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Articolo metodologico

Tridimensionale alginato-tallone coltura di cellule umane adenoma ipofisario

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DOI:

10.3791/53637

⸱

18 febbraio 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN), 2Department of Experimental Pathology, Nacional Institute of Neurology and Neurosurgery

In questo articolo

Sommario

La coltura tridimensionale in perle di alginato, per la sua semplicità e riproducibilità, è stata scelta per mantenere le cellule di adenoma ipofisario. Le procedure includevano una digestione enzimatica iniziale e la dissociazione meccanica del tessuto tumorale, e la successiva sospensione cellulare è stata incapsulata in perle di alginato.

Abstract

Un metodo di coltura tridimensionale è descritta in cui le cellule adenoma ipofisario primarie sono coltivate in perline alginato. Alginato è un polimero derivato da alghe brune mare. Brevemente, il tessuto tumorale è tagliato in piccoli pezzi e sottoposto ad una digestione enzimatica con collagenasi e tripsina. Successivamente, una sospensione cellulare viene ottenuta. La sospensione delle cellule tumorali viene miscelato con alginato di sodio 1,2% e rilasciato in una soluzione 2 CaCl, e la sospensione alginato / cellulare è gelificata a contatto con il CaCl 2 per formare perle sferiche. Le cellule incorporati nelle perle alginato sono forniti con nutrienti forniti dai terreni di coltura arricchito con 20% FBS. cultura tridimensionale in perline alginato mantiene la vitalità delle cellule adenoma per lunghi periodi di tempo, fino a quattro mesi. Inoltre, le cellule possono essere liberati dal alginato lavando le perline con citrato di sodio e seminate su vetrini per ulteriori analisi immunocitochimica. L'uso di un celModello L cultura consente il fissaggio e la visualizzazione del citoscheletro di actina con il minimo disorganizzazione. In sintesi, perline alginato forniscono un sistema di coltura affidabile per il mantenimento delle cellule adenoma pituitario.

Introduzione

Scaffold tridimensionali sono stati ampiamente utilizzati in coltura cellulare perché forniscono un sostegno strutturale tridimensionale per colture cellulari e la manutenzione di comunicazione 1 cellula-cellula. materiali polimerici Naturalmente derivati ​​sono stati utilizzati per fare impalcature tridimensionali contenenti collagene di tipo I, chitosano e alginato. Alginato è un polimero naturale derivato dalle alghe Macrocystispyrifera mare marrone (Kelp). Questo polimero è composto di unità ripetute di acido β-D-mannuronico (M) e α-L-guluronico acido (G) 2 e forma gel stabili in presenza di alcuni cationi bivalenti, come calcio e bario. (CaCl 2) soluzioni di cloruro di calcio vengono comunemente usati come reagente di reticolazione per formare perline alginato. Le soluzioni di alginato è sceso in CaCl 2 formare immediatamente gel sferici tridimensionali. Quando la soluzione di alginato viene miscelato con cellule, le cellule sono incapsulati in alginato bEADS 3.

Alginato ha proprietà che hanno permesso di essere utilizzato come matrice per l'incapsulamento di una varietà di cellule, comprese condrociti 4, mioblasti scheletrici 5 e cellule staminali neuronali 6. È un materiale inerte e permette la diffusione di nutrienti, ossigeno e prodotti metabolici che mantengono la sopravvivenza cellulare e la funzione; Inoltre, a differenza di altri sistemi di coltura a base di gel, cellule coltivate all'interno perline alginato possono essere liberati dal scaffold usando chelanti del calcio, come citrato di sodio, e le cellule possono essere raccolte per ulteriori accertamenti 7.

adenomi ipofisari sono in genere tumori benigni con tassi di proliferazione bassi. Linee cellulari adenoma pituitario di ratto sono state correttamente coltivate in un sistema a due dimensioni 8. Tuttavia, questa cultura di tumori a cellule dell'ipofisi umane secrezione non è uno sviluppo efficiente; Le cellule tumorali ipofisarie disperse crescono poconella cultura, le cellule mostrano attaccamento limitata e la diffusione, e le cellule tipicamente formano aggregati galleggianti nel piatto cultura 9,10.

Diversi tentativi sono stati fatti per ottenere una sospensione di cellule tumorali dell'ipofisi, compreso un approccio enzimatica e dispersione meccanica 11, un approccio dispersione esclusivamente meccanica 12 e la coltura di espianti tumorali 10. Con questi approcci, diversi autori hanno ottenuto culture aderenti vitali per diversi periodi di tempo. Le capacità delle cellule tumorali secretorie di sopravvivere in questi sistemi bidimensionali dipendono dal tipo di tumore e loro tassi di proliferazione 9. Tuttavia, nelle culture a lungo termine, le cellule con fenotipo di fibroblasti predominano 11,13. Questo documento descrive un metodo per ottenere una coltura primaria di cellule d'adenoma pituitario incapsulate in perline di alginato che li libera lontano dalla scaffold alginato che consente analisi dettagliateaspetti della loro biologia cellulare, ad esempio, le loro disposizioni del citoscheletro.

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Protocollo

Questo studio è stato approvato per l'uso di materiale umano da parte dei comitati etici locali dell'istituto di cura e il Centro ricerche e studi di avanzamento del Politecnico Nazionale.

1. Acquisizione tumore del campione

  1. Ottenere la biopsia del tessuto adenoma pituitario da un paziente attraverso una procedura chirurgica trans-sfenoidale 14.
  2. Raccogliere il campione adenoma pituitario e metterlo in una bottiglia di vetro sterile contenente 50 ml di fresco 199 terreno di coltura (M199) arricchito con siero 10% fetale bovino (FBS), 0,6 mg / bicarbonato di sodio ml, 2,4 mg / ml di HEPES e l'1% antibiotici (penicillina / streptomicina) a pH 7.4. Mantenere il campione in una bottiglia di vetro su ghiaccio.
    Nota: Il tessuto tumorale può essere elaborato diverse ore dopo l'intervento chirurgico.
  3. Trasportare il campione del tumore al laboratorio in bottiglia di vetro su ghiaccio.

2. Preparazione dei enzimatici Tissue dissociazione Solutions,Soluzione inibitore della tripsina e le soluzioni di alginato

Nota: Prima della procedura di coltura cellulare Preparare le seguenti soluzioni. Filtrare tutte le soluzioni usando un filtro di 0,22 micron a membrana, prima dell'uso.

  1. Preparare collagenasi soluzione all'1% sciogliendo 5 mg di collagenasi (tipo I) in 5 ml di connessione M199-siero.
  2. Preparare tripsina soluzione 0,01% sciogliendo 0,01 g di tripsina in 10 ml di PBS-EDTA 0,3%.
  3. Preparare 0,1% soluzione di inibitore della tripsina sciogliendo 2 mg di inibitore di soia tripsina in 20 ml di libera M199-siero.
  4. Preparare la soluzione DNAsi sciogliendo 20 ml di DNAsi I 134 U / ml in 4 ml di soluzione di inibitore della tripsina.
  5. Preparare la soluzione EGTA (1.2 M) sciogliendo 22,8 mg di EGTA in 40 ml di 155 mM NaCl. Regolare il pH a 7,4. Continuare ad un volume finale di 50 ml.
  6. Preparare la soluzione HEPES (20 mM) sciogliendo 238 mg HEPES in 50 ml di 155 mM NaCl.
  7. Preparare la soluzione di alginato 1,2% sciogliendo 1.2g di sodio alginato in 100 ml di soluzione di HEPES. Autoclave la soluzione di alginato.
  8. Preparare la soluzione di calcio (102 mm), sciogliendo 750 mg di CaCl 2 in 50 ml di soluzione HEPES, aggiustare il pH a 7,4

3. cellulare primaria, Cultura e alginato incapsulamento

  1. All'interno di una cappa a flusso laminare, posizionare il tessuto tumorale in una capsula di Petri 35 millimetri contenente circa 20 ml di PBS Ca 2+ e Mg 2+ libero, pH 7,4 (PBS *).
  2. Prendere il tessuto con una pinzetta chirurgica e metterlo in un altro piatto di Petri contenente PBS fresco *, lavare delicatamente il tessuto. Ripetere questa operazione fino a quando i globuli rossi e detriti sono stati rimossi.
  3. Utilizzando una pinzetta chirurgica, tenere il tessuto adenoma pituitario, e con una piccola forbice chirurgica, tagliato in piccoli pezzi. Con una pipetta Pasteur con bordi arrotondati, trasferire i frammenti di tessuto e il PBS * in una provetta da 15 ml, Centrifugare a 68 xg per 10 min a RT.
    Nota: per arrotondare i bordi di una Pasteurpipetta, scarsamente fiamma la punta della pipetta in un becco Bunsen.
  4. Rimuovere il PBS * usando una pipetta Pasteur e aggiungere 3-5 ml della soluzione di collagenasi (circa 5 ml il 65 mm 3 di tessuto), mescolare due o tre volte per inversione. Incubare il tessuto in collagenasi per 30 min a 37 ° C in rotazione costante.
  5. Centrifugare la provetta a 68 xg per 10 min a RT e rimuovere la collagenasi con una pipetta Pasteur.
  6. Aggiungere 5 ml di DNAsi e mescolare due o tre volte invertendo, quindi centrifugare la provetta a 68 xg per 10 min a RT.
    Nota: Se il tessuto non è completamente dissociato, eseguire un secondo digestione enzimatica con tripsina per 3 minuti a 37 ° C. Arrestare la digestione con l'aggiunta di 2 volumi di soluzione inibitore della tripsina.
  7. Aspirare il surnatante con una pipetta Pasteur e scartare. Risospendere il pellet in 1 volume di soluzione EGTA e mescolare con 2 volumi di soluzione di alginato.
  8. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e alginatopipettando con una pipetta Pasteur. Prendere una siringa sterile con un ago G 21, togliere il pistone; utilizzare una pipetta per caricare la siringa con la soluzione di alginato e cellule.
  9. Inserire delicatamente lo stantuffo nella siringa e accuratamente erogare goccia a goccia la soluzione di alginato di cellule in un bicchiere di vetro contenente circa 30 ml di soluzione ricca di calcio.
  10. Inserire l'ago della siringa circa 5 cm fino alla soluzione di CaCl 2. I gel sospensione alginato cellule a contatto con il CaCl 2 per formare perle sferiche. Conservare le perline alginato di calcio nella soluzione per 5 min.
    Nota: Mescolare il bicchiere di vetro in cui sono sceso le perle. Spostare lentamente con la mano in movimenti circolari, per evitare che aderiscano l'uno all'altro.
  11. Rimuovere con attenzione la soluzione di calcio con una pipetta Pasteur, e lavare le perle due volte con 3-5 ml di M199 arricchito con il 20% di FBS.
  12. Trasferire le perline alginato in una cultura normale tessuto T25pallone di utilizzando una spatola sterile, aggiungere 4-5 ml di M199 arricchito con 20% FBS e incubati a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. Modificare il terreno di coltura ogni tre giorni.

4. Liberate cellule dal alginato

Nota: Prima di liberare le cellule dalle perline alginato, cappotto 13 coprioggetto mm di diametro con poli-D-lisina.

ATTENZIONE: ACIDO SOLFORICO è un acido altamente corrosivo, and Apts PUÒ CAUSARE OCCHI E DELLA CUTE. Utilizzare guanti in lattice per maneggiare i reagenti.

  1. In una cappa aspirante, con un punto pinzetta immergere i coprioggetti in un piatto di vetro Petri contenente il 20% acquosa di acido solforico per 1 ora a RT.
  2. Decantare l'acido solforico, e lavare i coprioggetti cinque volte con acqua distillata per 5 minuti ciascuna. Utilizzando un luogo punto pinzetta i coprioggetti puliti in una capsula di Petri contenente 0,1 M NaOH per 5 minuti a temperatura ambiente 15.
  3. Decantare il NaOH e lavare una volta con distillareacqua ha portato, aspirare l'acqua e asciugare i coprioggetti.
  4. Utilizzare una micropipetta per rivestire i coprioggetti con APTS (amminopropil-trietossisilano) per 4 minuti (usare 500 microlitri per 6 lamelle) inondare la piastra di Petri con acqua distillata. aspirare rapidamente l'acqua e continuare a lavare con acqua distillata, spostando i coprioggetti con una pinzetta point per permettere all'acqua di penetrare al di sotto.
  5. Aspirare l'acqua e asciugare i coprioggetti, utilizzando un luogo punto pinzetta i coprioggetti in un piatto pulito Petri e sterilizzarli all'interno del forno a microonde per 3 volte, 45 secondi ciascuno. Aggiungere 1,000 ml di acqua sterile e 100 mg di poli-D-lisina (0,1 mg / ml).
  6. Incubare le coprioggetto con circa 50 ml di poli-D-lisina per 5 minuti a RT. Aspirare completamente i poli-D-lisina.
    Nota: Questo è importante perché solubile in poli-D-lisina nel mezzo di coltura può inibire la proliferazione cellulare.
  7. Lavare i coprioggetti cinque volte con acqua sterile per 5 minuti ciascuno. Aspirare la stacqua e lasciare erile coprioggetto ad asciugare all'interno di una cappa a flusso laminare.
  8. Per analizzare il citoscheletro di actina, liberare le cellule ipofisarie dal alginato. Prendete un po 'delle perline alginato dal pallone di coltura usando un puntale 1 ml e metterli in un tubo da 15 ml.
  9. Aggiungere 5 ml di citrato di sodio 55 mM (sciogliere 323,6 mg di Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H 2 O in 20 ml di soluzione HEPES) e centrifugare a 68 xg per 10 min a RT. Aspirare il surnatante e scartare.
  10. Risospendere il pellet in 1 ml di caldo M199 arricchito con il 20% FSB; mescolare delicatamente la sospensione cellulare con una pipetta Pasteur.
    ATTENZIONE: falloidina E DAPI sono tossici. Usare i guanti per maneggiare i reagenti.
  11. Per contare le cellule, trasferire 125 ml di 0,4% soluzione blu Trypan in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 75 ml di M199 e 50 ml di sospensione cellulare ottenuta nell'ultimo passaggio (fattore di diluizione = 5). Mescolare accuratamente.
  12. Utilizzare una punta micropipetta per place circa 10 microlitri della sospensione blue-cell Trypan nella camera emocitometro.
  13. Contare le cellule nel contatore emocitometro utilizzando un microscopio invertito con illuminazione a contrasto di fase. Contare tutte le cellule nel centro della piazza 1 mm e quattro piazze d'angolo 1 mm. Ottenere la densità delle cellule per millilitro moltiplicando il numero medio per quadrato per il fattore di diluizione -. 10 4 Per esempio, se i conteggi medi per quadrato è di 45 cellule x 5 x 104 = 2,25 x 106 cellule / ml.
    Nota: Contare le cellule in dieci piazze della camera di emocitometro. Non contare le cellule che toccano la linea mediana in basso e destra.
  14. Seed 35.000 cellule su vetrini diametro di 13 mm rivestiti con poli-D-lisina.

5. Disposizione citoscheletro di actina

  1. Dopo 48 ore di cultura, rimuovere il terreno di coltura con una pipetta Pasteur e rapidamente aggiungere 500 microlitri per coprioggetto di PBS, immediatamente rimuovere la PBS.
  2. Fissare e permeabilize tlui cellule con 500 microlitri per coprioggetto di tampone di fissaggio (0.1 M TUBI, pH 6,75, 4% PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 0,5% Triton X-100 e 2% formaldeide) per 10 min a 37 ° C
  3. Rimuovere il buffer fissazione e aggiungere 500 microlitri per coprioggetto del 3,5% paraformaldeide in PBS per 30 minuti a RT. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide.
  4. Lavare i coprioggetti per tre volte con l'aggiunta di 500 microlitri per coprioggetto di PBS per 5 minuti ciascuna. Sciacquare i vetrini a temperatura ambiente, in costante agitazione.
  5. Incubare le cellule con cloruro di ammonio 50 mM per 10 minuti, aspirare la soluzione di cloruro di ammonio e ripetere il punto 5.4.
  6. Incubare le cellule con 1% di BSA (IgG-libera, proteasi-free) in PBS per 30 minuti, rimuovere la soluzione di BSA e ripetere il punto 5.4.
  7. Incubare le cellule con 50 um di falloidina rodamina coniugato per 7 minuti a temperatura ambiente, ripetere il punto 5.4.
  8. Incubare le cellule con 255 micron di DAPI diluito in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente, ripetere il punto 5.4. Infine montare tegli coprioggetto con un mezzo di montaggio e di sigillare con smalto.
  9. Acquisire le immagini delle disposizioni actina citoscheletro usando un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo 63x, a 541 nm di eccitazione lunghezza d'onda.

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Risultati

Questo protocollo è stato applicato con successo nella cultura e nella manutenzione delle cellule adenoma pituitario in perle di alginato per diversi periodi di tempo figura 1 mostra cellule incorporati in perline alginato dopo tre mesi.; queste cellule mostrano forme arrotondate bi-rifrazione sotto un microscopio ottico invertito (Figura 1). La Figura 2 mostra la localizzazione di N-caderina in cellule d'adenoma pituitario di ratto ...

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Discussione

Questo protocollo ha diversi passaggi critici. Il primo è l'omogeneità formato del branello, che è necessario per mantenere le stesse condizioni di diffusione dei nutrienti e gas in tutta la coltura cellulare. Nella nostra esperienza, l'uso di un ago 21 G per rendere le perline alginato consente l'acquisizione di una cultura efficace di formato del branello uniforme. Il secondo fattore importante è la distanza tra l'ago; questa distanza deve essere non più di 5 cm dalla soluzione di calcio per evitare pe...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il signor O. Rios per la sua assistenza tecnica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
reagente 
199 terreno di coltura Invitrogen 31100-027Per la cultura, caldo in un 37 ° C bagnomaria prima dell'uso 
Siero fetale bovino PAAA15-751
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)Merck106329
N-(2-idrossietil) piperazina-N&acuto;-2etanosolfonico acido (HEPES)Sigma H-4034
Penicillina/StreptomicinaPAAP11-010
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco)Invitrogen 21600-044
Collagenasi tipo IWorthington4176
Tripsina Invitrogen 27250-018
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Research Organics3002E
Inibitore della tripsina sorbea Invitrogen 17075-029
DNAseWorthington2139
Acido alginico, da Macrocystis pyrifera (Kelp)Sigma A-2158
Cloruro di calcio (CaCl2)J.T. Baker1332
Citrato di sodio (Na3C6H5O7)J.T. Baker3646
Piperazina-N,N′-bis(acido 2-etansolfonico) (PIPES)Research Organics9624P
Polietilenglicole 6000 (PEG 6000)Calbiochem528877
Etilene acido glicole tetraacetico (EGTA)Research Organics9574E
solfato di magnesio (MgSO4)J.T. Baker2500
Triton-X 100SigmaX100
FormaldeideJ.T. Baker2106
ParaformaldeideSigmaP6148
Cloruro di ammonio (NH4Cl)J.T. Baker660
BSA Albumina sierica bovina senza IgGJackson Immuno Research001-000-161
Falloidina– Tetrametilrodamina B isotiocianatoSigmaP1951tossico. Usa i guanti per maneggiare questo reagente 
4',6-Diamidino-2-Fenilidolo, Dicloridrato (DAPI)Invitrogeno D1306Tossico. Usa i guanti per maneggiare questo reagente 
Acido solforico (H2SO4)J.T. Baker9681Altamente corrosivo. Usa i guanti per maneggiare questo reagente 
Idrossido di sodio (NAOH)Merck1.06498Può causare irritazione agli occhi e alla pelle. Usa i guanti per maneggiare questo reagente 
(3-amminopropil)trietossisilano (APTS)SigmaA-3648
Poli-D-lisina bromidratoSigmaP7280
Soluzione blu di tripanoSigmaT8154 
Nome    Azienda  Numero di catalogo  Comments
Equipment  Tossico: Può causare il cancro. Usa i guanti per maneggiare questo reagente 
Rotatore Boekel ScientificModello 230300
CentrifugaDuPont Corporation Modello sorvall TC6
shaker Strumenti da laboratorioModello 314-820 

Riferimenti

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