Articolo metodologico

Migliorare 2D e 3D della pelle In Vitro modelli con Macromolecole affollamento

DOI:

10.3791/53642

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22 agosto 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Epithelial Biology Laboratory, Institute of Medical Biology, A*STAR, 3Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore

In questo articolo

Sommario

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Vi presentiamo un protocollo per ottenere matrici derivati ​​dalle cellule ricche di proteine ​​della matrice extracellulare, utilizzando Crowders macromolecolari (MMC). Inoltre, vi presentiamo un protocollo che incorpora MMC nella generazione di pelle co-coltura organotipica 3D, che riduce i tempi di cultura, pur mantenendo la maturità di costrutto.

Abstract

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La famiglia glicoproteina di collagene rappresenta i principali proteine ​​strutturali del corpo umano, e sono componenti chiave di biomateriali utilizzati in ingegneria dei tessuti moderni. Una strozzatura tecnica è la deposizione di collagene in vitro, come è notoriamente lento, causando formazione sub-ottimale del tessuto connettivo e successiva coesione dei tessuti, soprattutto nei modelli della pelle. Qui, si descrive un metodo che prevede l'aggiunta di copolimeri saccarosio differenzialmente dimensioni per culture pelle per generare macromolecolari affollamento (MMC), che si traduce in un miglioramento drammatico della deposizione di collagene. In particolare, fibroblasti dermici depositato una notevole quantità di collagene I / IV / VII e fibronectina in MMC rispetto ai controlli.

Il protocollo descrive anche un metodo per decellularize strati cellulari affollate, esponendo quantità significative di matrice extracellulare (ECM) che sono stati trattenuti sulla superficie cultura come evidenziato da immunocytochemistry. modello di massa e la distribuzione di matrice totale è stata studiata usando la microscopia interferenze riflessione. È interessante notare che le matrici, i fibroblasti, cheratinociti e co-culture producevano derivati ​​dalle cellule (CDM) di varia composizione e morfologia. CDM potrebbe essere utilizzato come "bio-scaffold" per la semina cella secondaria, dove l'attuale uso di rivestimenti o ponteggi, in genere da fonti animali xenogeniche, può essere evitato, così spostando verso applicazioni più clinicamente rilevante.

Inoltre, questo protocollo descrive l'applicazione della MMC durante la fase di immersione di un modello 3D-organotipica pelle co-coltura che era sufficiente per migliorare la deposizione di ECM nella giunzione dermo-epidermica (GDE), in particolare, collagene VII, il componente principale di ancoraggio fibrille. La microscopia elettronica ha confermato la presenza di ancoraggio fibrille in culture sviluppate con MMC, rispetto ai controlli. Ciò è significativo come fibrille di ancoraggio Tether il derma all'epidermide, di conseguenza,avere un preformato maturo DEJ può beneficiare destinatari trapianto di pelle in termini di stabilità del trapianto e la guarigione delle ferite nel complesso. Inoltre, il tempo di coltura è stato condensato da 5 settimane a 3 settimane per ottenere un costrutto matura, quando si utilizza MMC, riducendo i costi.

Introduzione

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La pelle forma una barriera protettiva prevenendo la perdita di acqua e l'ingresso del patogeno. Esso è costituito da tre componenti principali; derma ricchi stromali 1, un stratificati epidermide 2,3,4 su di esso, e la giunzione dermo-epidermica tra 5,6. Il derma è composto in gran parte da fibre collagene ed elastiche ed è scarsamente popolate con fibroblasti 7. Al contrario, l'epidermide ricco di cellule è composto da più strati di cheratinociti. I cheratinociti dello strato più interno sono proliferative e forniscono nuove cellule basali che rinnovano e sostituiscono cheratinociti terminali di differenziazione c....

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Protocollo

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1. macromolecolare affollamento in 2D Culture delle cellule della pelle

  1. Seme 50.000 cellule (fibroblasti primarie o cheratinociti primari o co-coltura di fibroblasti e cheratinociti primari) per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. cellule seme in 1 ml di mezzi di crescita tipo di cella corrispondente.
  2. Consentono alle cellule di aderire durante la notte, in un incubatore a 37 ° al 5% di CO 2.
  3. Eliminare vecchi media e sostituirlo con 1 ml mezzi freschi contenente Crowders macromolecolari e acido ascorbico 100 micron. Utilizzare un cocktail Crowder comprensivi di 37,5 mg / ml Ficoll 70 e 25 mg / ml Ficoll 400. Uso fibroblast....

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Risultati

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Affollamento macromolecolare è stato in grado di migliorare la deposizione di ECM, in particolare, fibroblasti depositati più collagene I, IV e fibronectina rispetto controllare culture (Figura 1, strato cellulare, 1A, collagene I, 1B, collagene IV; 1C, fibronectina). Su decellularization, era evidente che i fibroblasti sono stati i principali depositanti di collagene I, IV e fibronectina rispetto ai cheratinociti

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Discussione

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La matrice extracellulare potenziata si ottiene dopo l'introduzione di crowder macromolecolari in coltura cellulare, a causa dell'effetto volume escluso che aumenta la scissione del propeptide da parte delle proteinasi. Ciò si traduce in una matrice extracellulare, in particolare il collagene, che viene elaborato più velocemente e depositato sulla superficie di coltura. Mentre altri gruppi hanno ottenuto spessi strati di cellule di fibroblasti, ciò ha comportato un tempo di coltura di diverse settimane20. Al c.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi contrastanti da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal Biomedical Research Council, Singapore attraverso il supporto di base all'Istituto di Biologia Medica e la sovvenzione SPF2013/005. M.R. è stato supportato da una sovvenzione del Comitato di Ricerca della Facoltà NUS (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112 e il programma di ingegneria tissutale NUS (NUSTEP). Gli autori desiderano ringraziare la professoressa Irene Leigh per aver fornito l'anticorpo del collagene VII. Il lavoro di microscopia elettronica è stato svolto presso l'Unità di microscopia elettronica dell'Università Nazionale di Singapore.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido ascorbicoWako013-12061Additivo per terreni di coltura cellulare
Inserti per colture cellulari  (formato a 6 pozzetti)Greiner Bio-One657610Colture organotipiche
Soluzione di citratoDakoS2369DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrato, pH 6 (x10)
Collagene (coda di ratto)Corning354236Colture organotipiche
CnT-57CELLnTECCnT-57Terreni di coltura cellulare
DAB Substrato + kit cromogenoDakoK3468Istologia
Piastra a pozzetti profondi (formato a 6 pozzetti)Corning355467Colture organotipiche
Reagente di rilevamento ECLGE Healthcare Life SciencesRPN2106Amersham ECL Western Blotting Reagente di rilevamento
Microscopio elettronico (TEM)  JEOL   JEM-1010 (100kV)Microscopia elettronica a trasmissione
Terreni per fibroblasti (FM)Alto glucosio-DMEM + 10% siero fetale bovino + 1% Penicillina Streptomicina
Ficoll PM70GE Healthcare Life Sciences17-0310-05Crowder macromolecolare
Ficoll PM400GE Healthcare Life Sciences17-0300-05Crowder macromolecolare
Terreni privi di siero per cheratinociti (KSFM)Life Technologies17005-042Terreni di coltura cellulare
Tampone di lisiThermoFisher Scientific89900Tampone di lisi per l'estrazione di proteine. Un inibitore della proteasi (Roche, #11836170001) è stato aggiunto a questo tampone di lisi.
MicroscopioZeissLSM510Canali rossi, verdi e blu per visualizzare le immunocolorazioni fluorescenti AF594, AF488 e DAPI (magnitudine 40X).
Terreni di montaggio (Hydromount)National DiagnosticsHS-106Colorazione fluorescente
Terreni di montaggio (Cytoseal)ThermoFisher Scientific8310-16Istologia (HRP)
Composto OCT (Tissue Tek)Sakura4583Inclusione per criotomia
Penicillina-streptomicina antibioticiSigma AldrichA5955Terreni di coltura cellulare additive
Anticorpi primari
Anti-Collagen I anticorpoAbcam#ab6308
Anti-Collagene Tipo IVNovocastra#NCL-COLL-IV
Anti-Collagene VIILH7.2 (in house) 
Anticorpo anti-fibronectinaAbcam#ab2413
Agente riducente ThermoFisher ScientificNP0009Western blot
Tampone per campioniThermoFisher ScientificNP0008Western blot
Anticorpi secondari (immunocolorazione)
4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI)Sigma Aldrich#D9542
AlexaFluor 594 capra-anti-coniglioThermoFisher Scientifico#A-11037 
AlexaFluor 594 capra-anti-topoThermoFisher Scientific #A-11005
AlexaFluor 488 pollo-anti-coniglioThermoFisher Scientific#A-21441
AlexaFluor 488 capra-anti-topoThermoFisher Scientific#A-11001
Anticorpi secondari (HRP)DakoEnvision + System - Polimero marcato HRP anti-coniglio e anti-toponon diluito
Prodotti Chimicie AlimentariDecellularizzazione
Stratification media
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Utilizzato durante l'interfaccia aria-liquido di colture organotipiche. Questo terreno viene aggiunto all'esterno dell'inserto per colture cellulari.
Prosciutto s F12     Utilizzato durante l'interfaccia aria-liquido di colture organotipiche. Questo terreno viene aggiunto all'esterno dell'inserto per colture cellulari.
10% siero fetale bovino Utilizzato durante l'interfaccia aria-liquido di colture organotipiche. Questo terreno viene aggiunto all'esterno dell'inserto per colture cellulari.
100 U/ml di penicillina e 100 U/ml di streptomicinaUtilizzato durante l'interfaccia aria-liquido di colture organotipiche. Questo terreno viene aggiunto all'esterno dell'inserto per colture cellulari.
0,4 mg/ml di idrocortisoneUtilizzato durante l'interfaccia aria-liquido di colture organotipiche. Questo terreno viene aggiunto all'esterno dell'inserto per colture cellulari.
5 mg/ml di insulinaUtilizzato durante l'interfaccia aria-liquido delle colture organotipiche. Questo terreno viene aggiunto all'esterno dell'inserto per colture cellulari.
1.8· 10-4 M adenina  Utilizzato durante l'interfaccia aria-liquido di colture organotipiche. Questo terreno viene aggiunto all'esterno dell'inserto per colture cellulari.
5 mg/ml di transferrinaUtilizzato durante l'interfaccia aria-liquido delle colture organotipiche. Questo terreno viene aggiunto all'esterno dell'inserto per colture cellulari.
2&punto medio; 10- 11 M di triiodotironina Utilizzato durante l'interfaccia aria-liquido di colture organotipiche. Questo terreno viene aggiunto all'esterno dell'inserto per colture cellulari.
TripsinaBiopolis Servizi condivisi0,125% Tripsina/Versene    pH 7,0 + 0,3 Utilizzato per tripsinizzare le cellule
deossicolato di sodio

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
  2. Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in ....

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Tag

Deposizione di collagenematrice derivata da cellulemicroscopia a riflessione interferometricamodello di pelle 3Dgiunzione dermo epidermicafibrille di ancoraggiocoltura organotipicamatrice extracellulareco coltura di fibroblasti e cheratinociti

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