Il primo passo nel ciclo di vita dell'arenavirus è l'attaccamento delle particelle virali alle cellule ospiti. Riportiamo un test quantitativo basato su (q)RT-PCR per il rilevamento e la quantificazione ultrasensibili degli eventi di attacco all'arenavirus.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Saggio altamente sensibile per la misura dell'attaccamento Arenavirus-cell
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli arenavirus sono una famiglia di virus a RNA avvolti che causano gravi malattie umane. Il primo passo nel ciclo di vita dell'arenavirus è l'attaccamento delle particelle virali alle cellule ospiti. Mentre l'attaccamento virus-cellula può essere misurato attraverso l'uso di virioni marcati con biotina, isotopi radioattivi o coloranti fluorescenti, questi approcci richiedono in genere un'elevata molteplicità di infezione (MOI) per consentire il rilevamento del virus legato. Descriviamo un test quantitativo basato su (q)RT-PCR che misura l'attacco del ceppo virale Junin Candid 1 tramite quantificazione dell'RNA genomico virale confezionato con virione. Questo test presenta diversi vantaggi, tra cui l'estrema sensibilità e la capacità di misurare l'adesione su un'ampia gamma dinamica di MOI senza la necessità di purificare o etichettare il virus in ingresso. È importante sottolineare che questo approccio può essere facilmente adattato per l'uso con altri virus attraverso l'uso di reagenti qRT-PCR specifici per virus. Inoltre, questo test può essere modificato per consentire la misurazione dell'endocitosi delle particelle e dell'uncoating del genoma. In conclusione, descriviamo un test semplice ma robusto per la misurazione altamente sensibile dell'attaccamento tra cellule arenavirus.
Introduzione
Arenavirus sono una famiglia di avvolgeva, virus a RNA a singolo filamento che si mantengono prevalentemente nei roditori in natura 1-3. Mentre questi virus in genere stabiliscono un asintomatica, infezione persistente in serbatoi roditori 1,2, possono causare gravi malattie negli esseri umani 3. Specie patogene importanti includono il virus Nuovo Mondo Junin (JUNV) 4 e il virus Vecchio Mondo Lassa 5, che sono gli agenti eziologici di febbre emorragica argentina in Sud America e febbre di Lassa in Africa, rispettivamente. Virus Coriomeningite linfocitaria (LCMV), il virus prototipo della famiglia 6, ha....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Nota: E 'fondamentale che il protocollo descritto essere effettuata con rigorosa tecnica di pre-PCR (vedi 28 per un'eccellente panoramica su come impostare un laboratorio di pre-PCR e come condurre esperimenti usando una buona tecnica pre-PCR). E 'indispensabile che tutti i reagenti e le attrezzature sono privi di DNA amplificato contenente la sequenza bersaglio qPCR e che i controlli appropriati sono in atto per rilevare tale contaminazione. Una panoramica del protocollo è mostrato in Figura 1.
1. Preparare Media e cellule seme in 48 pozzetti
- Preparare 500 ml di completo Modified Eagle Medium di Dulbecco (DM....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Per dimostrare la sensibilità e la gamma dinamica del saggio qPCR, quantità note di un plasmide codificante il gene NP di JUNV C # 1 (range 5-5 x 10 7 copie) sono stati sottoposti a qPCR come descritto nella Sezione 4 del protocollo. Il test è sensibile e può attendibilmente rilevare come pochi come 5 copie di acido nucleico bersaglio (Figura 2). Inoltre, la gamma dinamica del saggio è grande e, come mostrato in figura 2, può coprire almeno 7 .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo che descriviamo è semplice e robusta, purché siano rispettate le seguenti considerazioni critiche. In primo luogo, rigorosa tecnica di pre-PCR deve essere impiegato (si veda il 28 per un'eccellente recensione). E 'indispensabile che tutti i reagenti e le attrezzature sono privi di DNA amplificato contenente la sequenza bersaglio qPCR e che i controlli appropriati sono in atto per rilevare tale contaminazione. In secondo luogo, per la parte di attacco virus-cellula del protocollo, il viru.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, e Benjamin Re per utili discussioni e il National Institutes of Health per il supporto di questi studi, attraverso borse di studio T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), e P20RR021905 (JB) .
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillina-streptomicina | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| Soluzione tampone HEPES | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| celle Vero E6 | American Type Collezione di colture | CRL-1586 | |
| Costar Piastra a 48 pozzetti | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | non miscelare tamponi RLT o RW1 con candeggina |
| QIAtrituratore omogeneizzatore | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Trascrittasi inversa Multiscribe (50U/µ l) | Life Technologies | 4311235 | |
| Miscela di dNTP (10 mM; 2,5 mM ciascuno dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II e 25 mM Soluzione di MgCl2 | Life Technologies Life Technologies | N808-0010 | |
| Inibitore della RNasi (5000U/100 µ l) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5'-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3' | Tecnologie del DNA integrate | 250 nmol DNA oligo | standard desalinizzazione |
| Primer qPCR in avanti 5'-CATGGAGGTCAAAAACTTCCT-3' | Life Technologies | 4304971 | desalinizzazione standard |
| Primer qPCR inverso 5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3' | Life Technologies | 4304971 | standard per la desalinizzazione |
| 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3' | Life Technologies | 4316033 | MicroAmp Fast Optical purificata HPLC |
| (0,1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus, sistema PCR in tempo reale | Life Technologies | 4376598 | o altro strumento qPCR |
Riferimenti
- Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
