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Articolo metodologico

Saggio altamente sensibile per la misura dell'attaccamento Arenavirus-cell

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⸱

DOI:

10.3791/53682

⸱

2 marzo 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Immunobiology, University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of Vermont

In questo articolo

Sommario

Il primo passo nel ciclo di vita dell'arenavirus è l'attaccamento delle particelle virali alle cellule ospiti. Riportiamo un test quantitativo basato su (q)RT-PCR per il rilevamento e la quantificazione ultrasensibili degli eventi di attacco all'arenavirus.

Abstract

Gli arenavirus sono una famiglia di virus a RNA avvolti che causano gravi malattie umane. Il primo passo nel ciclo di vita dell'arenavirus è l'attaccamento delle particelle virali alle cellule ospiti. Mentre l'attaccamento virus-cellula può essere misurato attraverso l'uso di virioni marcati con biotina, isotopi radioattivi o coloranti fluorescenti, questi approcci richiedono in genere un'elevata molteplicità di infezione (MOI) per consentire il rilevamento del virus legato. Descriviamo un test quantitativo basato su (q)RT-PCR che misura l'attacco del ceppo virale Junin Candid 1 tramite quantificazione dell'RNA genomico virale confezionato con virione. Questo test presenta diversi vantaggi, tra cui l'estrema sensibilità e la capacità di misurare l'adesione su un'ampia gamma dinamica di MOI senza la necessità di purificare o etichettare il virus in ingresso. È importante sottolineare che questo approccio può essere facilmente adattato per l'uso con altri virus attraverso l'uso di reagenti qRT-PCR specifici per virus. Inoltre, questo test può essere modificato per consentire la misurazione dell'endocitosi delle particelle e dell'uncoating del genoma. In conclusione, descriviamo un test semplice ma robusto per la misurazione altamente sensibile dell'attaccamento tra cellule arenavirus.

Introduzione

Arenavirus sono una famiglia di avvolgeva, virus a RNA a singolo filamento che si mantengono prevalentemente nei roditori in natura 1-3. Mentre questi virus in genere stabiliscono un asintomatica, infezione persistente in serbatoi roditori 1,2, possono causare gravi malattie negli esseri umani 3. Specie patogene importanti includono il virus Nuovo Mondo Junin (JUNV) 4 e il virus Vecchio Mondo Lassa 5, che sono gli agenti eziologici di febbre emorragica argentina in Sud America e febbre di Lassa in Africa, rispettivamente. Virus Coriomeningite linfocitaria (LCMV), il virus prototipo della famiglia 6, ha una distribuzione a livello mondiale ed è responsabile di una varietà di stati patologici tra cui la meningite asettica nei soggetti immunocompetenti 6, gravi difetti di nascita nel feto in via di sviluppo 7, o ad alta letalità in immunodepressi individui a seguito solido-trapianto di organi 8,9. La mancanza di Stati UnitiFood and Drug Administration (FDA) -approvato vaccini o farmaci antivirali efficaci per combattere questi virus mette in evidenza la necessità critica di sviluppare nuove strategie per indirizzare terapeuticamente questi patogeni emergenti / ri-emergente.

Il genoma Arenavirus si compone di due segmenti a singolo filamento di RNA, la grande (L) (~ 7,2 kb) e piccolo (S) (~ 3,6 kb) segmenti di 10. Il segmento S codifica la nucleoproteina virale (NP) e glicoproteina busta (GP) mentre il segmento L codifica la polimerasi virale (L) e la proteina della matrice (Z). La L e segmenti di RNA genomici S (vRNAs) sono confezionati in virioni 10-12. Il primo passo di infezione Arenavirus è l'attaccamento di particelle virali per ospitare cellule attraverso una interazione tra il GP virale e le sue corrispondenti recettori della cellula ospite, che, per JUNV, comprende il recettore umano transferrina 1 (hTfR1) 13,14. A seguito di attaccamento, le particelle JUNV sono presi nella cella via clatrina mediata endocitosi 15.Le particelle quindi il traffico al fine endosome dove il basso pH di questo comparto determinerà l'attivazione della GP 16,17. Una volta attivato, gli inserti peptide di fusione GP-codificato nella membrana endosomal, avviando la fusione tra le membrane virali e endosomali. risultati di fusione di successo nel rilascio delle vRNAs virione-confezionati nel citoplasma, dove servono come modelli per la replicazione e la trascrizione genomica. Quando vengono generati una quantità sufficiente di proteine ​​strutturali virali e vRNAs, nuove particelle assemblare e gemma dalla cellula infettata per completare il ciclo di vita 18.

Per facilitare la scoperta di nuove strategie per indirizzare le terapeuticamente arenavirus patogeni, il nostro gruppo si è concentrata sull'identificazione di fattori dell'ospite che sono fondamentali per la propagazione del virus, ma indispensabili per l'host. In questo contesto, definendo la fase precisa (s) del ciclo di vita virale controllata da tali fattori dell'ospite è necessario guidare lasviluppo di strategie antivirali. Qui, descriviamo un (q) saggio RT-PCR-based che può essere utilizzato per misurare allegato Arenavirus cellule al fine di identificare se le proteine ​​ospitanti selezionate e / o molecole antivirali influenzano questa fase iniziale di ingresso del virus 19. Approcci alternativi per misurare l'attaccamento Arenavirus cellule hanno caratterizzato virioni etichettati con biotina 20, coloranti fluorescenti 21, o isotopi radioattivi 22. Inconvenienti di questi metodi possono includere il requisito per grandi quantità di virus in ingresso (ad esempio elevati molteplicità di infezione (MOI)), l'uso di radioattività, e / o fasi di manipolazione aggiuntivi per preparare virus in ingresso (ad esempio, concentrazione e / o l'etichettatura del virus) . In particolare, l'uso di alta MOI rende difficile distinguere produttiva rispetto eventi di fissaggio non produttive 15,23. Il saggio qRT-PCR-based descritto qui in grado di rilevare gli eventi di attacco utilizzando come pochi come 20 placca perunità Ming (PFUs) di virus, che si traduce in un MOI di 0,0004 per un piatto 48 pozzetti. Pertanto, la forte sensibilità del saggio supera il requisito per alta MOI nonché eventuali operazioni di etichettatura virus o di concentrazione. Inoltre, il test può essere i) atto a misurare virione endocitosi, nonché rilascio di genoma del virus nel citoplasma in seguito alla fusione e ii) su misura per l'utilizzo con altri virus attraverso lo sviluppo di reagenti qRT-PCR virus-specifici (per esempio, vedere 24-27).

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Protocollo

Nota: E 'fondamentale che il protocollo descritto essere effettuata con rigorosa tecnica di pre-PCR (vedi 28 per un'eccellente panoramica su come impostare un laboratorio di pre-PCR e come condurre esperimenti usando una buona tecnica pre-PCR). E 'indispensabile che tutti i reagenti e le attrezzature sono privi di DNA amplificato contenente la sequenza bersaglio qPCR e che i controlli appropriati sono in atto per rilevare tale contaminazione. Una panoramica del protocollo è mostrato in Figura 1.

1. Preparare Media e cellule seme in 48 pozzetti

  1. Preparare 500 ml di completo Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina, e 1% Hepes (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-etano solfonico) soluzione tampone aggiungendo 50 ml del calore inattivato siero bovino fetale e 5 ml di una soluzione tampone 100x penicillina-streptomicina e 100x HEPES a una bottiglia da 500 ml di DMEM. Questo reagente può essere conservato a 476; C per mesi.
  2. Seme 2,5 x 10 4 cellule Vero E6 per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti in un volume finale di 500 ml di DMEM completo. Incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2 per 10 a 18 ore.
    1. Seme il piatto alla fine della giornata lavorativa. Testare ogni campione di virus sia in due o tre esemplari pozzi.
      Nota: Mentre una piattaforma 48 pozzetti basata per questo saggio è descritto, dovrebbe essere possibile per scalare il dosaggio per un uso in 96 o 384 pozzetti.

2. Carry Out Allegato virus-cellula

Nota: Il virus utilizzato in questo protocollo, ceppo JUNV Candid # 1 (C # 1), è stato usato con successo come un vaccino vivo attenuato per la prevenzione delle malattie JUNV 29. JUNV C # 1 è stato derivato dalla virulenta XJ ceppo JUNV attraverso il passaggio di serie sia in vivo che in vitro e si differenzia dal ceppo parentale XJ da 12 aminoacidi 30. because JUNV C # 1 è un livello di biosicurezza (BSL) patogeno -2-rated, il lavoro descritto per questa sezione deve essere effettuata con opportuni BSL-2 pratiche 31. Ciò include l'uso di dispositivi di protezione individuale (ad esempio la protezione degli occhi, camice da laboratorio, doppi guanti), un armadio biosicurezza di classe II, e garantire che tutto il personale hanno ricevuto la formazione istituzionale e le approvazioni necessarie per gestire in modo sicuro questo organismo.

  1. Diluire il JUNV C # 1 del campione (s) da testare al PFUs desiderato o concentrarsi unità formanti in ghiacciata completo DMEM e memorizzare sul ghiaccio fino al momento di aggiungere ad ogni bene.
    Nota: In alternativa alla realizzazione degli studi di legame con il virus diluito in DMEM completo, utilizzare un terreno minimo contenente PBS con una concentrazione ridotta di siero (2%) e un tampone appropriato per stabilire se siero può causare interferenze con attacco virus. protocolli di attacco simili per i virus alternativi hanno segnalato l'uso di RPMI 1640 medium senza bicarbonate contenente 0,2% di albumina di siero bovino, 10 mM (2- (morfolino) acido etansolfonico) e 10 mM HEPES, pH 6.8 32. Questo supporto leganti possono essere superiori per evitare variazioni di pH che potrebbero verificarsi quando il supporto viene rimosso dal CO 2 -Ambiente dell'incubatore.
    1. Seminare pozzi con PFUs che vanno da 200 a 2.000 per limitare eventi di attacco non produttive. Come mostrato in figura 2, questo test è in grado di rilevare allegato utilizzando il meno 20 PFU (o fino a 2 x 10 6 PFU).
    2. Creare un master mix di virus per l'inoculazione sulle cellule. Ogni campione virus sarà inoculata in pozzetti duplicati in un volume di 50 pl per pozzetto. Pertanto, se l'aggiunta di 2.000 PFUs di virus per pozzetto è desiderato, diluire 4.800 PFUs in un volume totale di 120 ml di ghiaccio freddo completare DMEM.
      1. Per controllare per la specificità del test, utilizzare una coppia di linee di cellule ovariche di criceto cinese che o non esprimono TfR1 (TRVB) o express hTfR1 (TRVB-1) come allegato JUNV a queste cellule dovrebbe o essere ridotto o no, rispettivamente, 13,33. In alternativa, il trattamento di cellule con una proteasi come proteinasi K per evitare attaccamento Arenavirus 34 o ingresso 35. Solubile hTfR1 o il ch128.1 anticorpi monoclonali, che è specifico per hTfR1, potrebbero essere considerati come sono conosciuti per bloccare l'ingresso di JUNV nelle cellule 13,36. Inoltre, pre-trattamento delle cellule con mannosio 14 o l'incubazione di particelle con anticorpi neutralizzanti specifici JUNV 37 in grado di inibire l'ingresso di virus.
      2. Si prega di notare, tuttavia, che questi ultimi reagenti e approcci, pur bloccando l'ingresso JUNV, non sono state confermate per bloccare l'attaccamento, anche se questa è una spiegazione probabile. Il protocollo qui descritto potrebbe essere utilizzato per determinare formalmente se queste vari approcci attaccamento impatto virione.
  2. Rimuovere le piastre dal 37 ° C incubatore eposizionare sia in frigorifero a 4 ° C o in ghiaccio per 15 min per inibire la capacità delle cellule piastrate ad effettuare endocitosi.
  3. Avanti, aspirare il DMEM completo di ogni bene e rapidamente lavare i pozzetti due volte con 100 ml di ghiaccio freddo PBS (tampone fosfato salino) pH 7.4. Quindi aggiungere 50 ml di campioni di virus pre-diluito (previste al punto 2.1) nei rispettivi pozzetti.
  4. Avvolgere il piatto in involucro di plastica e collocare immediatamente sia di nuovo sul ghiaccio o in un frigorifero C 4 ° per 1 a 1,5 ore per consentire attacco di virus che si verifichi. Mantenere la piastra, tampone di lavaggio, e campioni di virus freddo a 4 ° C nel corso di questo passo.
  5. Dopo il completamento del C incubazione 4 °, aspirare l'inoculo del virus e lavare i pozzetti 3 volte con 200 ml di PBS ghiacciato.

3. virale RNA Estrazione

  1. Purificare l'RNA virale da JUNV C # 1 particelle fissati ai monostrati utilizzando il kit commerciale (ad esempio, RNeasy Mini kit) According il protocollo del produttore. In particolare, seguire la "purificazione di RNA totale da cellule animali che utilizzano il protocollo tecnologia spin" alle pagine 23-28 del Mini Manuale RNeasy (4 ° edizione, aprile 2006), con le modifiche di seguito elencati.
    1. Lyse le cellule come indicato al punto 1B con l'aggiunta di 350 ml di tampone di lisi RLT direttamente a ciascun bene. Mescolare il tampone più volte per garantire lisi cellulare. Si noti che le cellule Lyse facilmente in questo buffer e completo lisi possono essere verificati visualizzando i pozzi sotto un microscopio invertito.
    2. Trasferire il lisato cellulare risultante al kit colonna (step 3a) e seguire il resto del protocollo come descritto. A questo punto, il virus è stato neutralizzato dal tampone di lisi per i passaggi rimanenti del protocollo può essere fatto all'esterno dell'armadio biosicurezza classe II purché i tubi kit non sono stati contaminati da virus infettivo.
    3. Includere il passo opzionale 9 dal protocollo del produttore, che è un additionale centrifugazione della colonna di selezione per eliminare ogni possibile riporto di Buffer RPE.
    4. Nella fase finale il protocollo del produttore (punto 10), eluire gli RNA purificato dalla colonna di spin con 30 ml di DDH priva di nucleasi 2 O. RNA Conservare a -80 ° C a questo punto o utilizzare direttamente nel saggio qRT-PCR. Per impedire il degrado del purificati campioni di RNA virale da nucleasi, utilizzare reagenti e attrezzature priva di nucleasi e conservare campioni di RNA scongelati in ghiaccio.
      Nota: Buffer RLT e RW1 contengono sale della guanidina e non devono essere mescolati con candeggina. Buffer RW1 contiene etanolo.

4. qRT-PCR Misurazione del genoma virale

  1. Per convertire JUNV C # 1 RNA segmento S in cDNA per la successiva qPCR, sottoporre l'RNA virale (generato nel passaggio 3.1.4) per RT in un volume totale di 50 microlitri.
    1. Per impostare la reazione RT, prima creare una master mix contenente ciascuna delle seguenti reagenti per la reazione: 6,75 ml di nucleasi-free DDH 2 O, 5 ml di uno stock 2 mM della RT Primer S 2098- per 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), che è complementare alla regione NP del segmento S dell'RNA genomico, 5 ml di 10X tampone PCR II, 11 ml di una soluzione 2 25 mM MgCl, 1,25 ml (62,5 unità) di RT enzima, 1 ml (0,4 unità) di inibitore RNasi, e 10 ml di uno stock di dNTP 500 micron.
      Nota: Durante il corso della replica Arenavirus, 4 specie segmento S RNA virale vengono generati: un full length RNA genomico (vRNA), una a figura intera RNA antigenomic (vcRNA) (che è il complemento inverso della vRNA), e due mRNA subgenomico codifica i geni NP e GP rispettivamente. Il primer RT elencati qui è specifico per solo il segmento S vRNA, ma non il vcRNA, NP mRNA o GP mRNA.
    2. mescolare delicatamente il master mix RT e quindi un'aliquota di 40 ml in singoli tubi di 0,2 ml per PCR. Aggiungere 10 ml di RNA virale in ogni provetta. Includere i) un tubo nessun controllo del modello (ad esempio,. Aggiungere 10 ml di-nucleasi libera DDH 2 O a 40 microlitri della master mix) e ii) un controllo enzima NO RT (ad esempio, aggiungere 10 ml di un campione di RNA virale noto positivo per 40 ml di master mix che non hanno ricevuto qualsiasi enzima RT) per lo screening della contaminazione dei reagenti RT con DNA amplificato contenente la sequenza bersaglio virale. Includi RNA estratto da cellule non infettate con il pieno master mix RT per il controllo per il saggio di specificità in presenza di RNA cellulare.
    3. Inoltre, su un campione di RNA virale noto positivo al master mix completo per verificare la qualità dei reagenti RT. Si noti che il volume della reazione RT può essere ridotto a 25 microlitri se necessario.
  2. Sottoporre i tubi RT alle seguenti condizioni di ciclo: 25 ° C per 10 min, 48 ° C per 30 minuti, e 95 ° C per 5 min. Si noti che i campioni possono essere conservati a -20 ° C a questo punto o lasciati notte nel termociclatore aggiungendo un passaggio 4 ° C.
  3. Perfo rm qPCR in un volume totale di 25 microlitri.
    1. Fare un master mix qPCR combinando il seguente: 2,5 ml (di un magazzino 9 micron) di ogni primer PCR in avanti S1937 + a 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') e reverse PCR Primer S 2001- per 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 ml (di un magazzino 2 micron) della sonda qPCR S 1960+ al 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), e 12,5 ml di maestro 2X universale qPCR mescolare. Si noti che il primer in avanti riportato qui, che è specifico per JUNV C # 1, differisce di 1 nt dalla sequenza di innesco originariamente riportato 38, che si rivolge il virulento ceppo JUNV Romero.
    2. Mescolare delicatamente la soluzione e poi aggiungere 20 ml di ogni qPCR bene. Aggiungere 5 ml di ogni reazione RT ai pozzetti qPCR appropriate. Condurre qPCR in triplice copia per ogni campione testato. Si noti che il volume di reazione PCR può essere ridotto a non più di 12,5 microlitri se necessario.
      Nota: il software associatola macchina qPCR genererà numero di copie assoluti di JUNV C # 1 segmento S dell'RNA genomico confrontando il valore di ciascun campione sconosciuto ad una serie di diluizioni standard di plasmide codificante il JUNV C # 1 NP gene, che è il bersaglio del primer qPCR e impostare la sonda. Il saggio qPCR può fornire soltanto la quantificazione di valori che rientrano nel range della curva standard. Per questo motivo, i seguenti quantitativi di plasmide (in triplice copia) pozzetti: 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5 e 5 x 10 7 copie per pozzetto.
  4. Caricare la piastra di qPCR nel termociclatore ed eseguire le seguenti condizioni di reazione: 95 ° C per 10 min e 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min.
    1. Raccogliere e analizzare i dati per determinare la quantità di RNA virale presente in ciascun campione secondo il protocollo del produttore.
  5. Per stabilire una curva standard utilizzando un campione di recente purificato del plasmide contenente catrame qPCRottenere la sequenza, prima di determinare il numero di plasmide copia in questa soluzione.
    1. Calcolare il peso molecolare del plasmide. Se è nota la sequenza dell'intero plasmide, calcolare ciò utilizzando la seguente formula: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61.13). Ricordatevi di includere il numero totale di un particolare nucleotide trovato su ogni filo del plasmide a doppio filamento.
    2. Se la dimensione del plasmide è noto, ma la sua sequenza esatta non è, calcolare la MW sotto l'ipotesi che ciascuna coppia di base dsDNA ha un Mw di 600.
      Nota: Il pCAGGS-JUNV C # 1 NP plasmide usato qui ha un MW di 4,2 x 10 6.
    3. Una volta che la MW del plasmide è stata determinata, calcolare il numero di copie per microlitri sono presenti nella soluzione madre plasmide.
    4. Prima calcolare il ug del plasmide totale nella soluzione, poi convertire questo per moli di plasmide (ad esempio se 69 ug del plasmide sono contenuti in 300 ml di acqua, quindi 6,9 x 10 -5 g di plasmide * 1 mole / 4,2 x 10 6 g di plasmide = 1,6 x 10 -11 moli di plasmide), che può essere convertita per copiare numero (ad esempio 1,6 x 10 -11 moli di plasmide * 6,022 x 10 23 molecole / mole = 9.8 x 10 12 molecole (o copie)).
    5. Dividere le copie totali del plasmide nella soluzione plasmide per il volume di tale soluzione per ottenere copie per ml (ad esempio 9,8 x 10 12 copie / 300 microlitri = 3,28 x 10 10 copie).
    6. Diluire questa soluzione in modo appropriato in modo che 5 volumi microlitri possono essere caricati sulla piastra PCR per fornire una gamma di numero di copie necessarie per stabilire la curva standard.

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Risultati

Per dimostrare la sensibilità e la gamma dinamica del saggio qPCR, quantità note di un plasmide codificante il gene NP di JUNV C # 1 (range 5-5 x 10 7 copie) sono stati sottoposti a qPCR come descritto nella Sezione 4 del protocollo. Il test è sensibile e può attendibilmente rilevare come pochi come 5 copie di acido nucleico bersaglio (Figura 2). Inoltre, la gamma dinamica del saggio è grande e, come mostrato in figura 2, può coprire almeno 7 ...

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Discussione

Il protocollo che descriviamo è semplice e robusta, purché siano rispettate le seguenti considerazioni critiche. In primo luogo, rigorosa tecnica di pre-PCR deve essere impiegato (si veda il 28 per un'eccellente recensione). E 'indispensabile che tutti i reagenti e le attrezzature sono privi di DNA amplificato contenente la sequenza bersaglio qPCR e che i controlli appropriati sono in atto per rilevare tale contaminazione. In secondo luogo, per la parte di attacco virus-cellula del protocollo, il viru...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, e Benjamin Re per utili discussioni e il National Institutes of Health per il supporto di questi studi, attraverso borse di studio T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), e P20RR021905 (JB) .

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEMLife Technologies11965-118
Penicillina-streptomicinaLife Technologies15140-163100x
Soluzione tampone HEPESLife Technologies15630-130100x
PBS pH 7.4Life Technologies10010-0231x
celle Vero E6American Type Collezione di coltureCRL-1586
Costar Piastra a 48 pozzettiCorning3548
RNeasy mini kitQiagen74106non miscelare tamponi RLT o RW1 con candeggina
QIAtrituratore omogeneizzatoreQiagen79654
Taqman Universal PCR Master MixLife Technologies4326614
Trascrittasi inversa Multiscribe (50U/µ l)Life Technologies4311235
Miscela di dNTP (10 mM; 2,5 mM ciascuno dNTP)Life TechnologiesN808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II e 25 mM Soluzione di MgCl2Life Technologies Life TechnologiesN808-0010
Inibitore della RNasi (5000U/100 µ l)Life TechnologiesN808-0119
RT primer 5'-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3'		Tecnologie del DNA integrate250 nmol DNA oligostandard desalinizzazione
Primer qPCR in avanti   5'-CATGGAGGTCAAAAACTTCCT-3'Life Technologies4304971desalinizzazione standard
Primer qPCR inverso 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'Life Technologies4304971standard per la desalinizzazione
5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'Life Technologies4316033MicroAmp Fast Optical purificata HPLC
(0,1 mL)Life Technologies4346906
StepOnePlus, sistema PCR in tempo realeLife Technologies4376598o altro strumento qPCR
sonda TaqMan Piastra di reazione a 96 pozzetti ,

Riferimenti

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