approcci optogenetic sono ampiamente utilizzati per manipolare l'attività neurale e valutare le conseguenze per le funzioni cerebrali. Qui, una tecnica è descritto che dopo espressione in vivo dell'attivatore ottica channelrhodopsin, consente ex vivo analisi delle proprietà sinaptici di specifici gittata e connessioni neurali locali in circuiti paura correlati.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette
In questo articolo
Sommario
Abstract
approcci optogenetic sono ora ampiamente usati per studiare la funzione di popolazioni neuronali e circuiti combinando espressione mirata di proteine luce-attivati e successiva manipolazione dell'attività neurale dalla luce. Channelrhodopsins (CHRS) sono cationi canali luce-dipendenti e quando fuso con una proteina fluorescente loro espressione permette la visualizzazione e l'attivazione simultanea di specifici tipi cellulari e le loro proiezioni assonale in aree definite del cervello. Via iniezione stereotassica di vettori virali, proteine di fusione CHR possono essere costitutivamente o condizionatamente espressi in cellule specifiche di una regione del cervello definito, e le loro proiezioni assonale possono essere successivamente studiato anatomicamente e funzionalmente via ex vivo attivazione optogenetic in fettine di cervello. Questo è di particolare importanza quando si punta a capire le proprietà sinaptiche di connessioni che non potevano essere affrontate con approcci convenzionali di stimolazione elettrica, o per identificare romanzo affeaffitto e connettività efferente che è stato precedentemente poco conosciuta. Qui, alcuni esempi illustrano come questa tecnica può essere applicata per studiare queste domande a chiarire i circuiti paura legate nell'amigdala. L'amigdala è una regione chiave per l'acquisizione e l'espressione di paura, e lo stoccaggio di memorie emozionali paura e. Molte linee di evidenza suggeriscono che la corteccia prefrontale mediale (mPFC) partecipa a diversi aspetti di acquisizione paura e l'estinzione, ma la sua connettività preciso con l'amigdala è appena iniziando a essere capito. In primo luogo, si mostra come ex vivo di attivazione optogenetic può essere utilizzato per studiare gli aspetti della comunicazione sinaptica tra le afferenze mPFC e cellule bersaglio nell'amigdala basolaterale (BLA). Inoltre, è illustrato come questo approccio optogenetic ex vivo può essere applicato per valutare modelli di connettività nuovi utilizzando un gruppo di neuroni GABAergici nell'amigdala, il cluster paracapsular intercalate cellule (mpITC), come esempio.
Introduzione
strumenti precisi per la visualizzazione e l'attivazione simultanea di connessioni specifiche tra aree cerebrali e specifici tipi di neuroni stanno diventando sempre più importante per capire le connettività funzionale sottostanti sani stati funzioni cerebrali e malattie. Idealmente, questo comporta indagini fisiologica di precise proprietà sinaptiche con cui i neuroni comunicano identificati. Ciò è particolarmente vero per i collegamenti tra aree cerebrali che non possono essere conservati in una sola fetta cerebrale acuto. In passato, questo è stato ampiamente raggiunto in esperimenti separati. Da un lato, traccianti neurali iniettate in vivo sono stat....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
dichiarazione etica: Tutte le procedure sperimentali erano in conformità con la direttiva UE sulla uso di animali nella ricerca e sono stati approvati dalla cura degli animali locali e del Comitato Usa (Regierungspräsidium Tuebingen, stato di Baden-Württemberg, Germania) responsabile per l'Università di Tubinga.
1. procedura di iniezione stereotassica
- Preparare strumenti sterili (forbici, bisturi, pinze, trapano, aghi, materiale di sutura) utilizzando uno sterilizzatore. Disporre strumenti sterili e altre soluzioni necessarie e le forniture di chirurgia quali swap sterili di cotone, disinfettante, sterile tampone fosfato (PBS, pH 7,4), e H
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Questa sezione mostra il flusso di lavoro di un approccio optogenetic ex vivo e risultati rappresentativi di diverse strategie sperimentali per studiare le proprietà fisiologiche delle proiezioni sensoriali e modulatorie a lungo raggio a BLA e neuroni mpITC così come le proprietà di connettività locale fra mpITC e BLA.
Dopo l'iniezione stereotassica del vettore virale selezionato le coordinate desiderate nel cerve.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo descrive un metodo per ex vivo indagini optogenetic dei circuiti neurali e la connettività locale che può essere facilmente implementato sulla maggior parte, se non tutti, in posizione verticale fetta configurazioni di registrazione patch-clamp dotandoli di un ~ 470 LED al porto luce epifluorescenza nm. Uno dei principali vantaggi della stimolazione optogenetic di proiezioni assonale in fette è che permette l'attivazione e ricerca di proprietà di connessioni non accessibili con stimolazion.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Cora Hübner e Andrea Gall per l'aiuto nell'acquisizione di alcuni dei risultati rappresentativi. Questo lavoro è stato sostenuto dal Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) dell'Università di Tubinga, da un'iniziativa di eccellenza finanziata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) nell'ambito dell'Excellence Initiative (EXC 307) e da fondi della Charitable Hertie Foundation.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | può essere sostituito da un altro frame stereotassico per topi |
| Stoelting, USA | 51625 | può essere sostituito da un altro frame stereotassico per | |
| topi | Stoelting, USA | 50264 | non più disponibile, sostituito dall'articolo n. 51609M |
| Dispositivo di iniezione a pressione, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | altri dispositivi di iniezione a pressione (ad es. Picospritzer) possono essere utilizzati |
| capillari in vetro Kwik Fill | World Precision Instruments, Germania | 1B150F-4 | |
| Macchina per anestesia, IsoFlo | Eickemeyer, Germania | 213261 | |
| Regolatore di temperatura CC e termoforo | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Estrattore orizzontale per micropipette Modello P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Sterilizzatore per strumenti chirurgici, Sterilizzatore 75 | Melag, Germania | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (sierotipo 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (sierotipo 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (sierotipo 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| verde veloce | Roth, Germania | 0301.1 | |
| Isoflurano Anestetico, Isofurano CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germania | ||
| Antisettico, Betadine (providone-iodio) | Purdure Products, USA | BSOL32 | può essere sostituito da un altro disinfettante |
| Analgesico, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germania | può essere sostituito da altri analgesici | |
| Unguento per gli occhi Bepanthen | Bayer, Germania | 0191 | può essere sostituito da un altro unguento per gli occhi |
| Trapano NM3000 (SNKG1341 e SNIH1681) | Nouvag, Svizzera | ||
| Sutranox Ago da sutura | Strumenti per la scienza fine, Germania | 12050-01 | |
| Sutura in seta intrecciata | Strumenti per le scienze corte, Germania | 18020-60 | |
| Registrazioni, stimolazione luminosa e analisi | |||
| liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) | per la composizione vedi riferimenti #16 e #23 | ||
| soluzioni di cerotti interni | per la composizione vedi riferimenti #16 e #23 | ||
| MagnesioSolfato eptaidrato | Roth, Germania | P027.1 | preparare una soluzione madre 2M in purificato |
| affettatrice ad acqua, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germania | 920120 | |
| Unità di raffreddamento per affettatrice di tessuti, CU65 | Fisher Scientific, Germania | 770180 | |
| Lama in zaffiro | Delaware Diamond Knives | ordine personalizzato, informarsi con l'azienda | |
| Stereoscopio, SZX2-RFA16 | Olympus, Giappone | ||
| Lampada fluorescente Xcite (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Microscopio patch, BX51WI | Olympus, Giappone | ||
| Amplificatore patch Multiclamp 700B | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| Software PClamp, Versione 10 | Molecular Devices, USA | utilizzato per controllare l'acquisizione e la stimolazione dei dati | |
| Termoregolatore del bagno, TC05 | Luigs & Neumann, Germania | 200-100 500 0145 | |
| Micromanipolatore a tre assi Mini 25 | Luigs & Neumann, Germania | 210-100 000 0010 | |
| Controllore per micromanipolatore SM7 | Luigs & Neumann, Germania | 200-100 900 7311 | |
| capillari di vetro per pipette patch World | Precision Instruments, Germania | GB150F-8P | |
| Carta da filtro al nitrato di cellulosa per camera di interfaccia | Satorius Stedim Biotech, Germania | 13006--50----ACN | |
| Unità LED, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED o USL 70/470 e adattatori appropriati sono due scelte alternative per la stimolazione LED |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | CoolLED o USL 70/470 e adattatori appropriati sono due scelte alternative per |
| l'unità LED di stimolazione LED, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | CoolLED o USL 70/470 e gli adattatori appropriati sono due scelte alternative per la stimolazione LED |
| Adattatore a doppia porta | Rapp Optoelectronic | Informarsi con l'azienda | CoolLED o USL 70/470 e gli adattatori appropriati sono due scelte alternative per la stimolazione LED |
| Set di filtri rosso (eccitazione) | AHF, Germania | I filtri F49-560 | possono essere acquistati come set F46-008 |
| (divisore di fascio) | AHF, Germania | I filtri F48-585 | possono essere acquistati come set F46-008 |
| (emissione) | AHF, Germania | F47-630 | I filtri possono essere acquistati come set F46-008 |
| Set di filtri verde (eccitazione) | AHF, Germania | F39-472 | Alternative: set di filtri F36-149 o F46-002 (con emissione passa-banda) |
| (divisore di fascio) | AHF, Germania | F43-495W | Alternative: set di filtri F36-149 o F46-002 (con emissione passa-banda) |
| (emissione) | AHF, Germania | F76-490 | Alternative: set di filtri F36-149 o F46-002 (con emissione passa-banda) |
| LaserCheck, misuratore di potenza portatile | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, versione 6 | Wavemetrics, USA | per l'analisi dei dati di elettrofisiologia, è possibile utilizzare anche altri pacchetti software alternativi... | |
| La suite di macro Neuromatic per IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com per l'analisi | dati di elettrofisiologia, possono essere utilizzati anche altri pacchetti software alternativi. | |
| Analisi post hoc di iniezioni e proiezioni | |||
| Polvere di paraformaldeide (PFA) | Roth, Germania | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 colorante Nissl fluorescente blu | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar per l'inclusione e la resezione Roth | , Germania | 5210.3 | |
| Piastre di Petri 30 x 10 mm per l'inclusione | di SPL Life Scienze | alternative possono essere utilizzate | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germania | 61303802 | alternative possono essere utilizzate |
| vetrini coprioggetti | R. Langenbrinck, Germania | 3000302 | alternative possono essere utilizzate |
| Vecta Shield mezzo di montaggio | Vector Laboratories, USA | possibile utilizzare supporti di montaggio alternativi | H-1000 |
| filtro al nitrato di cellulosa per l'appiattimento fette per fissaggio | Satorius Stedim Biotech, Germania | 11406--Microscopio | |
| LSM 710 | Zeiss, Germania |
Riferimenti
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
