Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

Summary

Qui, si descrive un metodo per la purificazione delle cellule staminali embrionali differenziate umane che si sono impegnati verso l'endoderma definitivo per il miglioramento delle applicazioni a valle e ulteriori differenziazioni.

Abstract

Le capacità di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti come le cellule staminali embrionali (ESC) permettono una potenziale applicazione terapeutica per le terapie di sostituzione cellulare. Terminally tipi di cellule differenziate potrebbero essere utilizzati per il trattamento di varie malattie degenerative. In vitro differenziazione di queste cellule verso tessuti del polmone, fegato e pancreas richiede come primo passo la generazione di cellule endodermico definitive. Questo passaggio è limitante per un'ulteriore differenziazione verso tipi di cellule terminalmente maturate come le cellule beta produttrici di insulina, epatociti o altri tipi di cellule endoderma-derivati. Le cellule che si sono impegnati nei confronti della stirpe endoderma altamente esprimono una moltitudine di fattori di trascrizione come Foxa2, SOX17, HNF1B era, i membri della famiglia GATA, e il recettore CXCR4 superficiale. Tuttavia, i protocolli di differenziazione sono raramente efficiente al 100%. Qui, si descrive un metodo per la purificazione di una popolazione di cellule CXCR4 + dopo la differenziazionenella DE utilizzando microsfere magnetiche. Questa purificazione elimina inoltre le cellule di linee indesiderate. Il metodo di purificazione delicata è veloce e affidabile e può essere utilizzata per migliorare le applicazioni a valle e differenziazioni.

Introduction

Le cellule staminali pluripotenti come le cellule staminali embrionali (ESC) hanno la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula del corpo umano. Così, in vitro protocolli di differenziazione possono essere utilizzati per generare numerosi tipi cellulari adulto come cardiomiociti ^1, epatociti ^2, cellule beta ^3, epiteliale polmonare ⁴ o cellule neuronali ^5. Questo rende CES uno strumento prezioso per il potenziale trattamento di diverse malattie degenerative ^3.

La differenziazione in vitro dei CES verso tessuti adulti del polmone, del fegato e ....

Protocol

1. Differenziazione dei CES umana verso endoderma definitivo

1. Coltivare cellule staminali embrionali umane (CES) in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Coat una nuova piastra di coltura cellulare 6 pozzetti con 1 ml di una matrice membrana basale e incubare la coltura-ware per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Per informazioni specifiche si prega di girare le istruzioni del rispettivo produttore.
3. Verificare che i CES umane coltivate hanno raggiunto l'80% -90% di confluenza al microscopio con un ingrandimento basso (ad esempio, 4X). Aspirare il supporto dalle cavità succhiando via del mezzo con un bicchiere....

Results

Su differenziazione CES subiscono drastici cambiamenti di espressione genica e proteica. La figura 1 illustra geni marcatori tipici che possono essere utilizzati per verificare una differenziazione endoderma successo. Obiettivi principali per l'analisi di espressione genica sono GSC, Foxa2 e SOX17. In un parente analisi di espressione genica in particolare Foxa2 e SOX17 sono aumentate di> 2.000 volte risp.......

Discussion

protocolli di differenziazione Attualmente utilizzati raramente si traducono in 100% di cellule differenziate. Per ragioni che devono ancora essere affrontate alcune cellule resistono il processo di differenziazione. A seconda della efficienza del protocollo differenziazione utilizzato e la propensione del CES linea un certo numero di cellule pluripotenti residue vengono comunemente osservato anche dopo differenziamento in endoderma definitiva. Queste cellule residue possono compromettere differenziazioni a valle o ulte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linea di cellule staminali embrionali umane Hues8	Dipartimento di cellule staminali e biologia		Linea cellulare adatta per la generazione dell'endoderma
Linea di cellule staminali embrionali umane Hes3	ES Cell International		Linea cellulare adatta e robusta per la generazione dell'endoderma
mTeSR1	Stemcell Technologies	5850	Terreno di coltura ESC
FCS	Biowest	S1860
Advanced RPMI 1640	Life Technologies	12633012
CD184 (CXCR4)-APC, umano	Miltenyi Biotec	130-098-357
anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
Separatore OctoMACS	Miltenyi Biotec	130-042-109	campo magnetico
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Inibitore ROCK
CHIR-99021	Tocris Bioscience	4423
Activina A	Peprotech	120-14
Reagente di dissociazione cellulare delicato	Tecnologie delle cellule staminali	7174	Senza enzimi soluzione di passaggio, alternativa: Tripsina/EDTA
Matrigel*	Corning	354277	matrice di membrana basale * risolvere e conservare in aliquote a -80 ° C come indicato nel manuale dei fornitori. Dopo l'uso, scongelare con ghiaccio, diluire in 25 ml di knockout ghiacciato DMEM/F-12. Aggiungere 1 ml a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il matrigel e utilizzare immediatamente.
Colonne MS	Miltenyi Biotec	30-042-201
Separatore MACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Umano FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga	Life Technologies	NA
Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta	Life Technologies
Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt	Life Tecnologie GSC
umano REV ctctgatgaggaccgcttctg	Life Technologies
SOX17 TaqMan assay	Applied Biosystems	Hs00751752_s1
Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg	Life Technologies
Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag	Life Technologies
Umano POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg	Tecnologie di vita Umano
POU5F1 REV ctgcagtgtgggtgtttcgggca	Tecnologie
Nanog umano FW ccgagggcagacatcc	Tecnologie
Nanog umano REV ccatccactgccacatcttct	Tecnologie
di vita Umano TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc	Life Technologies
Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g	Life Technologies
Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c	Life Technologies
Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g	Life Technologies
Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a	Life Technologies Human
G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t	Life Technologies
Anti-SOX2	Santa Cruz Biotechnology	sc-17320
Anti-FOXA2	MerckMillipore	07-633
Anti-SOX17	R& Sistemi D	AF1924