Modellazione chemioterapia leucemia resistente In Vitro

Sommario

Il presente rapporto riassume un protocollo che può essere utilizzato per modellare l'influenza della nicchia del microambiente del midollo osseo sulle cellule leucemiche con particolare attenzione all'arricchimento della sottopopolazione più chemioresistente.

Abstract

È ben noto che il microambiente del midollo osseo fornisce un sito unico di santuario per le malattie ematopoietiche che iniziano e progrediscono in questo sito. Il modello presentato nel presente rapporto utilizza cellule stromali primarie del midollo osseo umano e osteoblasti come due tipi di cellule rappresentative della nicchia del midollo che influenzano il fenotipo delle cellule tumorali. Le condizioni di co-coltura in vitro descritte per le cellule leucemiche umane con questi componenti primari di nicchia supportano la generazione di una sottopopolazione chemioresistente di cellule tumorali che può essere recuperata in modo efficiente dalla coltura per l'analisi con diverse tecniche. Un rigoroso programma di alimentazione per prevenire i flussi di nutrienti seguito dal recupero delle particelle di destrano reticolato (G10) su gel di tipo 10 della popolazione di cellule tumorali che sono migrate sotto le cellule stromali aderenti del midollo osseo (BMSC) o degli osteoblasti (OB) generando una popolazione di cellule tumorali "phase dim" (PD), fornisce una fonte costante di cellule leucemiche purificate resistenti alla terapia. Questa popolazione di cellule tumorali clinicamente rilevante può essere valutata con metodi standard per studiare le vie di regolazione apoptotica, metabolica e del ciclo cellulare, oltre a fornire un obiettivo più rigoroso in cui testare nuove strategie terapeutiche prima di indagini precliniche mirate alla malattia residua minima.

Introduzione

L'obiettivo generale del metodo descritto è quello di fornire un approccio in vitro efficiente ed economico che supporti lo studio dei meccanismi che sono alla base della sopravvivenza delle cellule leucemiche supportate dal midollo osseo durante l'esposizione alla chemioterapia. È ben documentato che le cellule tumorali residue sopravvissute che persistono dopo il trattamento contribuiscono alla recidiva della malattia che è spesso più aggressiva di quella alla diagnosi ed è spesso trattata in modo meno efficace^1-8. I modelli che includono cellule leucemiche in isolamento, come quelli limitati alla coltura di cellule in soli terreni, per la sperimentazione di approcci terapeutici non tengono conto di questi segnali critici o dell'eterogeneità della malattia che si verifica in risposta alla disponibilità di segnali derivati da nicchia in cui sottopopolazioni di cellule tumorali con interazioni molto specifiche con cellule di nicchia derivano una maggiore protezione. I modelli standard di co-coltura 2D che co-coltivano cellule stromali e cellule leucemiche derivate dal midollo osseo hanno in qualche modo affrontato il contributo della nicchia del midollo osseo e hanno dimostrato che l'interazione con le cellule del microambiente del midollo osseo aumenta la loro resistenza alla chemioterapia e altera le loro caratteristiche di crescita^9-14. Questi modelli, tuttavia, spesso non riescono a ricapitolare la sopravvivenza a lungo termine delle cellule tumorali e non informano accuratamente i risultati associati alle popolazioni di cellule leucemiche più resistenti che contribuiscono alla MRD. I modelli in vivo rimangono fondamentali e definiscono il "gold standard" per lo studio di terapie innovative prima degli studi clinici, ma sono spesso messi alla prova dal tempo e dai costi necessari per testare ipotesi relative ai tumori resistenti e alla recidiva della malattia. Pertanto, lo sviluppo di modelli 2D più informativi sarebbe vantaggioso per le indagini pilota per informare meglio la progettazione del successivo disegno preclinico basato sui muri.

Il modello 2D in vitro presentato in questo rapporto manca della complessità del vero microambiente in vivo, ma fornisce un mezzo economico e riproducibile per interrogare le interazioni tumorali con il microambiente che si presta specificamente all'arricchimento della sottopopolazione chemioresistente di cellule tumorali. Questa distinzione è preziosa in quanto la valutazione dell'intera popolazione di cellule tumorali può mascherare il fenotipo di un gruppo minore di cellule tumorali resistenti alla terapia che costituiscono il bersaglio più importante. Un ulteriore vantaggio è la scalabilità del modello per adattarsi all'analisi di interesse. Le colture di massa possono essere stabilite per quelle analisi che richiedono un recupero significativo di cellule tumorali, mentre le co-colture su piccola scala in piastre multi-pozzetto possono essere utilizzate per analisi basate su PCR o valutazioni basate sulla microscopia.

Sulla base di questa esigenza, abbiamo sviluppato un modello in vitro per affrontare l'eterogeneità della malattia che è caratteristica della leucemia linfoblastica acuta (ALL) del lignaggio B. Dimostriamo che le cellule LLA, che condividono molte caratteristiche in comune con le loro controparti sane, si localizzano in compartimenti distinti di co-coltura di BMSC o OB. Vengono generate tre popolazioni di cellule tumorali che hanno fenotipi distinti che sono preziosi per lo studio della risposta terapeutica. In particolare, dimostriamo che le cellule (ALL) recuperate dalla popolazione "phase dim" (PD) di co-coltura sono costantemente refrattarie alla terapia con sopravvivenza che si avvicina alle cellule tumorali che non sono state esposte ad agenti citotossici. Queste cellule LLA, provenienti da linee cellulari consolidate o da campioni primari di pazienti, migrano sotto le cellule stromali aderenti o gli strati di osteoblasti, ma possono essere catturate in seguito alla tripsinizzazione delle colture e alla separazione dei tipi di cellule mediante l'utilizzo di colonne di particelle di destrano reticolato (G10) su gel di tipo 10¹⁵.

Qui presentiamo una configurazione di una co-coltura 2D che può essere impiegata per modellare le interazioni tra le cellule stromali del microambiente del midollo osseo (BMSC/OB) e le cellule leucemiche. Di particolare importanza è l'osservazione che le cellule leucemiche formano tre sottopopolazioni spaziali relative al monostrato di cellule stromali e che la popolazione PD rappresenta una popolazione tumorale resistente alla chemioterapia a causa della sua interazione con il BMSC o l'OB. Inoltre, dimostriamo come isolare efficacemente le popolazioni di cellule leucemiche mediante colonne G10. Da notare, abbiamo scoperto che l'isolamento di queste sottopopolazioni consente l'analisi a valle della popolazione di PD più resistente per determinare le potenziali modalità di resistenza che vengono conferite a queste cellule a causa della loro interazione con le cellule stromali del microambiente del midollo osseo o gli osteoblasti. Le tecniche che abbiamo utilizzato a valle di questo modello di co-coltura e isolamento includono la valutazione citometrica a flusso, l'analisi proteomica e la valutazione dell'espressione proteica mirata, nonché l'ablazione laser a ionizzazione elettrospray (LAESI) e l'analisi del cavalluccio marino per valutare i profili metabolici. Attraverso l'uso di questo modello in combinazione con le tecniche di cui sopra abbiamo scoperto che la popolazione di cellule leucemiche PD ha un fenotipo resistente alla chemioterapia che è unico se confrontato con le cellule leucemiche coltivate in terreni da soli o quelle recuperate dalle altre sottopopolazioni nella stessa co-coltura. In quanto tale, questo modello si presta a una valutazione più rigorosa per testare strategie mirate alle cellule leucemiche più resistenti alla chemioterapia che derivano il loro fenotipo resistente attraverso l'interazione con il microambiente del midollo osseo.

Protocollo

1. Preparazione avanzata

1. Preparazione particelle G10 destrano.
   1. Preparare G10 impasto con l'aggiunta di 50 ml di PBS 1X a 10 particelle g G10. Mescolare per inversione e consentire G10 a stabilirsi fuori tampone fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
   2. Il giorno del G10 di separazione colonna, aspirare PBS dalle particelle del G10 stanziali e aggiungere 50 ml di PBS fresco. Mescolare per inversione. Ripetere due volte, aggiungendo 50 ml PBS fresco di particelle G10 stabiliti e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
2. Coltura BMSC e OB.
   1. Mantenere sia BMSC o OB a 37 ° C in 6% CO _{2 e} coltivati ​​su 10 cm piastre di coltura tissutale fino al raggiungimento del 90% di confluenza.
   2. Trypsinize BMSC o cellule OB e dividere 1: 2 su nuove piastre di 10 cm. Le cellule sono coltivate a tali norme fino al momento leucemica co-coltura.

2. Stabilire e mantenere Co-cultura

1. Aggiungere 5-20 x 10 ^{6 cellule} leucemiche in 10 ml di specifici terreni di coltura del tumore Onto un 80% -90% confluenti BMSC o la piastra OB.
   NOTA: Il nostro laboratorio mantiene co-colture a 37 ° C in 5% O ₂ ricapitolare meglio microambiente midollare che ha dimostrato variare da 1% al 7% ^16-18. Tuttavia, il mantenimento co-colture in questa tensione di ossigeno non è critico per l'istituzione dei tre sottopopolazioni leucemiche ed è a discrezione del laboratorio.
2. Ogni 4 ^{° giorno} rimuovere tutti ma 1 ml di media (tra cui le cellule leucemiche in sospensione) e sostituirlo con 9 ml di terreni di coltura leucemica fresco. Durante la rimozione 9 ml di media dal piatto, fare attenzione a non disturbare il lardo aderente BMSC o OB.
   1. Rimuovere supporti inclinando piastra al supporto laterale e aspirato in un angolo della piastra. Inoltre, quando si aggiunge mezzi freschi, assicurarsi di aggiungere goccia a goccia in un angolo del piatto contro la parete laterale per garantire il minimo disturbo dello strato aderente BMSC o OB.
3. Dopo il 12 ^{° giorno di} co-coltura, lavare le cellule leucemiche da BMSC o strato OB pipettando terreni di coltura dal piatto su e giù delicatamente sopra il piatto di circa 5 a 10 volte e poi raccogliere in tubo da 15 ml. Reseed sul nuovo 80% -90% BMSC confluenti o piastra OB come descritto al punto 2.1.
   NOTA: Il dolce risciacquo della co-coltura come descritto al punto 2.3 verrà rimosso S e PB cellule leucemiche senza interrompere il monostrato BMSC o OB. Questo permette alle cellule tumorali solo per essere trasferite nel successivo piastra di co-coltura. Questo ciclo di 12 giorni può essere ripetuto tante volte quante sono necessarie in base alle esigenze degli utenti.

3. Preparazione Colonne G10 Bead

NOTA: Se è richiesta l'analisi a valle sterile o coltura dopo la separazione colonna G10 le seguenti operazioni devono essere eseguite con tecnica sterile e le colonne del G10 dovrebbe essere messa a punto in una cappa biologica sterile.

1. Pre-warm coltura cellulare supporti a 37 ° C in bagno d'acqua (~ 30 ml per colonna). Usando una siringa monouso ml 10, rimuovere ed eliminare stantuffo. Aggiungere lana di vetro a siringa.
2. Usando le pinzette, separare lana di vetro in trefoli sottili. Aggiungere più strati di lana di vetro leggermente imballato alla siringa fino a quando 2/3 della siringa è pieno di lana di vetro.
   NOTA: La lana di vetro è di fondamentale importanza per evitare che particelle G10 libere di contaminare la raccolta delle cellule leucemiche. Assicurarsi lana di vetro è imballato abbastanza per sostenere le particelle G10, ma non troppo densamente imballato per bloccare il flusso multimediale attraverso la colonna.
3. Attaccare 1-way rubinetto alla punta della siringa nella posizione chiusa.
4. Morsetto colonna siringa per anello di stare abbastanza alto in modo da un tubo conico da 50 ml (tubo di raccolta) può essere posizionato sotto il rubinetto. Mettere tubo di raccolta nella colonna siringa.
5. Usando una pipetta 10 ml aggiungere, goccia a goccia, le particelle G10 risospesi in PBS alla colonna in cimala lana di vetro. Continuare aggiungendo particelle G10 fino a ml pellet ~ 2 (come misurato dal graduazioni sulla siringa) di G10 particelle forme sopra della lana di vetro.
6. Equilibrare la colonna G10 con i media pre-riscaldato.
   1. Aggiungere 2 ml di media pre-riscaldato a colonna. Aprire la valvola rubinetto lentamente in modo che il supporto fuoriesce colonna goccia a goccia.
   2. Ripetere il punto 3.6.1 fino ad un totale di 10 ml di media pre-riscaldato è stato eseguito attraverso la colonna.
      NOTA: Se le particelle G10 si vedono nel flusso attraverso il tubo di raccolta, o 1) aggiungere più particelle del G10 di mantenere ~ 2 ml pellet assicurandosi che nessuna particella aggiuntivi G10 fuga dalla colonna o 2) sostituzione della colonna con uno inutilizzato e ripetere passi 3.4-3.6.1.
   3. Dopo gli scarichi dei media pre-riscaldato dalla colonna, chiudere il rubinetto e scartare tubo di raccolta con flusso attraverso. Aggiungere un nuovo tubo di raccolta sotto la colonna. Colonna è pronto per essere caricato con supporti + miscela di cellule.
      NOTA: Colonnedeve essere usato immediatamente e non ha permesso di asciugare.

4. Separare 3 sottopopolazioni all'interno di Co-cultura

1. Raccolta di sottopopolazione di sospensione (S) del tumore.
   1. supporti Aspirare dalla piastra di co-coltura con pipetta e delicatamente riapplicare lo stesso supporto per sciacquare la piastra e raccogliere supporti contenenti cellule leucemiche in un tubo da 15 ml. Le cellule leucemiche raccolti sono la sottopopolazione S.
2. Raccolta di Fase Bright (PB) sottopopolazione tumorale.
   1. Aggiungere 10 ml di mezzi freschi di nuovo sul piatto co-coltura. Risciacquare vigorosamente pipettando mezzi aggiunti su e giù per circa 5 volte per rimuovere le cellule leucemiche aderenti ma non abbastanza difficile da staccare aderente / OB componente BMSC.
   2. Aspirare con pipetta e raccogliere i media in un tubo da 15 ml. Le cellule raccolte sono la sottopopolazione PB.
3. Raccolta di Fase Dim (PD) sottopopolazione tumorale.
   1. Piastra Risciacquare con 1 ml di PBS a remsupporti rimanenti ove. Trypsinize piastra di co-coltura con 3 ml di tripsina e posto in 37 ° C incubatore per 5 min.
   2. Rimuovere la piastra di incubatore e picchiettare delicatamente lati della piastra per rimuovere aderente BMSC / OB.
   3. Aggiungere 1 ml di siero fetale bovino (FBS) e pipetta su e giù 3-5 volte di spezzare grandi aggregati di cellule.
   4. Raccogliere media con cellule in una provetta da 15 ml. Queste cellule sono sottopopolazione PD non purificata con BMSC / OB pure.
4. Centrifuga 3 isolato sottopopolazioni a 400 xg per 7 minuti. Aspirare e scartare il surnatante quindi risospendere individualmente pellet in 1 ml di media pre-riscaldato. Le cellule sono pronte per essere caricata su una colonna G10.

5. Caricamento co-coltura cellule su G10 Colonna

NOTA: Assicurarsi che il rubinetto sia completamente chiuso prima di aggiungere le cellule supporti contenenti la colonna G10. Inoltre, ogni sottopopolazione deve essere eseguito su una colonna G10 separato in modo da non introducuna e ogni pregiudizio tra le popolazioni in analisi a valle.

1. Usando una pipetta 1000 ml, aggiungere 1 ml di ciascuna sottopopolazione di cellule nei media pre-riscaldato a una colonna G10 separata goccia a goccia. Assicurarsi che il supporto contenente le cellule rimane sopra o all'interno G10 pellet. Consentono alle cellule di incubare il G10 a pellet per 20 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Stopcock rimane chiuso per durata dell'incubazione.

6. Raccolta cellule leucemiche da G10 Colonna

1. Aggiungere 1-3 ml supporti pre-riscaldato a ogni colonna G10. Valvola rubinetto aperto e consentire mezzi per uscire lentamente la colonna goccia a goccia.
   NOTA: E 'fondamentale per mantenere una portata lenta dalla colonna o il pellet contenente G10 BMSC / OB può lavare fuori della colonna e contaminare le isolate cellule leucemiche.
2. Continuare ad aggiungere supporti pre-riscaldato con piccoli incrementi (1-2 ml) a colonna G10 fino a un totale di 15 a 20 ml ha attraversato colonna e sono state raccolte. Chiudere il rubinetto vatubo di raccolta lve e cappuccio.
   NOTA: se una pallina G10 particella è visto nella parte inferiore della provetta di raccolta, rimuovere delicatamente il supporto dal tubo lasciando G10 grano di particella indisturbati e trasferimento al nuovo tubo.
3. Centrifuga raccolte supporto a 400 xg per 7 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in tampone appropriato per l'applicazione a valle.
4. Le cellule sono ora una popolazione pura di cellule leucemiche gratuitamente BMSC o contaminazione OB e sono pronti per essere applicato ad applicazioni a valle a discrezione dell'utente.
   NOTA: vitalità cellulare leucemica dovrebbe rimanere invariato quando si passa celle attraverso le colonne del G10.

Risultati

L'installazione di successo e la cultura di questo modello di co-coltura comporterà la creazione di 3 sottopopolazioni di cellule leucemiche relativi alla aderenti BMSC o OB monostrato. Figura 1 mostra come tutte le cellule seminate in un monostrato BMSC appaiono inizialmente come una sola popolazione di sospensione cellule leucemiche. Nel corso di 4 giorni cellule leucemiche interagiscono con il BMSC per formare 3 sottopopolazioni spaziali di cellule leucemiche (sospeso...

Discussione

malattia residua minima (MRD) che contribuisce alla ricaduta della malattia continua ad essere una sfida clinica nel trattamento aggressivo refrattario ALL, nonché una serie di altre neoplasie ematologiche. Il microambiente del midollo osseo è il sito più comune di recidiva in ALL ^3,8. In quanto tale, i modelli che modellano il microambiente del midollo osseo sono strumenti essenziali per testare ipotesi legate alla sopravvivenza delle cellule tumorali leucemiche e manutenzione di MRD durante l'esposizion...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Perline di sephadex G10	Sigma	G10120	Indicato nel manoscritto come gel tipo 10 particelle di destrano reticolato
Siringa sterile da 10 ml	BD	309604
Lana di vetro	Pyrex	3950
Rubinetti a 1 via	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
Provette da centrifuga coniche da 50 ml	medici mondiali	41021039	Utilizzato come provette
da centrifuga coniche da 15 ml	medici mondiali	41021037	Utilizzato per la raccolta di cellule
Siero bovino fetale	Sigma	F6178
0,05% Tripsina	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Piastre per colture cellulari	Greiner Bio-One	664160<
strong>Terreni di coltura
Terreni di coltura per osteoblasti	PromoCell	C-27001	Per terreni di osteoblasti umani
RPMI 1640 media	Mediatech, Inc.	15-040	Per la preparazione dei terreni tumorali
Linee cellulari
Cellule aderenti:
Osteoblasti umani	PromoCell	C-12720	L'osteoblasto umano è stato coltivato secondo il fornitore" s raccomandazioni.
Cellule stromali di Morrow osseo umano	umano WVU Biospecimen Core		Leucemia umana primaria de-identificata e cellule stromali del midollo osseo (BMSC) sono state fornite dal Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core e dal Dipartimento di Patologia della West Virginia University. Le colture BMSC sono state stabilite come descritto in precedenza (*)
Cellule leucemiche:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	Le cellule REH sono state coltivate secondo il fornitore" s raccomandazioni e supporti consigliati.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 sono stati coltivati secondo il fornitore' s raccomandazioni e supporti consigliati.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Interruzione della funzione delle cellule stromali del midollo osseo da parte dell'etoposide. Trapianto di midollo sanguigno Biol J am Soc trapianto di midollo sanguigno. Agosto 1997; 3(3):122–32.