La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo basato sulla rilevazione immunoistologica della proteina c-FOS, una tecnica classica utilizzata per l'identificazione di popolazioni neuronali coinvolte in specifiche risposte fisiologiche in vivo ed ex vivo.

Abstract

Molti studi cercano di identificare e mappare le regioni del cervello coinvolte nella specifica normativa fisiologici. I c-fos proto-oncogene, un gene precoce immediato, è espressa nei neuroni in risposta a vari stimoli. Il prodotto proteina può essere facilmente rilevata con tecniche immunoistochimiche volti all'utilizzo di rilevamento c-FOS mappare gruppi di neuroni che mostrano cambiamenti nella loro attività. In questo articolo, ci siamo concentrati sull'individuazione di tronco cerebrale neuronale popolazioni coinvolte nell'adattamento ventilatoria all'ipossia o ipercapnia. Due approcci sono stati descritti per identificare popolazioni neuronali coinvolte in vivo negli animali e ex vivo nelle preparazioni del tronco deafferented. In vivo, gli animali sono stati esposti a miscele di gas ipercapnici o ipossia. Ex vivo, i preparativi sono stati deafferented superfused con ipossia o liquido cerebrospinale artificiale ipercapnica. In entrambi i casi, sia il controllo in animali in vivo o ex vivo i preparativi sono stati mantenuti in condizioni normossiche e normocapnica. Il confronto di questi due approcci permette di determinare l'origine del cioè attivazione neuronale, periferica e / o centrale. In vivo ed ex vivo, sono stati raccolti brainstems, fissi, e tagliati in sezioni. Una volta che le sezioni sono state preparate, rilevazione immunoistochimica della proteina c-FOS è stato fatto per identificare i gruppi tronco di cellule attivate da stimoli ipossici o ipercapnici. cellule marcate sono state contate in strutture respiratori del tronco cerebrale. Rispetto alla condizione di controllo, ipossia o ipercapnia aumentato il numero di cellule marcate c-FOS in diversi siti del tronco specifici che sono in tal modo costitutiva dei percorsi neuronali coinvolti nella adattamento del drive respiratorio centrale.

Introduzione

Il gene fos c- è stato identificato per la prima volta all'inizio del 1980 ^1,2 e il suo prodotto è stato caratterizzato nel 1984 come una proteina nucleare avente proprietà gene-attivatore ^3,4. Partecipa a meccanismi a lungo termine associati con la stimolazione dei neuroni. Infatti, cambiamenti nell'attività neuronale portano a seconda cascata di segnalazione messaggero che inducono l'espressione dei geni immediati precoce c-fos, che induce la produzione del fattore di trascrizione c-FOS. Quest'ultima avvia l'espressione dei geni tardivi e partecipa quindi in risposta adattativa del sistema nervoso a divers....

Protocollo

Nota: rilevamento c-FOS è una procedura standardizzata coinvolge diversi passaggi (Figura 1). Tutti gli esperimenti sono stati condotti su ratti o topi. protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Etico in esperimenti su animali Charles Darwin (CE5 / 2011/05), fatta in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 22 Settembre 2010 (2010/63 / UE) per la cura degli animali, e condotte in conformità con le leggi francesi per la cura degli animali.

1. preparazione di soluzioni

1. Preparare tampone fosfato 0.2 M di sodio: aggiungere 6,24 g di NaH ₂ PO ₄ * 2H <....

Risultati

Il rilevamento c-FOS è un utile strumento che consente a gruppi identificativi di cellule attivate in condizioni specifiche come ipossia e ipercapnia in vivo (Figura 2A) o in situazioni che imitano queste condizioni ex vivo (Figura 2B). In vivo, neonato, giovane o roditori adulti sono stati posti in un contenitore ermetico in cui l'ambiente gassoso viene continuamente rinnovata da una miscela di gas con una composizione def.......

Discussione

C-fos è un gene precoce immediato, e il rilevamento del suo prodotto, la proteina c-FOS, viene classicamente utilizzati per identificare popolazioni neuronali coinvolti nelle risposte respiratorie specifici in vivo ed ex vivo ^{11,13,25,28 16-18, 27,32,33.}

I passaggi critici all'interno del protocollo

Fare attenzione durante la fase di perfusione. La soluzione PFA 4% deve essere.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra per coltura cellulare a 12 pozzetti	Costa	35/3
Inserti Netwell da 15 mm con membrana in poliestere a rete	Corning	3477	Gli inserti a pozzetto da 15 mm di diametro hanno 74µ m fondi in rete di poliestere attaccati a inserti in polistirene
Anticorpo primario (anticorpo policlonale di coniglio contro la proteina c-Fos)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(anticorpo secondario IgG di coniglio)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldeide	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polivinil-pirrolidone	Sigma	PVP-360
Saccarosio	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Glicole etilenico	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidina tetracloridrato	Rockland	DAB50
Solfato di nichel ammonio	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xilene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Termoscientifico	1014356190	Superfrost ultraplus
Vetro	di copertura Termoscientifico	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153