Forniamo un protocollo dettagliato per studiare la dinamica degli acidi biliari nelle cellule viventi utilizzando un sensore FRET BAS geneticamente codificato. Questo sensore di acidi biliari rappresenta uno strumento unico per studiare (regolare) il trasporto degli acidi biliari e l'attivazione FXR in un'ampia gamma di tipi di cellule.
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Articolo metodologico
Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore
In questo articolo
Sommario
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) è diventato un potente strumento per monitorare il ripiegamento, l'interazione e la localizzazione delle proteine nelle singole cellule. I biosensori basati sul principio FRET hanno consentito la visualizzazione in tempo reale di eventi di segnalazione subcellulare in cellule vive con un'elevata risoluzione temporale e spaziale. Qui, descriviamo l'applicazione di un sensore di acidi biliari (BAS) geneticamente codificato che consiste in due fluorofori fusi al dominio di legame del ligando del recettore X farnesoide (FXR-LBD), formando così un sensore di acidi biliari che può essere attivato da un gran numero di specie di acidi biliari e altri ligandi FXR (sintetici). Questo sensore può essere mirato a diversi compartimenti cellulari, tra cui il nucleo (NucleoBAS) e il citosol (CytoBAS), per misurare localmente le concentrazioni di acidi biliari. Consente una rapida e semplice quantificazione dell'afflusso di acidi biliari cellulari, dell'efflusso e della distribuzione subcellulare degli acidi biliari endogeni senza la necessità di marcare con tag fluorescenti o radionuclei. Inoltre, i sensori BAS FRET possono essere utili per monitorare il legame del ligando FXR. Infine, dimostriamo che questo biosensore FRET può essere combinato con l'imaging di altri fluorofori spettralmente distinti. Ciò consente l'analisi combinata della dinamica intracellulare degli acidi biliari e i) la localizzazione e/o l'abbondanza delle proteine di interesse, o ii) la segnalazione intracellulare in una singola cellula.
Introduzione
Trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) è ampiamente utilizzato per ottenere una migliore comprensione delle funzioni cellulari in cellule viventi con alta risoluzione temporale e spaziale 1. In FRET, l'energia da un fluoroforo donatore eccitato è trasferita ad un fluoroforo accettore. Efficienza FRET è fortemente dipendente dalla distanza tra il donatore e accettore fluoroforo e il loro orientamento ed è quindi una lettura sensibile cambiamenti conformazionali che influenzano i due fluorofori. Questo fenomeno viene sfruttato per generare biosensori basati FRET per l'imaging di piccole molecole. Cambiamenti nella loro concentrazione può esser....
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Protocollo
1. Trasfezione transitoria
Nota: CytoBAS e NucleoBAS (Vedere materiali Tabella) sono utilizzati con successo in diversi tipi di cellule, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK e cellule HEK293T). Il requisito principale di utilizzare il sensore è che deve essere espressa, richiede il DNA codifica per entrare nella cellula.
- Celle di raccolta da un confluenti 80% 25 cm 2 pallone. Diluire le cellule nel mezzo di coltura completo adatti per la linea cellulare (10% FBS, 1% L-glutammina, 1% pen / strep per celle U2OS e Huh7).
- Cellule piatto alla densità desiderata in una sterile 8 vetro di copertura bene a camera (0,8
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Risultati
Il sensore FRET-BAS presentato si basa sul dominio di FXR (LBD-FXR) legame ligando attaccato a due fluorofori citrino e cerulee) e un motivo LXXLL. Questo sensore permette indagini trasporto degli acidi biliari in cellule con alta risoluzione spaziale e temporale (Figura 1 A) vivono. Mutazioni in ceruleo e citrino sono stati applicati per promuovere la formazione del complesso intramolecolare (Figura 1 <.......
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Discussione
Presentiamo qui un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un romanzo geneticamente codificato sensore acido biliare capace di monitorare le dinamiche spazio-temporali di trasporto degli acidi biliari in cellule viventi. Questo biosensore è costituito da proteine fluorescenti cerulee e citrino che sono fusi per FXR-LBD, formando così un sensore acido biliare basato FRET-(BAS).
Bile Acid sensore è relativamente semplice e conveniente in uso quando si ha esperienza di base con colture c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni iniziali del CER (ERC-2011-StG 280255 e ERC-2013-StG 337479) e dall'Organizzazione olandese per la ricerca e lo sviluppo sanitario (Vidi 91713319).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | Alto glucosio senza L-glutammina |
| Penicillina-Streptomicina (penna/streptococco) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutammina (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Tripsina-EDTA (10x) | Pallone | CC-5012 | |
| T-25 | VWR international | 392-0253 | |
| Pallone per colture cellulari T-175 | VWR international | 392-0238 | rivestita in laminina |
| VWR international | 734-0229 | rivestita in poli-L-lisina e laminina | |
| VWR international | 392-0243 | Rivestita in laminina | |
| Dietilamminoetile (DEAE) - Destrano | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polietilenimmina (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticina) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Igromicina B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cilindro di clonazione (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Terreno di coltura Leibovitz | Invitrogen | 21083-027 | Senza fenolo rosso |
| Polistirene tubo a fondo tondo (5 ml) Tubo Facs | Falcon BD | 352008 | Senza tappo, non sterile |
| Falcon 2.063 provette (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Tappo a scatto, sterile |
| Nunc Lab-Tek Vetro di copertura a 8 pozzetti | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| filtrato al carbone FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Altri prodotti chimici | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
Riferimenti
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
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Ristampe e permessi
