Articolo metodologico

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

DOI:

10.3791/53604

⸱

5 febbraio 2016

 ,  ,  , 
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

In questo articolo

Sommario

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Abbiamo stabilito il sistema fotoconvertibile PSmOrange come uno strumento potente, diretto e poco costoso per il tracciamento cellulare in vivo in sfondi transgenici GFP. Questo protocollo descrive la sua applicazione nel sistema modello di zebrafish.

Abstract

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Il rapido sviluppo di embrioni trasparenti di pesce zebra (Danio rerio) in combinazione con l'etichettatura fluorescente di cellule e tessuti permette di visualizzare i processi di sviluppo mentre avvengono nell'animale vivente. Le cellule di interesse possono essere marcate utilizzando un promotore tessuto-specifico per guidare l'espressione di una proteina fluorescente (FP) per la generazione di linee transgeniche. L'utilizzo di proteine fotoconvertibili fluorescenti per questo scopo consente inoltre di seguire con precisione strutture definite all'interno del dominio di espressione. Illuminando la proteina nella regione di interesse, cambia il suo spettro di emissione ed evidenzia una particolare cellula o ammasso cellulare lasciando altre cellule transgeniche nel loro colore originale. Una delle principali limitazioni è la mancanza di promotori noti per un gran numero di tessuti nel pesce zebra. Al contrario, gli screening di trappole geniche e enhancer hanno generato enormi risorse transgeniche etichettando discretamente letteralmente tutte le strutture embrionali per lo più con GFP o, in misura minore, FP rosse o gialle. Un approccio per seguire strutture definite in tali background transgenici sarebbe quello di introdurre anche una proteina fotoconvertibile ubiquitaria, che potrebbe essere convertita nella cellula o nelle cellule di interesse. Tuttavia, le proteine fotoconvertibili disponibili comportano uno stato di emissione verde e/o meno frequentemente uno stato di emissionerosso 1 e quindi spesso non possono essere utilizzate per tracciare le cellule nel fondo FP delle linee transgeniche esistenti. Per aggirare questo problema, abbiamo istituito il sistema PSmOrange per il pesce zebra2,3. Una semplice microiniezione di mRNA sintetico che codifica una forma nucleare di questa proteina marca tutti i nuclei cellulari con fluorescenza arancione/rossa. Dopo la fotoconversione mirata della proteina, cambia il suo spettro di emissione in rosso lontano. L'efficienza quantistica e la stabilità della proteina rendono PSmOrange un eccellente strumento di tracciamento cellulare per il pesce zebra e possibilmente per altre specie di teleostei.

Introduzione

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Le tecniche di imaging che migliorano esponenzialmente consentono di seguire i processi di sviluppo per periodi di tempo fino a circa quattro giorni consecutivi3. Nel pesce zebra e in molti altri sistemi modello animale, cellule specifiche, tessuti, strutture assonali o vascolari sono contrassegnati da proteine fluorescenti transgeniche verdi o talvolta rosse o gialle per facilitare la visualizzazione. Tuttavia, nella maggior parte delle linee transgeniche il transgene non è espresso in modo specifico nelle cellule di interesse, ma anche in strutture aggiuntive, il che ostacola il tracciamento preciso, ad esempio, di singole cellule o gruppi di cellule.

Le proteine fotoconvertibili fluorescenti sono adatte per il tracciamento cellulare durante lo sviluppo embrionale. I prerequisiti per l'applicazione di tali proteine sono una natura di lunga durata, un intervallo di emissione ben separato al momento della conversione e una fluorescenza brillante. Le proteine fotoconvertibili disponibili comprendono quelle che cambiano il loro intervallo di emissione dopo la conversione, come Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 o Dendra27 e altre che sono fluorescenti solo quando fotoattivate (PAmCherry8, PAGFP9 o PATagRFP10). Le loro applicazioni per tracciare le cellule negli animali transgenici FP esistenti sono tuttavia limitate in quanto spesso comportano uno stato fluorescente verde o non soddisfano tutti i criteri di cui sopra. Solo di recente, Subach e colleghi hanno riportato la proteina PSmOrange, che cambia la sua emissione da arancione/rosso a rosso lontano dopo la fotoconversione ed è stata applicata con successo nelle cellule in coltura e nelle cellule coltivate iniettate nei topi2.

Per studiare l'idoneità della proteina per il tracciamento cellulare in un embrione vivente, abbiamo generato un costrutto di espressione per la microiniezione di H2B-PSmOrange marcato con tag nucleare in embrioni di pesce zebra. Abbiamo scoperto che la proteina soddisfa tutti i prerequisiti per il successo del tracciamento cellulare in background transgenici GFP durante i primi 4 (e forse più) giorni di sviluppo embrionale del pesce zebra. Durante questo periodo, la maggior parte degli eventi migratori cellulari vengono completati nei pesci, rendendo il sistema PSmOrange un'eccellente aggiunta al kit di strumenti per i pesci zebra.

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Protocollo

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1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro trascrizione e mRNA Purification

  1. Linearizzare il H2B-PSmOrange contenente pCS2 + plasmide con l'enzima di restrizione NotI secondo le istruzioni del produttore.
    Nota: eseguire i passi successivi utilizzando adeguate protezioni quali guanti e camice da laboratorio per evitare la contaminazione mRNA e il degrado.
  2. Purificare il DNA linearizzato utilizzando un kit di purificazione o di fenolo-cloroformio PCR metodi basati secondo protocolli produttori.
  3. Utilizzare 1 mg di DNA modello linearizzato per Sp6-mRNA trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
  4. Rimuovere DNA con l'aggiunta di 1,0 U RNasi libero DNasiI per 10-20 minuti a 37 ° C.
  5. Pulire l'mRNA utilizzando un RNA ripulire kit secondo il protocollo del produttore.
  6. Per aumentare mRNA purezza e la concentrazione, precipitare l'mRNA aggiungendo 6 microlitri di acetato di sodio (3,0 M, pH 5,2) e 150 microlitri 96% di etanolo. Incubare il msoluzione ixed a -20 ° C per almeno 30 minuti e fino a 24 ore.
  7. Raccogliere il mRNA facendo girare la soluzione a 18,407 xg per 45 min a 4 ° C. Eliminare il liquido e risospendere il mRNA in 150 ml 70% di etanolo. Mescolare e centrifugare la soluzione per altri 15 min a 4 ° C. Eliminare il liquido, asciugare il pellet per 5 minuti in ghiaccio e risospendere il mRNA in 20 microlitri ultrapura RNasi acqua libera.
  8. Valutare la concentrazione e la purezza del mRNA mediante misurazione fotometrica di una diluizione 1: 100 di mRNA (1 ml mRNA in 99 microlitri ultrapura RNasi acqua libera).
  9. Per la conservazione a breve termine, mantenere la soluzione mRNA a -20 ° C. Per la conservazione a lungo termine, mantenere l'mRNA a -80 ° C.

2. H2B-PSmOrange mRNA microiniezione in embrioni di zebrafish

  1. Impostare accoppiamento coppie la sera prima iniezione utilizzando tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) doppio pesci transgenici (o qualsiasi altro pesce transgenico GFP). Lasciare il pesce separato inserendo un distanziatoretra di essi per controllare il tempo di accoppiamento.
  2. Rimuovere il distanziale di mattina di iniezione e lasciare che il compagno di pesce per 20 minuti.
  3. Durante il tempo di accoppiamento, diluire il H2B-PSmOrange mRNA alla concentrazione finale di 130 pg / nl (in RNasi acqua libera) e il trasferimento 6 ml soluzione per l'iniezione in un capillare microiniezione utilizzando una punta microloader. Controllare il volume di iniezione con un vetrino calibrato. Regolare la pressione di iniezione per iniettare 2 soluzione di mRNA nl (260 pg).
  4. Raccogliere le uova in una piastra di Petri di plastica sterilizzati contenente 1x Embryo (E3) di media.
  5. Trasferimento da 20 a 30 embrioni per un piatto di iniezione con una pipetta di plastica Pasteur.
  6. Iniettare 2 mRNA nl contenenti soluzione nella cella o appena sotto la cella nel tuorlo allo stadio unicellulare 11.
  7. Trasferire gli embrioni iniettato in una piastra di Petri contenente medio 1x E3, rimuovere gli embrioni normalmente in via di sviluppo non fecondate o meno e crescere a 28 ° C.
    Nota: la protezione della luce of embrioni non è richiesto durante l'esperimento.
  8. Sollevare embrioni di zebrafish in media 1x E3 e aggiungere 0,2 mM PTU (1-fenil-2 tiourea) dopo gastrulation per inibire la pigmentazione. Cambiare il mezzo due volte al giorno per minimizzare il rischio di contaminazioni batteriche.

3. Embrione Embedding

  1. Selezionare la GFP (verde) e PSmOrange (arancione / rosso) embrioni co-esprimono usando un microscopio binoculare dotato di una lampada a fluorescenza e filtri di emissione adeguati. Trasferire gli embrioni positivi in ​​una piastra di Petri sterile contenente medio 1x E3.
  2. Embrioni Dechorionate sotto uno stereomicroscopio con pinze 12.
  3. Trasferimento un embrione in una provetta da 1,5 ml contenente 1,0 ml di pre-riscaldato 1,0% agarosio basso punto di fusione (LMA) preparato in acqua ultrapura utilizzando una pipetta di cut-tip (P200). Nota: Riscaldare la LMA a 80 ° C e raffreddare per 3-5 minuti a temperatura ambiente prima di incorporare l'embrione.
  4. Trasferire l'embrione in 150 ml LMA in unchambered coprioggetti e regolare l'orientamento dell'embrione, ad esempio lato dorsale giù nell'esperimento descritto per la invertita laser confocale microscopio a scansione A1R + (o qualsiasi altro microscopio adatto), utilizzando una punta plastica fine. Quando la LMA è polimerizzato, riempire la camera con pesci d'acqua contenente 0,2 mM PTU e 0,02% di etile 3 amminobenzoato methansulfonate (Tricaine) per l'anestesia.
  5. Prima di imaging del campione, attendere 15 min per accertare l'effetto di Tricaine. L'anestesia impedisce i movimenti di embrioni, che possono essere monitorati utilizzando uno stereomicroscopio dotato di illuminazione campo chiaro.
    Nota: Le camere possono essere riutilizzati due volte.

4. PSmOrange Fotoconversione

  1. Posizionare il campione sotto il microscopio confocale e scansione dei campioni per identificare l'area da photoconvert utilizzando 488 nm e 561 nm laser per l'imaging rispettivamente GFP e PSmOrange.
    Nota: Utilizzare il invertito confocale a scansione laser microscopio A1R + sul STA invertitage TiEcontrolled dal software di imaging del microscopio e dotato di 488 nm, 561 nm e 640 nm laser per fotoconversione e di imaging. Tuttavia, l'applicazione non è certamente limitato a questo microscopio finché le linee laser per la conversione e l'imaging sono disponibili.
    1. Mettere l'obiettivo di aria 20X in posizione (NA: 0,75; WD: 1,0 mm, FOV: 0,64 x 0,64 mm).
    2. Utilizzare le seguenti impostazioni microscopio per rilevare la proteina PSmOrange prima fotoconversione: 561 nm laser, 0.74 mW misurata in corrispondenza del piano di messa a fuoco sopra l'obiettivo.
      Nota: Questo corrisponde al 40% su questo sistema (misura nel piano focale è l'unico modo per determinare la potenza effettiva). Regolare la potenza del laser in base alle esigenze sperimentali come l'efficienza delle iniezioni H2B-PSmOrange può variare.
    3. Aggiungere fattori di zoom per evidenziare l'area di interesse. ingrandimenti maggiori riducono i tempi di acquisizione delle immagini e quindi fototossicità.
  2. Acquisire un z-stack che copre la strutturas di interesse utilizzando 488 nm e 561 nm laser in modalità sequenziale (modalità riga 1-> 4). Fissare la z-passo tra 1,0 e 2,0 micron. media e la frequenza di scansione possono essere utilizzate per ottimizzare la qualità dell'immagine.
  3. Scansione campione e seleziona la regione di interesse utensile (ROI) per evidenziare la zona per photoconvert. Fissare il ROI come area di stimolazione. Selezionare il modulo Photo Attivazione / candeggio, attivare il laser 488 nm selezionando la rispettiva casella e impostare il laser 488 nm a 80% (1 mW potenza laser misurato allo scopo). Impostare la velocità di scansione di 0,5 sec / Frame.
  4. Aprire l'utilità fotoconversione (ND Stimulation) e specificare le impostazioni fotoconversione.
    1. Fare clic sul comando "Aggiungi" per specificare il protocollo fotoconversione.
    2. Impostare "Fase" 1 nel menu "acquisizione / stimolazione" a "Acquisizione" e indicare il numero di immagini da acquisire prima fotoconversione nel menu "Loop".
    3. Impostare "Fase" 2 su "Stimulation "e inserire il numero di eventi di stimolazione da eseguire.
    4. Regolare "Fase" 3 come descritto per "Fase" 1. Facoltativamente, inserire una attesa "Fase" dopo "Fase" 2 inserendo il tempo di attesa prima che l'ultimo round di acquisizione delle immagini.
    5. Una volta impostati tutti i parametri, applicare l'impostazione stimolazione ed eseguire il fotoconversione.
      Nota: potenza del laser, la frequenza di scansione e numero di iterazioni per ogni turno di fotoconversione può variare e differiscono da embrione embrione. Un ambiente per cominciare è mostrato in Tabella 1.
  5. Acquisire un z-stack finale utilizzando 488 nm, 561 nm e 640 nm laser che applicano le impostazioni come sopra. Impostare il laser 640 nm per visualizzare la PSmOrange convertito con alto potere del laser (fino a 4,5 mW).

5. Smontare embrione da LMA

  1. Rimuovere l'embrione camera di contenimento dal microscopio. Rimuovere con attenzione l'embrione dalla u agarosiocantare pinze.
  2. Trasferire l'embrione in una nuova plastica sterilizzati petri-piatto o in un 6-pozzetti-sterilizzati contenente 1x E3 e 0,2 mM PTU. Incubare l'embrione a 28 ° C fino alla fase di sviluppo desiderato.

6. Analizzando il destino di Photoconverted PSmOrange proteine ​​cellule che esprimono

  1. Re-inserire l'embrione come descritto ai punti 3.3 e 3.4.
  2. Posizionare il campione sotto il microscopio confocale e la scansione del campione per identificare le cellule photoconverted (640 nm) nella struttura transgenico GFP di interesse (488 nm).
  3. Acquisire un z-stack che copre le strutture di interesse utilizzando 488 nm, 561 nm e 640 nm laser in modalità sequenziale (modalità riga 1-> 4). Fissare la z-passo tra 1,0 e 2,0 micron. media e la frequenza di scansione possono essere utilizzate per ottimizzare la qualità dell'immagine.
  4. Utilizzare uno dei seguenti metodi per identificare le cellule, che GFP co-express e la proteina photoconverted.
    1. Una soluzione su misura automatica Fiji ImmagineJ 3 Macro
      1. Convolve lo stack originale utilizzando il plugin "GaussianBlur" (→ Processo → Filtri → GaussianBlur) e sottrarre le pile lisce dall'originale utilizzando il plug-in "Immagine calcolatore" (→ Processo → calcolatore di immagine). Utilizzare questo passaggio per visualizzare le strutture di interesse e di ridurre il tempo di calcolo per l'analisi.
      2. Applicare soglie specifiche per i canali verde e lontano-rosso al fine di evidenziare le cellule photoconverted (→ Immagine → Regola → Soglia). Utilizzare lo strumento "Analisi Particelle" per rilevare le aree di soglia con un ambiente adatto (→ Analisi → Analisi Particelle).
      3. Aprire il plugin "immagine Calcolatore" e visualizzare i ROI sovrapposte nel canale verde e lontano-rosso in giallo (→ Processo → Immagine Calculator).
    2. software di imaging Microscopio per la valutazione dei dati 3D
      1. Visualizzare lo stack in3D utilizzando l'opzione di visualizzazione Mostra volume (→ Visualizzazione 3D Menu → Visualizza Volume View). Utilizzare l'interfaccia grafica per selezionare i canali verde, rosso e rosso lontano, regolare la luminosità ed il contrasto e ritagliare stack 3D per evidenziare l'area photoconverted (Figura 1).
        Nota: Metodi simili per analizzare sono disponibili i dati nella maggior parte del software comune per l'analisi delle immagini.

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Risultati

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La Figura 1 illustra un esempio del sistema PSmOrange fotoconversione. Il complesso pineale è una struttura conservata nel diencefalo dorsali vertebrati. Come in molti altri vertebrati, il complesso costituito dall'organo pineale nel centro del diencefalo e le cellule parapineal sinistre. Elegante ma in termini di tempo esperimenti uncaging hanno dimostrato che le cellule parapineal hanno origine nella parte anteriore dell'organo pineale 13. In tg (foxD3: GFP)...

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Discussione

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embrioni transgenici portatori giornalisti fluorescenti hanno contribuito fondamentalmente a comprendere lo sviluppo embrionale. Tuttavia, vi è ancora la necessità essenziale per i promotori per facilitare la visualizzazione specifica di particolari strutture. In loro assenza, i ricercatori si basano su tecniche come la fotoconversione di proteine ​​fluorescenti per scoprire l'origine e lo sviluppo della loro struttura di interesse. Questo a sua volta è un prerequisito fondamentale per identificare i meccanismi mole...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo O. Subach per aver fornito il plasmide H2B-PSmOrange originale e il nostro team di strutture ittiche per la cura dei pesci. Siamo grati al Nikon Imaging Center dell'Università di Heidelberg per l'accesso alle apparecchiature di microscopia e al software di analisi. Ringraziamo il supporto della Core Facility Live Cell Imaging Mannheim presso il CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Questo lavoro è stato supportato da Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), dall'Università di Heidelberg al C.A.B. e dalla Facoltà di Medicina di Mannheim dell'Università di Heidelberg e dal DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 e 298/6-1) al M.C.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di purificazione PCRQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit di trascrizioneAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kitQiagen74204
Plastic Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920Il plasmide descritto nel documento è disponibile nel laboratorio Carl
Microiniettore FemtoJetEppendorf5247 000.013
Pinze (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH GermaniaNo Number
Nikon PLAN Apo λ 20X obiettivo aereo Nikon GmbH GermaniaSenza Numero
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)Nikon GmbH Germania/Imaging di laboratorioSenza Numero

Riferimenti

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