanzatoFV2575
1-metil-2-pirrolidinone (NMP)Sigma328634Attenzione Tossico/Altamente infiammabile/Irritante.
N,N-Dimetilformammide (DMF)Alfa Aesar43465Attenzione Tossico.
Utilizzare DMF di alta qualità per eliminare le reazioni collaterali come la rimozione di Fmoc a causa delle tracce di dimetilammina dalla decomposizione del DMF.
Diclorometano (DCM)SigmaD65100Attenzione
Dibromometano nocivo (DBM)SigmaD41868Caution Acido
trifluoroacetico nocivo (TFA)SigmaT62200<strong>Caution Acido trifluoroacetico corrosivo/tossico
grado HPLC (TFA)Sigma91707Attenzione Dietilete corrosivo/tossico
Sigma31690Attenzione Altamente infiammabile/Nocivo
Triisopropilsilano (TIS)Sigma233781Attenzione Acqua irritante/infiammabile
, grado HPLCSigma270733
Acetonitroile, grado HPLC (ACN)Fisher ScientificoA998-4Attenzione Infiammabile/Irritante/Nocivo
N,N-Diisopropiletilamina (DIEA)Sigma3440Attenzione Corrosivo/Altamente infiammabile
PiperidinaSigmaW290807Attenzione Tossico/Altamente infiammabile
PiridinaSigma270970Attenzione Altamente infiammabile/Dannoso
Etanolo (EtOH)Sigma459844Attenzione Altamente infiammabile/Irritante
1-Idrossibenzotriazolo idrato (HOBt)Sigma157260Attenzione Altamente infiammabile/Irritante/Nocivo
O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′ - tetrametiluronio esafluorofosfato (HBTU)Sigma12804Attenzione Irritante/Dannoso
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pirrolidinophosphonium esafluorphosphate (PyBOP)Advanced ChemtechRC8602Caution Irritante
NinidrinSigma454044Attenzione Dannoso
FenoloSigmaP3653Attenzione Corrosivo/Tossico
Cianuro di potassio (KCN)Sigma11813Attenzione Molto tossico
Idrossido di potassio (KOH)Sigma221473Attenzione Tossico
N,N' -Diisopropilcarbodiimmide (DIC)Sigma38370Caution Infiammabile/ Tossico
4-Dimetilamminopiridina (DMAP)Sigma522805Caution Tossico/Irritante
Anidride glutaricaSigmaG3806Caution Infiammabile/Irritante/Dannoso
Anidride succinicaSigma239690Caution Irritante/Nocivo
Acido adipicoSigmaA26357Caution Tossico/Irritante
Acido pimelicoSigmaP45001Caution Toxic/Irritant
ChloranilSigma23290Caution Toxic/Irritant
AcetaldeideSigma402788Attenzione Infiammabile/ Tossico
ATTREZZATURA
CentrifugaBeckman ColtroAllegra 6R Centrifuga
LiofilizzatoreLabconcofreezone 4.5
Pompa a vuotoFranklin Electricmodello 1101101416 con 3/4 HPAlcatel pompa con motore Franklin 
Cartuccia in polipropilene 12 mlSeparazione applicata2419
Tappo tappo per cartuccia in polipropilene da 12 mlSeparazione applicata8157
Cartuccia in polipropilene 3 mlSeparazione applicata2413
Tappo tappo per cartuccia in polipropilene da 3 mlSeparazione applicata8054
Rubinetti di arresto PTFESeparazione applicata2406
Provette piatte, 50 mlVWR21008-240
Collettore di estrazione, 20 pos, 16 provette da 100 mmAgitatoreWAT200609
Acque, BD adams Nutator mixerFisher scientific22363152
Nalgene HDPE bocca stretta IP2 bottiglie, 125  mlFisher scientific03-312-8
Pallone di ErlenmeyerFisher ScientificFB-501, 500 ml
Blocco riscaldanteThermolyne1760 dri bath Tubi
monouso in vetro borosilicato con estremità lisciaFisher Scientific14-961-25
Micropipette e puntali FinnpipetteThermo20– 200 e 100 1.000 μ
Fiale HPLC - Micro VL PP 400 & Micro; l PK100   VWR69400-124
Fiala HPLC - Tappo Snap-It BluVWR66030-600
Colonna analitica HPLCPeeke ScientificU1-5C18Q-JJultro 120 5 &; m C18Q, 4,6 mm ID 150 mm
Colonna HPLC di preparazione, XBridge AcqueOBD C18 5 &; colonna m19 mm & volte; 150 mm
Spettrometro di massaApplied BiosystemsVoyager DE-RP 
Essiccatore
per bombole
Sistema analitico RP-HPLC Shimadzu LC-20dotato di: controller di sistema CBM-20A, rivelatore SPD-20A, forno a colonna CTO-20A, 2 unità di erogazione solvente LC-20AD, autocampionatore SIL-20AC, degasatore DGU-20A5 (Shimadzu, MD, USA).
Sistema preparativo RP-HPLC Shimadzu LC-20dotato di: controller di sistema CBM-20A, rivelatore SPD-20A, forno a colonna CTO-20A, 2 unità di erogazione solvente LC-6AD e collettore di frazioni FRC-10A (Shimadzu, MD, USA).
, ldi azoto

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