Migliorare 2D e 3D della pelle<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli con Macromolecole affollamento

Paula Benny; Cedric Badowski; E. Birgitte Lane; Michael Raghunath

doi:10.3791/53642

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Migliorare 2D e 3D della pelle

12.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/53642

⸱

22 agosto 2016

Paula Benny¹^,² , Cedric Badowski² , E. Birgitte Lane² , Michael Raghunath¹^,²^,³

¹Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, ²Epithelial Biology Laboratory, Institute of Medical Biology, A*STAR, ³Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore

In questo articolo

Sommario

Vi presentiamo un protocollo per ottenere matrici derivati dalle cellule ricche di proteine della matrice extracellulare, utilizzando Crowders macromolecolari (MMC). Inoltre, vi presentiamo un protocollo che incorpora MMC nella generazione di pelle co-coltura organotipica 3D, che riduce i tempi di cultura, pur mantenendo la maturità di costrutto.

Abstract

La famiglia glicoproteina di collagene rappresenta i principali proteine strutturali del corpo umano, e sono componenti chiave di biomateriali utilizzati in ingegneria dei tessuti moderni. Una strozzatura tecnica è la deposizione di collagene in vitro, come è notoriamente lento, causando formazione sub-ottimale del tessuto connettivo e successiva coesione dei tessuti, soprattutto nei modelli della pelle. Qui, si descrive un metodo che prevede l'aggiunta di copolimeri saccarosio differenzialmente dimensioni per culture pelle per generare macromolecolari affollamento (MMC), che si traduce in un miglioramento drammatico della deposizione di collagene. In particolare, fibroblasti dermici depositato una notevole quantità di collagene I / IV / VII e fibronectina in MMC rispetto ai controlli.

Il protocollo descrive anche un metodo per decellularize strati cellulari affollate, esponendo quantità significative di matrice extracellulare (ECM) che sono stati trattenuti sulla superficie cultura come evidenziato da immunocytochemistry. modello di massa e la distribuzione di matrice totale è stata studiata usando la microscopia interferenze riflessione. È interessante notare che le matrici, i fibroblasti, cheratinociti e co-culture producevano derivati dalle cellule (CDM) di varia composizione e morfologia. CDM potrebbe essere utilizzato come "bio-scaffold" per la semina cella secondaria, dove l'attuale uso di rivestimenti o ponteggi, in genere da fonti animali xenogeniche, può essere evitato, così spostando verso applicazioni più clinicamente rilevante.

Inoltre, questo protocollo descrive l'applicazione della MMC durante la fase di immersione di un modello 3D-organotipica pelle co-coltura che era sufficiente per migliorare la deposizione di ECM nella giunzione dermo-epidermica (GDE), in particolare, collagene VII, il componente principale di ancoraggio fibrille. La microscopia elettronica ha confermato la presenza di ancoraggio fibrille in culture sviluppate con MMC, rispetto ai controlli. Ciò è significativo come fibrille di ancoraggio Tether il derma all'epidermide, di conseguenza,avere un preformato maturo DEJ può beneficiare destinatari trapianto di pelle in termini di stabilità del trapianto e la guarigione delle ferite nel complesso. Inoltre, il tempo di coltura è stato condensato da 5 settimane a 3 settimane per ottenere un costrutto matura, quando si utilizza MMC, riducendo i costi.

Introduzione

La pelle forma una barriera protettiva prevenendo la perdita di acqua e l'ingresso del patogeno. Esso è costituito da tre componenti principali; derma ricchi stromali ^1, un stratificati epidermide ^2,3,4 su di esso, e la giunzione dermo-epidermica tra ^5,6. Il derma è composto in gran parte da fibre collagene ed elastiche ed è scarsamente popolate con fibroblasti ^7. Al contrario, l'epidermide ricco di cellule è composto da più strati di cheratinociti. I cheratinociti dello strato più interno sono proliferative e forniscono nuove cellule basali che rinnovano e sostituiscono cheratinociti terminali di differenziazione c....