Method Article

Flow-modello Fabrication guidata della alta densità di codici a barre anticorpo Microarray

DOI:

10.3791/53644

⸱

January 6th, 2016

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la fabbricazione di una grande scala, DNA o anticorpi array bidimensionale multiplato, con potenziali applicazioni in studi di segnalazione cellulare e rilevazione biomarker.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il microarray di anticorpi come tecnologia ben sviluppata è attualmente sfidato da alcune altre tecnologie ad alto rendimento consolidate o emergenti. In questo rapporto, rinnoviamo la tecnologia dei microarray di anticorpi utilizzando un nuovo approccio per la produzione e introducendo nuove funzionalità. La fabbricazione del nostro microarray di anticorpi ad alta densità è realizzata attraverso il patterning di flusso orientato perpendicolarmente di DNA a singolo filamento e la successiva conversione mediata da coniugati DNA-anticorpo. Questo protocollo delinea le fasi critiche del pattern di flusso del DNA, della produzione e della purificazione dei coniugati DNA-anticorpo e della valutazione della qualità del microarray fabbricato. L'uniformità e la sensibilità sono paragonabili ai microarray convenzionali, mentre la nostra fabbricazione di microarray non richiede l'assistenza di una stampante di array e può essere eseguita nella maggior parte dei laboratori di ricerca. L'altro grande vantaggio è che le dimensioni delle nostre unità di microarray sono 10 volte più piccole di quelle degli array stampati, offrendo la capacità unica di analizzare le proteine funzionali di singole cellule quando si interfacciano con progetti di microchip generici. Questa tecnologia di codici a barre può essere ampiamente impiegata nel rilevamento di biomarcatori, negli studi di segnalazione cellulare, nell'ingegneria tissutale e in una varietà di applicazioni cliniche.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microarrays dell'anticorpo sono stati ampiamente utilizzati in studi di proteomica per decenni per esaminare la presenza di proteine ​​mirate, tra cui proteine ​​biomarcatori 1-3. Anche se questo campo è attualmente di fronte a grandi sfide da altre tecnologie high-throughput come la spettrometria di massa (MS), c'è ancora molto spazio per l'utilità di microarrays dell'anticorpo, soprattutto perché questi dispositivi offrono semplice interpretazione dei dati e facile interfaccia con altri test. Negli ultimi anni, l'integrazione dei microarrays in ponteggi microchip ha fornito microarray anticorpo una nuova opportunità di prosperare 4-7. Ad esempio, il codice a barre microarray integrato in un microchip monocellulare è stato usato in studi di comunicazione cellulare 8,9. Questa tecnologia presenta notevoli vantaggi rispetto ad altre tecnologie microarray disponibili. È dotato di elementi di un array a 10-100 micron, molto più piccolo del tipico 150 micron dimensioni utilizzate in elemen microarray convenzionalits. La costruzione di elementi di un array più piccoli si ottiene utilizzando approcci sistematici flusso-patterning, e questo dà luogo a microarray compatti in grado di rilevare le proteine ​​unicellulare secrete e proteine ​​intracellulari. Un altro vantaggio è l'uso di una installazione senza strumento semplice. Ciò è particolarmente importante, perché la maggior parte dei laboratori e piccole imprese non siano in grado di accedere ai servizi di base di microarray. Microarrays dell'anticorpo Tale funzione avanzata di codici a barre di throughput test e possono essere utilizzati per eseguire analisi altamente multiplex su singole cellule, raggiungendo un'elevata sensibilità e specificità paragonabile a quella del convenzionale immunosorbent assay panino enzyme-linked (ELISA 8). Questa tecnologia ha trovato numerose applicazioni nel rilevare proteine ​​da glioblastoma 9-11, le cellule T 12, e cellule tumorali circolanti 13. In alternativa, microarray di DNA barcode sola sono stati utilizzati nel posizionamento preciso dei neuroni e astrociti per Mimickzione l'assemblea in vivo del tessuto cerebrale 14.

Questo protocollo si concentra solo sui gradini sperimentali e blocchi di accumulo di bidimensionale (2-D) del codice a barre microarray anticorpo che ha potenziali applicazioni nel rilevamento dei biomarcatori in campioni fluidici e in singole cellule. La tecnologia è basata su un indirizzabile a singolo filamento, unidimensionale (1-D) microarray DNA costruite con oligonucleotidi ortogonali che sono modellate spazialmente su substrati di vetro. Il modello 1-D si forma quando i canali di flusso paralleli sono utilizzati nel passaggio di flusso-patterning, e un tale modello appare come bande discrete visivamente simili a 1-D Universal Product Code (UPC) di codici a barre. La costruzione di una matrice 2-D anticorpi (n x m) - ricorda un codice a matrice 2-D Quick Response (QR) - richiede strategie patterning più complesse, ma permette l'immobilizzazione di anticorpi ad una densità più alta 8,15. La fabbricazionerichiede due fasi patterning DNA, con il primo pattern perpendicolari al secondo. I punti di intersezione di questi due modelli costituiscono i n x m elementi della matrice. Selezionando strategicamente le sequenze di DNA a singola elica (ssDNA) utilizzati in flow-patterning, ogni elemento in un dato array viene assegnato un indirizzo specifico. Questo riferimento spaziale è necessario distinguere tra segnali di fluorescenza sul vetrino microarray. L'array ssDNA viene convertito in un array di anticorpi attraverso l'incorporazione di coniugati DNA-anticorpo complementari, formando una piattaforma chiamata biblioteca anticorpi DNA-codificato (DEAL 16).

Questo protocollo video descrive i passaggi chiave nella creazione di array nxm anticorpi che comprendono la preparazione di polidimetilsilossano (PDMS) stampi di codici a barre, flow-patterning ssDNA in due orientamenti, la preparazione di anticorpi coniugati oligonucleotide DEAL, e convertendo l'array 3 x 3 DNA in una 3x 3 matrice anticorpo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Attenzione: Diversi prodotti chimici utilizzati in questo protocollo sono irritanti e sono pericolosi in caso di contatto con la pelle. Consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) e indossare dispositivi di protezione adeguati prima di eseguire questo protocollo. La soluzione piranha utilizzato nel passaggio (1.1.1) è altamente corrosivo e deve essere preparata con l'aggiunta del perossido lentamente all'acido con agitazione. Maneggiare questa soluzione con estrema cautela in una cappa aspirante. Usare occhiali di protezione adeguato e guanti resistenti agli acidi. Trimetilclorosilano (TMCS) è un corrosivo, chimico infiammabile utilizzato in un passaggio facoltativo dopo (1.1.6). Gestire questa sostanza chimica in una cappa aspirante.

Nota: Eseguire la fabbricazione di codici a barre di scorrimento e le procedure di flow-patterning critici in una camera pulita per minimizzare la contaminazione da particolato. Le particelle di polvere possono bloccare le porte e le microcanali di stampi PDMS e interferire con il flusso-patterning.

1. Costruzione del One-dimensionall DNA Barcode diapositive

  1. Preparazione del master SU-8 per modelli di flusso barcode
    Nota: I disegni per i modelli di flusso perpendicolare (figura 1A-B) vengono creati utilizzando un software per computer-aided design (CAD). Questi modelli sono resi su una fotomaschera cromato. Le aree trasparenti della maschera corrispondono alle caratteristiche del maestro SU-8.
    1. Pulire un wafer di silicio (diametro 100 mm) a fondo in una miscela di 3 H 2 SO 4: 1 30% H 2 O 2 (soluzione Piranha) riscaldata a 96 ° C. Lavare il wafer con acqua deionizzata e alcol isopropilico, seguito da essiccazione con una pistola di azoto colpo.
    2. Versare circa 4 ml di SU-8 2025 photoresist sul wafer. Utilizzare uno spin coater programmabile per diffondere uniformemente il fotoresist sul wafer per 10 sec a 500 rpm, quindi 30 secondi a 3000 rpm. Questo crea uno strato di resina fotosensibile con uno spessore di ~ 25 micron. Gradualmente permettono filando a rallentare prima di fermarsi - questo è quello di Maintain anche un rivestimento sulla superficie del wafer.
    3. Cuocere il wafer rivestito su una piastra per 1 min a 65 ° C, poi per 5 minuti a 95 ° C. Questa fase permette il rivestimento solidificare. Raffreddare a temperatura ambiente per 5 minuti.
    4. Posizionare la maschera di cromo (Figura 1C) sul manto di resina fotosensibile. Esporre le caratteristiche della maschera alla luce vicino-UV (350-400 nm, energia esposizione 150-160 mJ / cm 2) per 20 sec.
      Nota: Il disegno sulla maschera cromo contiene 20 canali, ciascuno dei quali 20 micron di larghezza con 50 micron passo. I canali sono tortuose da un'estremità del modello all'estremità opposta. Complessivamente, i 20 canali coprono un'area rettangolare con una lunghezza di ~ 40 mm e una larghezza di 20 mm ~. Ogni canale è fiancheggiato da due elementi circolari che corrispondono a un ingresso ed una uscita. Ingressi e le uscite sono intercambiabili.
    5. Cuocere la cialda esposta su una piastra per 5 min a 95 ° C. Raffreddare a Rt gradualmente.
    6. Immergere il wafer di SU-8 sviluppatore con agitazioneper 5 min. Lavare il wafer con una piccola porzione di fresco SU-8 sviluppatore, seguito da alcol isopropilico. Asciugare il wafer con una pistola di azoto colpo. Hard-bake il wafer su una piastra riscaldante a 200 ° C per 30 min, e consentire il wafer raffreddare gradualmente a RT.
      Nota: lo sviluppo può essere eseguita per un tempo più lungo se una pellicola bianca si osserva dopo il lavaggio in questa fase.
      Opzionale: Silanizzazione il SU-8 master esponendolo alla trimetilclorosilano vapore in una capsula di Petri chiusa per 10 minuti.
  2. Preparazione dello stampo PDMS barcode
    1. Combina 40,0 g elastomero siliconico base con 4,0 g agente indurente. Lavorare l'impasto prepolimero vigorosamente per 10 min. Degas per 20 minuti sotto vuoto.
      Nota: Come regola generale, utilizzare un 10: 1 (base: induritore) rapporto di massa.
    2. Versare il prepolimero in una capsula Petri contenente un wafer di silicio con il SU-8 padrone del modello codice a barre. L'altezza della miscela PDMS dovrebbe essere di circa 7.5 mm o superiore. Degassare la miscela nella Petri piatto per una seconda volta per rimuovere eventuali bolle rimanenti, quindi cuocere la miscela per 1 ora a 75 ° C per consentire PDMS per curare.
      Nota: È importante mantenere abbastanza spessore della lastra PDMS a ~ 7.5 mm o superiore per evitare di aggiungere troppa tensione al legame PDMS vetro all'inserimento dei perni / tubi attraverso i fori dello stampo PDMS nel passaggio (1.3.3.1)
    3. Usando un bisturi, accuratamente tagliare intorno alla zona della lastra PDMS che contiene gli stampi di codici a barre e sbucciare la lastra dal wafer.
    4. Tagliare i bordi della lastra per ottenere la forma desiderata dello stampo PDMS barcode. Punch 20 fori (diametro 1,0 mm) attraverso lo stampo con un pugno biopsia con stantuffo. Assicurarsi che i fori siano allineati con le caratteristiche circolari del modello di codice a barre. Questi fori servono come gli ingressi e le uscite.
  3. Patterning monodimensionale di poli-L-lisina (PLL)
    1. Rimuovere la polvere sulla superficie di un vetrino rivestito con poli-L-lisina utilizzando una pistola azoto colpo. Attach lo stampo PDMS al vetrino pulito. Assicurarsi che i bordi dello stampo e la slitta sono allineati.
    2. Cuocere per 1,5 ore a 75 ° C per rafforzare il legame tra lo stampo PDMS e il vetrino PLL rivestite. Nel frattempo, preparare 20 pezzi di tubo di polietilene flessibili (da 3 a 4 pollici pezzi, con un diametro interno di 0,5 mm e un diametro esterno di 1,5 mm).
      Nota: Il numero di pezzi di tubo corrisponde al numero di ingressi nello stampo PDMS barcode. Il tubo serve ad accoppiare i canali sul codice a barre stampo PDMS ad un serbatoio di azoto dotato di un regolatore di pressione.
    3. Ad una estremità di ogni pezzo di tubo, collegare un acciaio inossidabile perno cavo (diametro 1 mm). Aspirare filtrata sterile soluzione attraverso il perno poli-L-lisina, fino almeno 1 cm del tubo è riempito con la soluzione.
      1. Fissare i perni (collegati alla tubazione soluzione pieno) alle prese del codice a barre di stampo PDMS (Figura 1E). Attaccare l'altra estremità dei tubiun serbatoio di azoto con regolazione della pressione di set-up. Lasciare la soluzione di fluire attraverso lo stampo con un intervallo di pressione di 0,5-1 psi per almeno 6 ore.
        Nota: Fare riferimento al punto (1.3.3) per tutte le procedure di flusso-patterning.
  4. Patterning unidimensionale del ssDNA 14
    Nota: Il tampone fosfato salino (PBS) utilizzati in fasi successive viene preparato da 137 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4, e 2 mM KH 2 PO 4. Il pH del tampone è 7.4.
    1. Preparare bis suberato (BS3) Soluzione 2 mm (sulfosuccinimidyl) in PBS. Preparare 300 pM soluzioni di A, B, e C ssDNA (5'-ammina modificata, 80 nucleotidi) in PBS o acqua ultrapura.
      Nota: Utilizzare la soluzione BS3 entro circa 30 minuti dopo la preparazione, perché la -hydroxysuccinimide estere N subisce facilmente idrolisi.
    2. Combinare 2,5 ml di 300 mM A, B, C o ssDNA con 2,5 ml di 2 mM bis (sulfosuccinimidyl) suberato in PBS per ciascun canale. A B, C e DNA, sono designati ai canali 1, 2, e 3, rispettivamente. Questo ordine è applicato anche ai restanti gruppi di 3 canali (Figura 2A).
    3. Eseguire il passo (1.3.3). Questa volta, aspirare il 5-microlitri soluzioni BS3 / DNA attraverso perni in acciaio inox e in tubo di polietilene, quindi coppia lo stampo PDMS la fonte di azoto. Lasciare la soluzione BS3 / DNA di fluire attraverso lo stampo barcode per circa 40 minuti o fino a che i canali vengono riempiti.
    4. Arrestare il flusso una volta tutti i canali sono pieni, poi incubare la soluzione BS3 / DNA nel codice a barre a temperatura ambiente per 2 ore. Non lasciare che la soluzione per asciugare. Cuocere lo stampo PDMS con annesso scivolo codice a barre per 1 ora a 75 ° C.
      Nota: Per facilitare la regolazione in successive fasi di flusso-patterning, i bordi del modello di canale sul vetrino barcode possono essere delineati. Questo viene fatto graffiare cura la superficie di vetro con un Scrib diamantee per generare segni di allineamento sulla parte inferiore del vetrino. Allineamento in fasi successive del protocollo può essere controllato al microscopio.
    5. Togliere lo stampo PDMS dalla diapositiva codice a barre. Lavare il vetrino delicatamente con lo 0,01% SDS volte una volta e tre con acqua ultrapura.
      1. Asciugare il vetrino del codice a barre con un filatore vetrino da microscopio. Conservare il vetrino di codici a barre in un ambiente pulito da 50 ml provetta da centrifuga per un uso successivo.

2. Convalida del modello unidimensionale sulla diapositiva di codici a barre

Nota: Questo protocollo convalida può anche essere adattato per l'uso nella valutazione della qualità di fasi successive del flusso patterning.

  1. Blocco della slitta
    1. Preparare 1% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,45 micron prima dell'uso. Utilizzando una punta gel-loading, applicare 50 ml di soluzione di BSA 1% di un bordo della slitta barcode.
    2. Incubare il 1% di BSA solution per 1 ora a RT.
  2. Incubazione con Cyanine 3 (Cy3) coniugata DNA complementare
    1. Preparare un cocktail di A ', B', e oligonucleotidi C 'coniugato con Cy3 ad una estremità. Le sequenze di A ', B' e C 'sono complementari a quelle di A, B, e C, rispettivamente. La concentrazione di lavoro del Cy3-DNA è di 0,05 micron di 0,1% di BSA.
    2. Rimuovere la soluzione BSA dal vetrino pipettando, quindi applicare 30 ml di soluzione di DNA cocktail sullo stesso bordo della diapositiva. Incubare il cocktail Cy3-DNA sul vetrino a temperatura ambiente per 1 ora. Eseguire questo passaggio di incubazione al buio per proteggere la parte Cy3 da photobleaching.
  3. Analisi di fluorescenza
    1. Pipettare il cocktail Cy3-DNA e lavare il vetrino in 1% BSA, PBS, e infine in PBS diluito (1 parte PBS con 50 parti di acqua ultrapura). Asciugare il vetrino con una filatrice.
    2. Osservare la fluorescenza (Figura 2B) usando un microscopio a fluorescenza o scanner microarray. Quando si utilizza un scanner per microarray, impostare la lunghezza d'onda di emissione del laser a 532 nm, la dimensione dei pixel a 5 micron, tubo fotomoltiplicatore (PMT) guadagno a 450 e la potenza al 15%.

3. Realizzazione della matrice a 2 dimensioni (3x3) del DNA 14

  1. Preparazione dello stampo PDMS barcode
    1. Eseguire la procedura (1.1) per costruire un altro SU-8 master ma questa volta utilizzando una maschera di cromo con un modello di flusso perpendicolare a quella del primo disegno. Eseguire la procedura (1.2) per costruire un nuovo stampo PDMS con il modello perpendicolari.
  2. Patterning flusso bidimensionale di ssDNA
    1. Per una matrice 3 x 3, preparare 150 micron soluzioni stock di A'-i, B'-ii, C'-iii, A'-iv, B'-v, C'-vi, A'-VII, B'DNA -viii e C'-ix in 3% BSA / PBS. Questi oligonucleotidi servono come "sequenze ponte" (Figura 2A). Unire le soluzioni di oligonucleotidi (soluzioni da 1 a 3), tali che la concentrazione di lavoro è di 50 micron per ogni oligonucleotide. Utilizzare la guida fornita nella tabella 1.
    2. Flusso 3% BSA / PBS soluzione di saturazione in tutti i 20 canali per 1 ora a 0,5-1 psi.
    3. Flow Solutions 1, 2 e 3 in canali 1, 2, e 3, rispettivamente. Seguire questo ordine per le successive serie di 3 canali. Flusso si effettua in circa 40 minuti. Incubare le soluzioni di DNA a temperatura ambiente per 2 ore per consentire al DNA di ibridare.
    4. Flusso 3% BSA / PBS soluzione di saturazione in tutti i 20 canali per 1 ora a 0,5-1 psi per rimuovere il DNA unhybridized. Staccare la lastra PDMS, e lavare il conseguente scorrimento DNA microarray immergendo il vetrino in 3% BSA / PBS volta PBS due volte, seguito da PBS diluito (1 parte di PBS e 50 parti di acqua ultrapura). Dry il vetrino con un filatore vetrino da microscopio.
    5. Eseguire una seconda fase di validazione (Figura 2C) simile a quella nella sezione 2. Usare oligonucleotidi i 'a IX' che sono Cy3-coniugato. Conservare la matrice slitta 3 x 3 in una provetta da centrifuga da 50 ml per un uso successivo.
      Nota: Il DNA microarray può essere conservato a temperatura ambiente in un essiccatore per mesi.

4. La conversione del DNA array 3 x 3 in una matrice anticorpo

  1. Preparazione di anticorpi-oligonucleotide (DEAL) coniugati
    1. Preparare le soluzioni di 200 mm succinimidyl-4-formylbenzoate (S-4FB) e 40 mm succinimidyl-6-hydrazinonicotinamide (S-HyNic) in anidra N, N -dimethylformamide (DMF).
    2. Preparare fino a 7 soluzioni separate di anticorpi di cattura (1 mg / ml) in PBS.
      Nota: Se le soluzioni anticorpo azionari contengono sodio azide bacteriostat, eseguire lo scambio buffer con PBS usando rotazione dissalazione columns con 7 kDa peso molecolare di cut-off (MWCO).
    3. Preparare separati 400 micron soluzioni di i ', ii', iii ', IV', v ', vi', e il DNA vii. Assegnare ad ogni anticorpo di cattura per una sequenza di oligonucleotidi. Combina 40 ml di 400 micron DNA con 12,25 ml di DMF in tubi microcentrifuga e spin down per mescolare accuratamente.
      1. Per ogni soluzione di DNA / DMF, aggiungere 2,3 ml di 200 mm S-4FB in DMF. Per ogni 100 mg di anticorpo di cattura, aggiungere 2,25 ml di 40 mm S-HyNic in DMF.
    4. Incubare l'anticorpo / soluzioni S-HyNic e DNA / S-4FB per 4 ore a temperatura ambiente.
    5. In preparazione per la reazione di accoppiamento anticorpo-DNA, preparare nuove colonne rotazione dissalazione (uno per ogni soluzione di DNA e una per ciascun anticorpo) lavandoli con tampone citrato a pH 6.
    6. Dopo 4 ore di incubazione, eseguire lo scambio buffer per ogni anticorpo / S-HyNic e soluzione di DNA / S-4FB. Unire il S-4FB coniugato i ', ii', iii ', IV', v ', vi' e oligonucleotidi VII »con i coniugati di anticorpi-S-HyNic. Incubare le miscele per 2 ore a temperatura ambiente.
    7. Incubare la reazione O / N a 4 ° C.
  2. Purificazione di anticorpi-oligonucleotide (DEAL) coniugati
    Nota: Per purificare i coniugati anticorpo-oligonucleotide, eseguire proteina veloce cromatografia liquida (FPLC) su un sistema standard FPLC dotato di una colonna Superose 6 10/300 GL.
    1. Impostare la lunghezza d'onda del rivelatore UV del sistema FPLC a 280 nm. Utilizzare flusso isocratica di PBS (pH 7.4) a 0,3 ml / min per separare i coniugati anticorpo-oligonucleotide dall'eccesso S-4FB-DNA.
    2. Pool frazioni contenenti il ​​coniugato e concentrare le frazioni ad un volume di 150 ml con filtri di spin con un kDa MWCO 10.
  3. Patterning bidimensionale di anticorpi
    1. Preparare altro stampo PDMS con microchambers o noi micro-pozziing procedure di fabbricazione nel passaggio (1.2). Lo stampo PDMS può contenere microlitri di pozzi nanolitri per saggi immunologici.
      Nota: Per la rivelazione biomarker generale in campioni fluidici, uno stampo PDMS con più pozzetti è accoppiato con la slitta matrice. Le caratteristiche dello stampo PDMS dipendono dal sistema in fase di studio. Per esempio, la rilevazione di proteine ​​da esperimenti monocellulari può essere eseguita con uno stampo PDMS contenente microchambers con volumi 0,15-nl.
    2. (Opzionale) Oggetto stampo PDMS di plasma pulizia (18 W) per 1,5 minuti per rendere la sua fantasia idrofila superficie. Prima della pulizia al plasma, usare nastro adesivo per bloccare tutte le altre superfici che saranno direttamente legati alla matrice slitta 3 x 3.
      Nota: I passi (4.3.2) è facoltativo, ma è di solito eseguita quando lo stampo PDMS è destinato all'uso in esperimenti sulle cellule singole.
    3. Mate stampo PDMS con l'array slitta 3 x 3, quindi bloccare il vetrino con 1% BSA in PBS. Incubare per 1 ora a RT. Meanwhile, preparare un cocktail (200 ml volume finale) di coniugati anticorpo-oligonucleotide. La concentrazione di lavoro di ogni coniugato è di 10 mg / ml in 1% BSA / PBS.
    4. Aggiungere il cocktail di anticorpi-oligonucleotide, poi incubare per 1 ora a 37 ° C per permettere la porzione oligonucleotide dei coniugati di ibridare con macchie specifiche sulle 3 x 3 matrici, in modo da convertire l'array DNA di un array di anticorpi.
    5. Ripetere il punto (3.2.4) per pulire e asciugare il vetrino. La sensibilità più alta può essere raggiunto se la matrice anticorpo è utilizzato immediatamente. Conservazione prolungata può comportare la perdita di sensibilità.
  4. Rilevamento delle proteine
    1. Ricostituire proteine ​​ricombinanti o preparare un campione di cellule filtrato.
    2. Mate microarray con un chip su misura, e bloccare la superficie con 3% BSA in PBS per 1 ora. Quindi rimuovere la soluzione di BSA, e applicare i campioni e incubare per 2 ore.
    3. Lavare i campioni con il 3% di BSA in PBS per tre volte, unD Poi aggiungere anticorpi di rilevamento ad una concentrazione fornito da questa scheda. Incubare per 2 ore.
    4. Lavare gli anticorpi di rilevamento di 3% di BSA in PBS per tre volte, e poi aggiungere Cyanine 5 (Cy5) -streptavidin a 1 mg / ml, seguita da incubazione per 1 ora.
    5. Ripetere il punto (3.2.4) per pulire e asciugare il vetrino per la scansione.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I disegni per le PDMS stampi (Figura 1A-1B) sono stati elaborati utilizzando un programma CAD (AutoCAD). Due disegni illustrati presentano canali per il flusso patterning, uno orizzontale ed una verticale. Le parti sinistra e destra di ogni disegno sono simmetrici; uno di loro potrebbe essere ingressi o uscite. Ciascuno dei 20 canali è tortuoso da un'estremità fino all'altra estremità. Ogni disegno è stampato su una fotomaschera cromo (Figura 1C). Il fab...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Disegno del modello di flusso è il primo passo fondamentale per fabbricare microarray 2-D. Per generare due sovrapposti pattern di DNA su un substrato di vetro, le caratteristiche di canale del primo progetto devono essere perpendicolari a quelle del secondo (Figura 1A-B). I disegni considerano anche le applicazioni a valle del microarray. Nel caso di analisi singola cella, il microarray è utilizzato per rilevare proteine ​​da cellule singole racchiusi in microchambers, quindi le dimensioni di ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno interessi concorrenti da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare il fondo iniziale di SUNY Albany e l'accesso alle strutture presso l'Università presso il Centro di Ricerca sul Cancro dell'Albany.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Base in elastomero siliconico Sylgard 184Dow Corning3097366-1004
Agente indurente in elastomero siliconico Sylgard 184Dow Corning3097358-1004
SU-8 2025 fotoresistMicroChemY111069
wafer di silicio Wafer universitari452
Vetrini in vetro rivestiti di poli-L-lisinaThermo ScientificC40-5257-M20
OligonucleotidiIntegrated DNA Technologies*Ordinato su misura da Integrated DNA Technologies, vedere Tabella 2.
Soluzione madre adesiva di poli-L-lisinaNewcomer Supply1339
Bis (sulfosuccinimidyl) suberato  (BS3)Thermo Scientific21585
1x Soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7.4Qualità Biologica114-058-101
Ä kta Explorer 100 Sistema di cromatografia liquida proteica veloce (FPLC)GE (Amersham Pharmacia) 18-1112-41
Colonna Superose 6 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17-5172-01
Cattura gli anticorpivarivari*La selezione degli anticorpi dipende dall'applicazione
Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)SolulinkS-1002
Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)SolulinkS-1004
N,N-dimetilformammideSigma-Aldrich227056
Acido citrico, anidroAcros42356
Idrossido di sodioFisherScientific S318
Filtro centrifugo Amicon Ultra 10 kDa MWCOEMD MilliporeUFC201024
Spincoater Laurell TechnologiesWS-650-MZ
Punzone per biopsia con pistone (diametro 1,0 mm)Ted Pella, Inc.15110-10
Graffietto diamantato (Stile 60)SPI fornisce6004
TrimetilclorosilanoSigmaAldrich 92361

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
  2. Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
  3. Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
  4. Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
  5. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
  6. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
  7. Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
  8. Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
  9. Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
  10. Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
  11. Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
  13. Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499(2014).
  14. Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
  15. Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
  16. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
  17. Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
  18. Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow PatterningAntibody MicroarrayDNA Antibody ConjugatesPDMS Mold FabricationSingle Cell AnalysisSU 8 MasterPerpendicular Flow PatternMicroarray ValidationBiomarker DetectionCell Signaling Studies

Related Articles