Viene delineato un metodo semplice e generale per la sintesi di peptidi ciclici utilizzando l'irradiazione a microonde. Questa procedura consente la sintesi di peptidi ciclici della spina dorsale con una raccolta di diverse conformazioni mantenendo le catene laterali e le frazioni farmacoforiche., e quindi, consente lo screening della conformazione bioattiva.
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Articolo metodologico
Sviluppo di un Backbone ciclico Peptide Biblioteca come potenziale Antiparassitaria Therapeutics Uso Microonde irradiazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Interazioni proteina-proteina (PPI) sono intimamente coinvolti in quasi tutti i processi biologici e sono collegati a molte malattie umane. Pertanto, vi è un grande sforzo per PPI nella ricerca di base e del settore farmaceutico bersaglio. Interfacce proteina-proteina sono di solito grandi, piatti, e spesso non hanno le tasche, complicando la scoperta di piccole molecole che hanno come target tali siti. Approcci di targeting alternativi utilizzando anticorpi hanno delle limitazioni dovute alla scarsa biodisponibilità orale, a bassa permeabilità cellulare, e inefficienza della produzione.
Utilizzo di peptidi per indirizzare le interfacce PPI ha diversi vantaggi. Peptidi hanno una maggiore flessibilità conformazionale, una maggiore selettività, e sono generalmente poco costoso. Tuttavia, i peptidi hanno i loro limiti, tra cui scarsa stabilità e inefficienza attraversare le membrane cellulari. Per superare tali limitazioni, peptide ciclizzazione può essere eseguita. Ciclizzazione ha dimostrato di migliorare la selettività peptide, Stabilità metabolica e biodisponibilità. Tuttavia, prevedere la conformazione bioattiva di un peptide ciclico non è banale. Per superare questa sfida, un attraente approccio a schermo una libreria mirato per schermo in cui tutti i peptidi ciclici backbone hanno la stessa sequenza primaria, ma si differenziano per i parametri che influenzano la loro conformazione, come la dimensione e la posizione dell'anello.
Descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi di una libreria di backbone peptidi ciclici mirati specifici PPI parassita. Utilizzando un approccio progettuale razionale, abbiamo sviluppato peptidi derivati dalla proteina patibolo recettore L eishmania per C attivata-chinasi (mancanza). Abbiamo ipotizzato che le sequenze in MANCANZA che si conservano nei parassiti, ma non nel omologo mammifero ospite, possono rappresentare siti di interazione per le proteine che sono fondamentali per la vitalità dei parassiti. I peptidi ciclici sono stati sintetizzati utilizzando irradiazione a microonde per ridurre i tempi di reazione e aumentareefficienza. Lo sviluppo di una libreria di backbone peptidi ciclici con misure degli anelli diversi facilita una schermata sistematica per la conformazione attiva più biologica. Questo metodo fornisce un modo generale, veloce e facile da sintetizzare peptidi ciclici.
Introduzione
Interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale nella maggior parte dei processi biologici, da intracellulare trasduzione del segnale di morte cellulare 1. Quindi, il targeting PPI è di fondamentale importanza per la ricerca di base e applicazioni terapeutiche. PPI possono essere regolate da anticorpi specifici e stabili, ma anticorpi sono costosi e difficili da produrre e hanno scarsa biodisponibilità. In alternativa, PPI possono essere bersaglio di piccole molecole. Piccole molecole sono più facili da sintetizzare e poco costoso rispetto agli anticorpi; tuttavia, sono relativamente meno flessibili e si adattano meglio piccole cavità di....
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Protocollo
1. Attrezzature e reagenti Preparazione
- Attrezzature Preparazione
- Eseguire tutti i passaggi all'interno di una cappa aspirante con un equipaggiamento di protezione personale.
- Chimicamente sintetizzare peptidi su supporto solido con un microonde Peptide Synthesizer con un modulo aggiuntivo di Discover dotato di una sonda di temperatura a fibre ottiche per il controllo della erogazione microonde alimentazione in un recipiente di reazione Teflon (30 ml, con una fritta di vetro) o in polipropilene monouso Cartuccia (12 ml, con una fritta ruvida).
- Per una corretta miscelazione, collegare l'alimentazione di azoto al recipient....
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Risultati
Qui si descrive lo sviluppo di una piccola biblioteca mirata di backbone peptidi ciclici che colpiscono specificamente PPI vitali del parassita Leishmania e agiscono come agenti antiparassitari (per opinione su peptidi che colpiscono PPI come agenti antiparassitari 87). Attraverso la sintesi di nuovi backbone peptidi ciclici, farmacofori sono conservati in un ponteggio di dimensioni estensibile. La forza della biblioteca focalizzato qui proposto è la possibilità di variare le dimensioni peptide impal.......
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Discussione
La sintesi di una libreria mirata di backbone peptidi ciclici derivati dalla proteina LACK del parassita Leishmania usando un forno a microonde sintetizzatore automatizzato è descritto. Una libreria concentrato di peptidi ciclici è stato sviluppato con farmacofori conservate e diversi linker. L'aggiunta di vari linker come anidride glutarica, anidride succinica, acido adipico, acido pimelico, lisina, ornitina, e altri blocchi può essere utilizzato per aumentare la varietà dello spazio conformazionale dei .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang, e Daria Mochly-Rosen per le discussioni utili. Il lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) per NQ I finanziatori non hanno avuti ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Solid support, resina Rink Amide AM ML | CBL | BR-1330 | caricamento: 0,49 mmol/g |
| Fmoc-Ala-OH | Advanced Chemtech | FA2100 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Advanced Chemtech | FR2136 | |
| Fmoc-Asn(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FN2152 | |
| Fmoc-Asp(OBut)-OH | Avanzato Chemtech | FD2192 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Avanzato Chemtech | FC2214 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | Avanzato Chemtech | FQ2251 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Avanzato Chemtech | FE2237 | |
| Fmoc-Gly-OH | Avanzato Chemtech | FG2275 | |
| Fmoc-His(Trt)-OH | Avanzato Chemtech | FH2316 | |
| Fmoc-Ile-OH | Avanzato Chemtech | FI2326 | |
| Fmoc-Leu-OH | Avanzato Chemtech | FL2350 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | Avanzato Chemtech | FK2390 | |
| Fmoc-Met-OH | Avanzato Chemtech | FM2400 | |
| Fmoc-Phe-OH | Avanzato Chemtech | FF2425 | |
| Fmoc-Pro-OH | Chemtech avanzato | FP2450 | |
| Fmoc-Ser-(tBu)-OH | Chemtech avanzato | FS2476 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | Chemtech avanzato | FT2518 | |
| Fmoc-TRP(Boc)-OH | Chemtech avanzato | FW2527 | |
| Fmoc-Tyr(But)-OH | Chemtech avanzato | FY2563 | |
| Fmoc-Val-OH | Chemtech avanzato | FV2575 | |
| 1-metil-2-pirrolidinone (NMP) | Sigma | 328634 | Attenzione Tossico/Altamente infiammabile/Irritante. |
| N,N-Dimetilformammide (DMF) | Alfa Aesar | 43465 | Attenzione Tossico. Utilizzare DMF di alta qualità per eliminare le reazioni collaterali come la rimozione di Fmoc a causa delle tracce di dimetilammina dalla decomposizione del DMF. |
| Diclorometano (DCM) | Sigma | D65100 | Attenzione |
| Dibromometano nocivo (DBM) | Sigma | D41868 | Caution Acido |
| trifluoroacetico nocivo (TFA) | Sigma | T62200< | strong>Caution Acido trifluoroacetico corrosivo/tossico |
| grado HPLC (TFA) | Sigma | 91707 | Attenzione Dietilete corrosivo/tossico |
| Sigma | 31690 | Attenzione Altamente infiammabile/Nocivo | |
| Triisopropilsilano (TIS) | Sigma | 233781 | Attenzione Acqua irritante/infiammabile |
| , grado HPLC | Sigma | 270733 | |
| Acetonitroile, grado HPLC (ACN) | Fisher Scientifico | A998-4 | Attenzione Infiammabile/Irritante/Nocivo |
| N,N-Diisopropiletilamina (DIEA) | Sigma | 3440 | Attenzione Corrosivo/Altamente infiammabile |
| Piperidina | Sigma | W290807 | Attenzione Tossico/Altamente infiammabile |
| Piridina | Sigma | 270970 | Attenzione Altamente infiammabile/Dannoso |
| Etanolo (EtOH) | Sigma | 459844 | Attenzione Altamente infiammabile/Irritante |
| 1-Idrossibenzotriazolo idrato (HOBt) | Sigma | 157260 | Attenzione Altamente infiammabile/Irritante/Nocivo |
| O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′ - tetrametiluronio esafluorofosfato (HBTU) | Sigma | 12804 | Attenzione Irritante/Dannoso |
| Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pirrolidinophosphonium esafluorphosphate (PyBOP) | Advanced Chemtech | RC8602 | Caution Irritante |
| Ninidrin | Sigma | 454044 | Attenzione Dannoso |
| Fenolo | Sigma | P3653 | Attenzione Corrosivo/Tossico |
| Cianuro di potassio (KCN) | Sigma | 11813 | Attenzione Molto tossico |
| Idrossido di potassio (KOH) | Sigma | 221473 | Attenzione Tossico |
| N,N' -Diisopropilcarbodiimmide (DIC) | Sigma | 38370 | Caution Infiammabile/ Tossico |
| 4-Dimetilamminopiridina (DMAP) | Sigma | 522805 | Caution Tossico/Irritante |
| Anidride glutarica | Sigma | G3806 | Caution Infiammabile/Irritante/Dannoso |
| Anidride succinica | Sigma | 239690 | Caution Irritante/Nocivo |
| Acido adipico | Sigma | A26357 | Caution Tossico/Irritante |
| Acido pimelico | Sigma | P45001 | Caution Toxic/Irritant |
| Chloranil | Sigma | 23290 | Caution Toxic/Irritant |
| Acetaldeide | Sigma | 402788 | Attenzione Infiammabile/ Tossico |
| ATTREZZATURA | |||
| Centrifuga | Beckman Coltro | Allegra 6R Centrifuga | |
| Liofilizzatore | Labconco | freezone 4.5 | |
| Pompa a vuoto | Franklin Electric | modello 1101101416 con 3/4 HP | Alcatel pompa con motore Franklin |
| Cartuccia in polipropilene 12 ml | Separazione applicata | 2419 | |
| Tappo tappo per cartuccia in polipropilene da 12 ml | Separazione applicata | 8157 | |
| Cartuccia in polipropilene 3 ml | Separazione applicata | 2413 | |
| Tappo tappo per cartuccia in polipropilene da 3 ml | Separazione applicata | 8054 | |
| Rubinetti di arresto PTFE | Separazione applicata | 2406 | |
| Provette piatte, 50 ml | VWR | 21008-240 | |
| Collettore di estrazione, 20 pos, 16 provette da 100 mm | Agitatore | WAT200609 | |
| Acque, BD adams Nutator mixer | Fisher scientific | 22363152 | |
| Nalgene HDPE bocca stretta IP2 bottiglie, 125 ml | Fisher scientific | 03-312-8 | |
| Pallone di Erlenmeyer | Fisher Scientific | FB-501, 500 ml | |
| Blocco riscaldante | Thermolyne | 1760 dri bath Tubi | |
| monouso in vetro borosilicato con estremità liscia | Fisher Scientific | 14-961-25 | |
| Micropipette e puntali Finnpipette | Thermo | 20– 200 e 100 1.000 μ | |
| Fiale HPLC - Micro VL PP 400 & Micro; l PK100 | VWR | 69400-124 | |
| Fiala HPLC - Tappo Snap-It Blu | VWR | 66030-600 | |
| Colonna analitica HPLC | Peeke Scientific | U1-5C18Q-JJ | ultro 120 5 &; m C18Q, 4,6 mm ID 150 mm |
| Colonna HPLC di preparazione, XBridge | Acque | OBD C18 5 &; colonna m | 19 mm & volte; 150 mm |
| Spettrometro di massa | Applied Biosystems | Voyager DE-RP | |
| Essiccatore | |||
| per bombole | |||
| Sistema analitico RP-HPLC Shimadzu LC-20 | dotato di: controller di sistema CBM-20A, rivelatore SPD-20A, forno a colonna CTO-20A, 2 unità di erogazione solvente LC-20AD, autocampionatore SIL-20AC, degasatore DGU-20A5 (Shimadzu, MD, USA). | ||
| Sistema preparativo RP-HPLC Shimadzu LC-20 | dotato di: controller di sistema CBM-20A, rivelatore SPD-20A, forno a colonna CTO-20A, 2 unità di erogazione solvente LC-6AD e collettore di frazioni FRC-10A (Shimadzu, MD, USA). |
Riferimenti
- Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450 (7172), 1001-1009 (2007).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing....
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Ristampe e permessi
