Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Gregory J. Baker; Maria G. Castro; Pedro R. Lowenstein

doi:10.3791/53676

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Articolo metodologico

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

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DOI:

10.3791/53676

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28 novembre 2015

Gregory J. Baker¹^,² , Maria G. Castro¹^,² , Pedro R. Lowenstein¹^,²

¹Department of Neurosurgery, University of Michigan, ²Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

In questo articolo

Sommario

Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.

Abstract

Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che natural killer (NK), le cellule sono in grado di sradicare ortotopicamente impiantato GL26 topo e nel ratto CNS-1 gliomi maligni subito dopo attecchimento intracranica se le cellule tumorali sono resi carenti nella loro espressione della lectina galectina β-galactoside vincolante -1 (gal-1). Lavori più recenti mostra ora che una popolazione di ⁺ / CD11b ⁺ cellule mieloidi Gr-1 è fondamentale in tal senso. Per comprendere meglio i meccanismi con cui NK e le cellule mieloidi cooperano per conferire gal-1-deficienti rifiuto tumore abbiamo sviluppato un protocollo completo per l'isolamento e l'analisi delle cellule mononucleate del sangue periferico-gliomi infiltranti (PBMC). Il metodo è dimostrato qui confrontando PBMC infiltrazione nel microambiente tumorale di gal-1-esprimendo GL26 gliomi con quelli resi gal-1-carente via shRNA atterramento. Il protocollo inizia con una descrizione di come la cultura e la preparazione GL26 cells per inoculazione nella C57BL / 6J cervello singenico del mouse. E poi spiega i passi necessari per l'isolamento e l'analisi dei flussi di citometria-glioma infiltrarsi PBMC dei primi del microambiente tumorale al cervello. Il metodo è adattabile ad una serie di disegni in vivo sperimentali in cui è richiesta dati temporali sul infiltrazione immunitario nel cervello. Il metodo è sensibile e altamente riproducibile, come PBMC-gliomi infiltranti possono essere isolati da tumori intracranici appena 24 ore attecchimento post-tumore con conta di cellule simili osservati dal punto abbinato tumori tempo durante esperimenti indipendenti. Un singolo sperimentatore può eseguire il metodo dalla raccolta cervello per analisi citofluorimetrica delle PBMC-gliomi infiltranti in circa 4-6 ore a seconda del numero di campioni da analizzare. Modelli alternativi di glioma e / o anticorpi di rilevamento specifici per cellulari possono essere utilizzati anche a discrezione degli sperimentatori 'per valutare l'infiltrazione di diversi altri immuntipi di cellule e di interesse, senza la necessità di modifica del procedimento generale.

Introduzione

Gliomi sono una classe di tumori cerebrali neuroepiteliali derivanti da glia trasformato nel sistema nervoso centrale (CNS). Di tutti i gliomi, Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) di grado IV glioma, o glioblastoma (GBM), è la più comune e letale ^1. GBM è altamente refrattario alla cura standard di corrente, che consiste nella resezione del tumore, per quanto possibile seguito da radioterapia più chemioterapia concomitante e adiuvante con temozolomide ^2. Questi tumori mortali portare una prognosi infausta di soli 15-18 mesi di sopravvivenza dal momento della diagnosi iniziale con solo il 5% dei pazienti sopravvissuti alla malattia dopo 5 ....