Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Sommario

Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.

Abstract

Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che natural killer (NK), le cellule sono in grado di sradicare ortotopicamente impiantato GL26 topo e nel ratto CNS-1 gliomi maligni subito dopo attecchimento intracranica se le cellule tumorali sono resi carenti nella loro espressione della lectina galectina β-galactoside vincolante -1 (gal-1). Lavori più recenti mostra ora che una popolazione di ⁺ / CD11b ⁺ cellule mieloidi Gr-1 è fondamentale in tal senso. Per comprendere meglio i meccanismi con cui NK e le cellule mieloidi cooperano per conferire gal-1-deficienti rifiuto tumore abbiamo sviluppato un protocollo completo per l'isolamento e l'analisi delle cellule mononucleate del sangue periferico-gliomi infiltranti (PBMC). Il metodo è dimostrato qui confrontando PBMC infiltrazione nel microambiente tumorale di gal-1-esprimendo GL26 gliomi con quelli resi gal-1-carente via shRNA atterramento. Il protocollo inizia con una descrizione di come la cultura e la preparazione GL26 cells per inoculazione nella C57BL / 6J cervello singenico del mouse. E poi spiega i passi necessari per l'isolamento e l'analisi dei flussi di citometria-glioma infiltrarsi PBMC dei primi del microambiente tumorale al cervello. Il metodo è adattabile ad una serie di disegni in vivo sperimentali in cui è richiesta dati temporali sul infiltrazione immunitario nel cervello. Il metodo è sensibile e altamente riproducibile, come PBMC-gliomi infiltranti possono essere isolati da tumori intracranici appena 24 ore attecchimento post-tumore con conta di cellule simili osservati dal punto abbinato tumori tempo durante esperimenti indipendenti. Un singolo sperimentatore può eseguire il metodo dalla raccolta cervello per analisi citofluorimetrica delle PBMC-gliomi infiltranti in circa 4-6 ore a seconda del numero di campioni da analizzare. Modelli alternativi di glioma e / o anticorpi di rilevamento specifici per cellulari possono essere utilizzati anche a discrezione degli sperimentatori 'per valutare l'infiltrazione di diversi altri immuntipi di cellule e di interesse, senza la necessità di modifica del procedimento generale.

Introduzione

Gliomi sono una classe di tumori cerebrali neuroepiteliali derivanti da glia trasformato nel sistema nervoso centrale (CNS). Di tutti i gliomi, Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) di grado IV glioma, o glioblastoma (GBM), è la più comune e letale ^1. GBM è altamente refrattario alla cura standard di corrente, che consiste nella resezione del tumore, per quanto possibile seguito da radioterapia più chemioterapia concomitante e adiuvante con temozolomide ^2. Questi tumori mortali portare una prognosi infausta di soli 15-18 mesi di sopravvivenza dal momento della diagnosi iniziale con solo il 5% dei pazienti sopravvissuti alla malattia dopo 5 ....

Protocollo

Nota: Si prega di rivedere l'intero protocollo prima di eseguire esperimenti. L'approvazione per l'uso di animali vertebrati dal comitato istituzionale adeguato per l'uso e il benessere degli animali deve essere ottenuto prima di procedere.

1. Preparazione di cellule tumorali per intracranica Attecchimento

1. Lavorare in una cappa di sicurezza biologica di classe II, iniziare con la creazione GL26-Cit-NT / gal1i colture cellulari, completandola una bottiglia da 500 ml di Dulbecco modificato (DMEM) con siero sterile filtrata calore inattivato il 10% fetale bovino (FBS ), 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina,....

Risultati

La seguente strategia di gating viene utilizzato per un tipico esperimento: FSC-A e SSC-A → SSC-H e SSC-W → FSC-H vs. FSC-W → CD45 vs. conteggio → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs conteggio. Gates posto su Gr-1 le cellule mieloidi ⁺ / CD11b ⁺ e cellule NK1.1 ⁺ NK vengono poi stratificati sulla base di espressione GzmB (Figura 5A). Backgating quelle cellule identificate come cellule NK1.1 ⁺ NK e Gr-1 ⁺ / CD11b ^{+ cellule} mieloidi in nostri esperim.......

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo robusto e riproducibile per l'isolamento e analisi citofluorimetrica delle PBMC che hanno infiltrato inizi del mouse tumore cerebrale microambiente. Sospensioni cellulari glioma sono generati ad una concentrazione specificato dal sperimentalista che sono stereotactically innestato nello striato del cervello di topo. I topi sono poi eutanasia in momenti predeterminati previsti dal disegno sperimentale e il loro cervello sono raccolta e trattata per isolare PBMC-glioma infiltrante .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco' s Modifica di Eagles Medium	Gibco	12430-054	con 4,5 g/L di D-glucosio, L-glutammina, 25 mM HEPES e rosso fenolo.
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfati	Gibco	14190-144	senza cloruro di calcio o cloruro di magnesio
Siero fetale bovino	Omega Scientific Inc.	FB-11
Penicillina Streptomicina	Gibco	15140-122	10.000 U/ml Penicillina; 10.000 μ g/ml di streptomicina
L-glutammina	Gibco	25030-081	200 mM
G418 solfato	Omega Scientific Inc.	GN-04
Puromicina dicloridrato	Sigma-Aldrich	P8833	da Streptomyces alboniger
HyClone HyQTase alternativa alla tripsina non mammifera.	Thermo Scientific	SV30030.01	in DPBS con EDTA
Emocitometro a contrasto di fase	Sigma-Aldrich	Z359629	0,1 mm di profondità
Colorazione blu di tripano	Gibco	15250-061
Iniezione sterile di NaCl allo 0,9%, USP	Hospira	NDC: 0409-4888	Fiale da 10 ml
Microprovette coniche in polipropilene da 0,6 ml	Genesee Scientific	22-272
Iniezione di atipamezolo cloridrato	Orion Pharma	NDC: 52483-6298	5 mg/ml soluzione
Iniezione di ketamina cloridrato	Fort Dodge	NDC: 0409-2051	Soluzione da 100 mg/ml
Iniezione di dexmedetomidina cloridrato Zoetis		NDC: 54771-2805	Soluzione da 0,5 mg/ml
Iniezione di xilazina cloridrato	Lloyd	NDC: 61311-481	Soluzione da 100 mg/ml
Iniezione di carprofene	Pfizer	NDC: 61106-8501	50 mg/ml soluzione
Buprenorfina cloridrato iniezione	Reckitt Benckiser	NDC: 12496-0757	0,3 mg/ml fiale
1 ml siringhe di tubercolina	Covidien	8881501400
26G x ½ (0,45 mm x 13 mm) aghi per siringa	BD	305111
Tosatrici chirurgiche	3M	9661
Soluzione di providone-iodio	Aplicare	82-217	NDC: 52380-1905
Unguento oftalmico sterile in vaselina	Dechra	NDC: 17033-211
Tamponi per la preparazione di alcol isopropilico al 70%	Kendall	6818
Garza sterile	Covidien	8044	non tessuto, 4" x 4", 4 strati
Microtubi conici in polipropilene da 1,7 ml	Genesee Scientific	22-281
Telaio stereotassico per topi	Stoelting	51730
Lampada chirurgica	Philips Burton	CS316W	Coolspot II Variable Spotlight
Pinza da dissezione curva	Ted Pella Inc.	5431
Divaricatori Colibri	FST	17000-03
Trapano avvitatore di precisione a batteria	Dremel	1100-01	Modello a stilo; 7,2 Volt agli ioni di litio con
docking station Taglierina	per incisione Dremel	105	1/32" o 0,8 mm di diametro
siringa da microlitro	Hamilton	75	Siringhe da microlitro Hamilton serie 700; 5 μ l volume
Aghi per siringa da microlitro	Hamilton	7762-06	33 G, mozzo piccolo RN NDL, 1,5 pollici, punto 3, 6/PK
Ethilon 3-0 suture in nylon monofilamento nero	Ethicon	1663
Ancoretta magnetica	VWR	74950-296	7,9 mm di diametro x 50 mm di lunghezza (5/16" di diametro x 2" di lunghezza)
1 L bottiglia di vetro con tappo a vite	Corning	1395	Tipo 1, vetro borosilicato di classe A
Eparina sodica	Sagent	NDC: 25021-400	Soluzione da 1.000 U/ml
Pompa peristaltica	Cole Parmer Instruments Group	77200-60	Master Flex Easy Load II unità console
carbogen compresso (95% O2 / 5% CO2)	disponibile presso il fornitore locale	N/A	Tipo A, cilindro grande
20 G x 1 ½ " aghi smussati con mozzo in alluminio	Kendall	8881202363	0,9 mm x 38,1 mm
Secchiello per il ghiaccio in poliuretano	Fisherbrand	02-591-45	Capacità: 0,152 once (4,5 L)
Collagenasi (tipo I-S)	Sigma Aldrich	C1639	da Clostridium histolyticum
Desossiribonucleasi I	Worthington Biochemical Corp.	LS002007	>2.000 unità Kunitz per mg di peso secco
Piatti di pesatura esagonali antistatici in polistirene	Ted Pella Inc.	20157-3	D.I. superiore 115 mm, D.I. base 85 mm, volume 203 ml
Lamette da barba a taglio singolo in acciaio inossidabile	Garvey	40475
Rongeurs ossei	FST	16001-15
Hemostat	FST	13014-14
Forbici da dissezione grandi	Ted Pella Inc.	1316
Forbici da dissezione piccole	FST	14094-11
Pinza con estremità smussata	Ted Pella Inc.	13250
7 ml di vetro Dounce macinatore di tessuti	Kontes	KT885300-0007
Percoll Density Centrifugation Media	GE Healthcare	GE17-0891-01
Pipette sierologiche da 10 ml	Genesee Scientific	12-104	monouso; sterili
70 &; m filtri cellulari sterili in rete di nylon	Fisherbrand	22363548
Alexa Fluor 700-coniugato ratto anti-topo CD45 (clone: 30-F11)	Biolegend	103128
topo coniugato APC-consorted anti-mouse NK1.1 (clone: PK136)	eBiosciences	17-5941-82
GR-1 anti-topo di ratto coniugato PE (clone: RB6-8C5)	BD Pharmigen	553128
Anti-topo di ratto coniugato PerCP/Cy5.5 CD11b (clone: M1/70)	Biolegend	101228
Alexa Fluor 700-ratto coniugato IgG2b, κ (clone: RTK4530) controllo isotipico	Biolegend	400628
topo coniugato con APC IgG2a, κ (clone: eBM2a) controllo isotipico	eBioscience	17-4724
IgG2b di ratto coniugato con PE, κ (clone: eB149/10H5) controllo isotipico	eBioscience	12-4031-82
PerCP/Cy5.5-coniugato IgG2b di ratto, κ (clone: RTK4530) controllo dell'isotipo	Biolegend	400632
Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11)	Biolegend	515403
Topo coniugato blu del Pacifico IgG1, κ (Clone: MOPC-21) controllo isotipico	Biolegend	400151
Cytofix/Cytoperm	BD	554714
15 ml provette da centrifuga in polipropilene	Genesee Scientific	21-103	fondo conico
Provette da centrifuga in polipropilene da 50 ml	Genesee Scientific	21-108
12 mm x 75 mm provette FACS in polipropilene a fondo tondo.	Fisherbrand	14-956-1B
FACSAria Special Order Research Prodotto citometro a flusso/selezionatore cellulare	BD
Cabina di sicurezza biologica 650033 Classe II	The Baker Company	SG603	modello: SterilGARD III Advance