Ecco un protocollo per far crescere cellule staminali pluripotenti (PSC) e cellule staminali neurali (NSC) in un sistema di coltura cellulare chiuso che consente la massima sterilità e riproducibilità, sostituendo la tradizionale cappa di biosicurezza e l'incubatore. Questa apparecchiatura è conforme alle linee guida sulle buone pratiche cliniche di fabbricazione (cGMP) e sulle buone pratiche cliniche di laboratorio (cGLP).
Articolo metodologico
Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo documento descrive come utilizzare un sistema di coltura cellulare chiuso prodotto su misura e disponibile in commercio per la ricerca di base e preclinica. Le cappe di biosicurezza (BSC) e gli incubatori sono stati a lungo lo standard per la coltura e l'espansione di linee cellulari per la ricerca di base e preclinica. Tuttavia, poiché l'attenzione di molti laboratori di cellule staminali si sposta dalla ricerca di base alla traduzione clinica, sono necessari ulteriori requisiti per il sistema di coltura cellulare. Tutti i processi devono essere ben documentati e avere requisiti eccezionali di sterilità e riproducibilità. Negli incubatori tradizionali, le concentrazioni e le temperature dei gas fluttuano notevolmente ogni volta che le cellule vengono rimosse per l'alimentazione, il passaggio o altre manipolazioni. Tali interruzioni contribuiscono a creare un ambiente che non è lo standard per le linee guida cGMP e GLP. Queste interruzioni devono essere ridotte al minimo, soprattutto quando le cellule vengono utilizzate per scopi terapeutici. La motivazione per passare dal sistema BSC e incubatore standard a un sistema chiuso è che tali interruzioni possono essere rese trascurabili. I sistemi chiusi forniscono uno spazio di lavoro per alimentare e manipolare le colture cellulari e mantenerle in un ambiente controllato in cui la temperatura e le concentrazioni di gas sono costanti. In questo modo, le cellule staminali pluripotenti e multipotenti possono essere mantenute in ottima salute dal momento della loro derivazione fino al loro eventuale utilizzo in terapia.
Introduzione
Le tecniche standard di coltura di cellule staminali soffrono di diversi vincoli ambientali che impongono stress eccessivi alle cellule ed espongono le cellule a rischi inaccettabili di contaminazione. Tra gli stress che le cellule possono sopportare in condizioni standard di coltura cellulare ci sono cambiamenti precipitosi nei livelli di anidride carbonica e nelle concentrazioni di ossigeno3,4. Ciò si verifica quando le cellule vengono spostate dall'incubatore alla cabina di biosicurezza e/o al microscopio, il che potrebbe non essere ottimale per le cellule. Studi precedenti hanno confermato i vantaggi della coltura di cellule staminali pluripotenti e neurali in condizioni di ipossia4,11 e, per ottenere i migliori risultati, queste condizioni devono essere continue. Inoltre, i rischi di contaminazione cellulare sono maggiori poiché l'ambiente di laboratorio e il personale interferiscono con le cellule in quasi ogni fase della loro coltura e manipolazione. Le camere bianche tradizionali costituiscono un metodo efficace per ridurre notevolmente i rischi di contaminazione, ma sono costose, hanno un ingombro elevato e non riescono ad affrontare i fattori di stress legati alle concentrazioni di anidride carbonica e ossigeno.
Un impianto di produzione di celle in grado di affrontare sia i rischi di contaminazione che le concentrazioni di gas e che può essere qualificato per soddisfare i criteri cGMP9 fornisce celle di alta qualità per la ricerca scientifica di base e per le applicazioni cliniche1,6,7. Tale impianto di produzione cellulare è costituito, come minimo, dai seguenti componenti: una camera di processo, che funge da spazio di lavoro riscaldato per l'alimentazione e la manipolazione di colture cellulari; una cappa a flusso laminare, per la sterilizzazione iniziale di reagenti, provette e strumenti; due camere di compensazione tampone tra la cappa e la camera di processo; due incubatori per colture cellulari accessibili dalla camera di processo; una camera del microscopio adiacente alla camera di processo; e infine, un software per computer per impostare e monitorare le condizioni all'interno di questi moduli. Utilizzando questa infrastruttura di base, è possibile eseguire un'ampia varietà di attività, come l'alimentazione standard e il passaggio di cellule staminali pluripotenti e cellule staminali neurali multipotenti, nonché metodi più specializzati come la riprogrammazione basata sul virus Sendai, gli studi di migrazione in vitro e la differenziazione delle cellule staminali neurali per la caratterizzazione elettrofisiologica.
Protocollo
1. Configurazione iniziale
- Regolazione del gas e temperatura Concentrazioni
- Utilizzando il software, fare clic sulla scheda "Ospite" che si trova nell'angolo in alto a sinistra dell'interfaccia grafica. Effettua il login al sistema utilizzando un nome utente e una password designato. Assicurarsi che ogni utente ha il proprio nome utente e password.
- Clicca su un modulo per regolare (Figura 1). All'interno della nuova finestra che visualizza le impostazioni correnti, fare clic sul set valore del punto di O 2 esistente al di sotto di "set point" e inserire il livello di concentrazione O 2 necessario per questo modulo. Inserisci 5% O 2 se le cellule staminali pluripotenti saranno coltivate o manipolati in questo modulo, e il 9% O 2 se le cellule staminali neurali saranno coltivate o manipolati. Fare clic sul segno di spunta verde per confermare il set point.
Nota: Due moduli non sono gas regolabile: la cappa laminare, e la camera microscopio. Le concentrazioni di gas nella cappa a flusso laminare sono whil atmosfericoe quelli nella camera microscopio sono passivamente mantenuti dalle concentrazioni del gas nella camera di processo. - Ripetere questo passaggio per CO 2. Inserire un set point di 5% di CO 2 per tutti i moduli tranne che per le camere di tampone, che sono regolabili solo per O 2.
- Monitorare le concentrazioni di gas attuali, che sono etichettati come "valori di processo", per assicurarsi che essi raggiungere il nuovo set point.
- Regolare i punti di regolazione del gas di tutti i moduli per i valori appropriati. Abbinare i CO 2 e O 2 livelli di camere che saranno esposti l'uno all'altro. Ad esempio, regolare la camera di processo al 5% O 2 prima di aprire un incubatore che cresce cellule a 5% O 2. regolare anche al 5% O 2 ogni camera di buffer che viene utilizzato per aggiungere elementi alla camera di processo durante questo tempo.
- Impostare la temperatura della camera di processo a 37 ° C utilizzando lo stesso schermo per le regolazioni di gas. Anche impostare il processo di camera di fTemperatura di loor a 37 ° C.
- Clicca sulle rive del modulo di incubazione sotto ogni incubatore. Regolare la temperatura delle banche a 37 ° C.
- Il funzionamento del buffer Chambers
- Raccogliere tutte le forniture necessarie per il compito dato (alimentazione, splitting, colorazione, ecc) in principio per evitare un ritardo nel flusso di lavoro. Liberamente spruzzare tutti i materiali con il 70% di etanolo e lasciarle asciugare nella cappa laminare. Non spruzzare fiaschi o lastre di cellule - asciugarli delicatamente con una spugna garza sterile saturata con il 70% di etanolo.
- Assicurarsi che sia le porte esterne e interne della camera di buffer siano ben chiusi. Quindi aprire la porta esterna, e posizionare gli oggetti al suo interno.
- Chiudere la porta esterna. All'interno del software, selezionare il modulo di buffer, e fare clic sulla scheda fattore di diluizione. Immettere 1 nella casella fattore di registro. Fare clic su Start.
Nota: Un "fattore di diluizione" è definito nel senso che l'atmosfera del modulo bufferessere evacuati e sostituiti 1 volta con gas pulito, HEPA filtrata. - Una volta che l'interfaccia grafica ha smesso di lampeggiare "fattore di diluizione", aprire la porta interna della camera di buffer e portare il materiale all'interno della camera di processo.
Attenzione: non lasciare le porte interne ed esterne a mai essere aperti allo stesso tempo e non aprire la porta interna, se la camera di buffer non ha subito un fattore di diluizione. - Per rimuovere elementi dalla camera di processo, controllare che l'altra camera polmone ha subito un fattore di diluizione. Quindi aprire la porta interna, posizionare gli elementi da rimuovere all'interno, e chiudere la porta interna. Quindi aprire la porta esterna e rimuovere gli elementi.
Nota: Un fattore di diluizione non deve essere eseguito prima di aprire la porta esterna.
2. Le cellule Introduzione e alimentazione
- Impostazione incubatore
- Mettere 3 piastre di Petri in padella acqua alla base di ogni incubatore. Riempire questi piatti con sterile acqua. Non riempire direttamente la vaschetta dell'acqua. Mantenere il livello dell'acqua in questi piatti, in quanto sono critici per il mantenimento del set di umidità relativa (RH) in incubatrici.
- Entro l'interfaccia grafica, fare clic sul incubatrice. Fare clic sul valore esistente per l'umidità relativa (RH) in set point e inserire 85%. Fare clic sul segno di spunta verde per accettare questo valore.
- Preparazione del cellulare Production Facility per le celle
- Se non già fatto, regolare le camere tampone, la camera di processo, e un incubatore per i set point gas necessari per il tipo di cellule in fase di introduzione.
- Pulire la superficie della camera di processo con garza sterile e disinfettante non infiammabile. Non utilizzare disinfettanti a base di acido peracetico, come in un sistema chiuso forte, vapori persistente sono tossici per le cellule di mammifero. Invece, utilizzare prodotti a base di cloruro-benzalconio.
- Continuare la disinfezione. Pulire i guanti e le superfici che sono commoolo toccato, come ad esempio le maniglie delle porte. Utilizzare il disinfettante accuratamente, ma con moderazione, come eccesso di liquido nella camera di processo contribuirà ad umidità, condensazione ed eventuale crescita microbica.
- Pulire la superficie della cappa a flusso laminare e buffer da camera con il 70% di etanolo, e lasciarlo asciugare. Porre il pallone o lastre di cellule (nel nostro caso, PSCs o NSC) nella cappa, e brevemente strofinare la superficie esterna con una garza sterile saturata con etanolo.
- Mettere il pallone o placca nella camera di buffer, ed eseguire un fattore di diluizione (punto 1.2.3).
- Al completamento del fattore di diluizione, spostare immediatamente il pallone o piastra per l'incubatore appropriata. Poiché le incubatrici sono sul retro della camera di processo, tirare una mensola fuori nella camera di processo per il posizionamento delle cellule. Evitare di aprire le porte incubatore inutilmente o per periodi di tempo prolungati, come l'aria della camera di processo è molto secca rispetto a quella degli incubatori, e si tradurrà in un significativoperdita di umidità in incubatrice.
- Alimentazione colture cellulari
- Raccogliere componenti medie, pipette sierologiche, una pipetta elettronica, garze e disinfettanti. raccogliere anche un contenitore per rifiuti per mezzo di coltura cellulare speso, ma non riempirlo con candeggina. Portare il materiale nella camera di processo attraverso una camera di buffer come descritto al punto 1.2. Preparare mezzo di coltura cellulare nella camera di processo, come precedentemente descritto 9,10 (vedi anche materiali Tabella)
- Disposizione dei materiali in modo tale da consentire uno spazio di lavoro ottimale. Evitare di posizionare oggetti non utilizzati nel centro della camera di processo.
- Lasciare per il mezzo per equilibrare i livelli di CO 2 e O 2 presenti all'interno del sistema, lasciando il contenitore multimediale un po 'senza cappuccio. Alcuni produttori di medie PSC indicano di non riscaldare i media a 37 ° C; se questo è il caso, utilizzare una camera polmone per equilibrare il mezzo. Lasciare che il meDIUM si stabilizzi per 20 min.
- Rimuovere la vecchia media da pozzi utilizzando una pipetta stereologica appropriato e una pipetta elettronica. Per PSC, rimuovere tutti ma una piccola quantità rimanente del vecchio medium, sufficiente a prevenire l'essiccamento durante il processo di alimentazione. Per NSC, rimuovere la metà del vecchio mezzo. Dispensare i rifiuti nel contenitore dei rifiuti.
- Posizionare la pipetta utilizzato di nuovo nella sua confezione originale e spostarlo verso il lato della camera di processo, o in una camera polmone designato per la rimozione dei rifiuti. Con una pipetta sierologica sterile fresco, aggiungere mezzo fresco a cella piastre di coltura e posizionare le piastre di nuovo nella loro incubatrice designato.
- A fine alimentazione, spruzzo di garza con disinfettante e pulire il pavimento e porte maniglie della camera di processo accuratamente. Se sono presenti più linee cellulari coltivate nel sistema, sterilizzare tra alimentano linea cellulare. Questo aiuta a ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata.
- Al termine, rimuovere i rifiutio altri elementi non necessari attraverso una delle camere tampone.
3. Culture Splitting cellulari
- Enzimatica Passaging di PSC o NSC
- Raccogliere tutti gli elementi necessari per passaging. Questo comprende media, enzimatica o tampone di dissociazione cellulare non enzimatica (quest'ultima è per NSC solo), DPBS, piastre o fiaschi, matrice extracellulare (ECM), tubi conici, e pipette sierologici. Portateli nel sistema utilizzando una camera di buffer.
- Coat piatti freschi o boccette con ECM, come precedentemente descritto 9,10. Alcuni ECM -come quelle derivate da linee cellulari del mouse sarcoma - sono solo liquido tra 4 e 15 ° C, in modo da utilizzare un blocco di ghiaccio o gel impacco freddo sterilizzato per mantenere il freddo ECM mentre si lavora in camera di processo riscaldata.
- Pipettare off medio trascorso dalla cultura e smaltirlo nel contenitore dei rifiuti.
- Sciacquare bene la superficie o pallone usando 1 ml di DPBS / bene e smaltire il DPBS.
- Aggiungere 1 - 2ml di enzima caldo per ogni pozzetto. Solo culture molto densi richiedono 2 ml.
- spostare immediatamente il piatto di cultura o di pallone alla camera microscopio, e osservare attentamente la cultura. Attenzione ai segni di singole cellule che cominciano ad allentare fuori il piatto. Non aspettare fino a quando le cellule galleggiare in sospensione prima di procedere alla fase successiva.
- Ritorno alle cellule di camera di processo principale. Usando una pipetta da 5 ml sierologica, aggiungere 4 ml di DPBS per ogni 1 ml di enzima, e poi con forza pipettare su e giù per rimuovere le cellule dalla superficie bene. Se passaging pozzi multipli all'interno di una lastra alveolare, aggiungere i DPBS ad ogni ben prima sloggiare le cellule dai singoli pozzi.
- Trasferire l'enzima e sospensione cellulare PBS a un tubo conico di dimensioni adeguate.
- Se una centrifuga non è disponibile nella struttura di produzione di celle, strettamente sigillare il tubo conico, inserirlo in una camera polmone e sigillare la porta chiusa.
- Rimuovere il tubo conico dal bufcamera di fer dal lato flusso laminare e girare le cellule a 100 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Spruzzare il tubo conico con il 70% di etanolo, e portarlo in camera di processo usando una camera polmone e fattore di diluizione.
- Pipettare il sopranatante e risospendere le cellule in 2 ml di PSC o medio NSC. Se passaging PSC, assicurarsi di includere inibitore ROCK nel mezzo ad una concentrazione di 10 micron, come descritto in precedenza 9,10.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e determinare il numero di pozzi o piatti richiesti. PSC piastra a 5 x 04-01 Ottobre x 10 5 cellule / cm 2. Dividere le NSCs in un rapporto di 1: 2.
Nota: NSC spesso ciuffo e resistere conteggio preciso in un emocitometro. - Se è necessaria la crioconservazione delle cellule, seguire il protocollo appropriato 9,10, ma assicurarsi che tutti i materiali di consumo e supporti di congelamento vengono preparati in anticipo e poste all'interno della camera di processo. DMSO è molto tossico per le cellule a 376; C, in modo da lavorare molto rapidamente. Mantenere il contenitore di congelamento isopropanolo-rivestito a temperatura ambiente nella cappa a flusso laminare. Una volta che i flaconi crioconservazione vengono riempiti e sigillati, rimuovere immediatamente le fiale dalla camera di processo facendoli passare attraverso una camera di buffer.
- Passaging Manuale di PSC
- Verificare che la cultura ha bisogno di essere diversi passaggi, come descritto in precedenza 8. Se è così, preparare piastre fresche o fiaschi rivestiti con matrice extracellulare. Quindi modificare il medium del tutto.
- Pulire la camera microscopio con garza sterile inumidito con una quantità di disinfettante risparmio non infiammabile - troppo si tradurrà in eccesso appannamento nella camera. Pulire la guanti, superficie, e lo stadio. Portare diversi puntali confezionati singolarmente 200 microlitri o 1.000 microlitri nella camera.
- Portare la piastra del PSC nella camera di microscopio, togliere il coperchio, e posizionarlo a faccia in giù sul pavimento appena pulita. Lasciando il coperchio fino espone il dir inferioreectly alle correnti d'aria, e alla contaminazione potenziale.
- Scartare un puntale, e utilizzando il microscopio per visualizzare la cultura, scegliere a parte le colonie che hanno una buona morfologia usando la punta della pipetta.
Nota: Il puntale può essere collegato a una pipetta se l'utente individuo trova questo più comodo. - Sostituire il coperchio sulla piastra, e spostare la piastra posteriore alla camera di processo.
- Pipettare in eccesso ECM dal nuovo piatto, e trasferire il supporto dal vecchio piatto (contenente i pezzi colonia in sospensione) alla nuova piastra. Se la piastra vecchio contiene ancora le colonie che non sono pronti per essere raccolti, dargli da mangiare pure.
4. tecniche di coltura specializzata
- Sendai trasduzione di fibroblasti in PSC
- All'interno della struttura di produzione di celle, espandere fibroblasti cutanei umani 1 a supporto dei fibroblasti contenenti DMEM / F12, 10% FBS, e 20 ng / ml FGF2, al 5% O 2. Utilizzare 6 pozzetti cultura dishes rivestite con 0,1% di gelatina.
- Preparare le celle da trasdotte da loro dissociazione di 1 ml di 0,25% tripsina per pozzetto. Inattivare i tripsina con il mezzo 1 ml di fibroblasti. Spin a 200 xg, risospendere le cellule in 1 ml di terreno di fibroblasti, e contare utilizzando un emocitometro.
- Risospendere 2.0 x 10 5 cellule in terreno fibroblasti 2 ml, e aggiungere la sospensione cellulare a 1 pozzetto di una piastra ben 6 rivestita di gelatina (2.1 x 10 4 cellule / cm 2). Mettere le cellule di nuovo in incubatrice.
- Consentire 24 ore per le celle di allegare al fondo della piastra.
- Posizionare medio fibroblasti fresca all'interno della camera di trattamento (1 ml di terreno per pozzetto di celle da trasdotte), e lasciarlo equilibrare ai gas.
- Sterilizzare un blocco freddo pre-raffreddata con il 70% di etanolo e metterlo in una camera di buffer. Utilizzare un impacco di ghiaccio gel con fori tagliati in se un blocco freddo commerciale non è disponibile.
Nota: Ci sono 3 - 4 separata Sendaivirus (a seconda della versione del kit trasduzione), che deve essere scongelato in fretta, ma tenne nel blocco freddo, una volta scongelato. - Immergere la metà inferiore dei tubi in un bagno d'acqua C 37 ° per 15 sec (non immergere i tubi), quindi pulire subito gli esterni del tubo con il 70% di etanolo. Posizionare i tubi sul blocco fredda sterilizzato nella camera polmone ed eseguire un fattore di diluizione.
- Lavorando in fretta, aggiungere il volume necessario di ogni virus riprogrammazione di Sendai al mezzo equilibrata 2. Questo volume è determinato da tre variabili - il numero di cellule, il titolo di ciascun virus, e la molteplicità di infezione desiderata per ogni virus. Consultare il manuale del kit per raccomandata MOI. La formula è la seguente:
[(Numero di cellule essere trasfettata) (molteplicità di infezione) (1000)] / (titolo virale) = richiesta ml di virus - Rimuovere il surnatante dal pozzo (s) di cellule da riprogrammare. Per ogni bene, aggiungere 1 ml di Medium contenente il virus. Oscillare delicatamente la piastra, facendo attenzione a non versare i media, e posizionare la piastra posteriore in O 2 incubatore 5%.
- Dopo 2 ore oscillare delicatamente la piastra di nuovo e ripetere dopo l'altro 2 ore.
- Dopo 24 ore (giorno 1 post-trasduzione), alimentare il bene con 1 ml di terreno di cellule staminali pluripotenti. Ripetere il giorno 2, ma non rimuovere media dal pozzo.
- Nei giorni 3 e 4, modificare la metà del mezzo.
- Il giorno 5 e oltre, cambiare l'intero mezzo.
- Quando appaiono colonie, macchiare la cultura utilizzando anticorpi sterili per confermare che le colonie sono davvero pluripotenti, come descritto in precedenza 2. Come con le cellule di alimentazione, in modo che i mezzi di comunicazione PSC contenenti gli anticorpi sono stati equilibrati a gas nella struttura di produzione di celle.
Nota: In una riprogrammazione di successo, le colonie IPSC dovrebbero essere presenti circa due settimane dopo la trasduzione 1. - Quando le colonie sono cresciuti di grandi dimensioniabbastanza, usare il microscopio per segnare e meccanicamente loro passaggio su una piastra di ECM rivestite, come descritto nella sezione 3.2.
- Espandere le colonie manualmente o enzimaticamente, come precedentemente descritto 9,10.
5. Mettere a posto uso quotidiano
- Mettere tutti i materiali di scarto, tra cui il fiasco rifiuti liquidi, in una camera di tampone sterile. Pulire la superficie della camera di trattamento e di tutte le aree che sono state in contatto da forniture con garza sterile e disinfettante non infiammabile.
- Rimuovere tutti i materiali di scarto solidi dalla camera di buffer e gettare nel contenitore rifiuti appropriato.
- Smaltire i rifiuti liquidi in un contenitore per rifiuti adeguato, o semplicemente mescolare con candeggina e versare giù per lo scarico. Pulire il contenitore di rifiuti con sapone e una spazzola. Sterilizzare il contenitore con 70% etanolo e spostarlo nuovamente alla camera di processo tramite una camera di buffer.
Nota: Non è raccomandato l'uso di candeggina ail contenitore dei rifiuti mentre è all'interno del sistema, come i fumi di candeggina possono ricircolare e danneggiare colture cellulari. - Per motivi di igiene, pulire la superficie di plastica anteriore della camera di lavorazione del sistema con il 70% di etanolo. Questo aiuta a pulire gli oli sudore e la pelle dalla fronte dell'utente.
- Se la formazione di condensa ha costruito all'interno della camera di processo, eseguire un fattore di diluizione per eliminare la condensa. Lasciare almeno 1 ora per questo per il completamento.
6. routine compiti non quotidiane
- Rifornire i piatti d'acqua nei incubatori per colture cellulari con acqua sterile, distillata, se necessario. Top fuori i piatti, almeno una volta alla settimana. Tuttavia, il tasso di evaporazione oscillerà in base alla frequenza delle porte dell'incubatore vengono aperti, il volume di liquido nelle culture, e le impostazioni di incubazione.
- Una volta al mese, ricalibrare le impostazioni O 2 e CO 2 in tutte le camere. Ciò richiede l'uso di SPAN (calibrazione) gas, che contains noti concentrazioni livelli di O 2 e CO 2 come standard di riferimento. Assicurarsi che ci sia un'adeguata fornitura di gas di calibrazione prima di iniziare la calibrazione. Il sistema utilizza sensori di gas specifici, che si trova in ogni modulo, per rilevare le concentrazioni di gas; pertanto, l'uso di gas SPAN alta qualità assicura che i sensori resa affidabile le concentrazioni di gas accurati.
- Sostituire i guanti in camera di processo e la camera microscopio su una base regolare. Sostituire i guanti ogni 2 mesi, indipendentemente da quanto spesso il sistema è utilizzato. Prima dell'installazione, sterilizzare i nuovi guanti con disinfettante. Eseguire un fattore di diluizione sulla camera di processo dopo i guanti sono stati sostituiti.
Nota: Quando allungato sopra i polsini del sistema, guanti di nitrile hanno la tendenza a sviluppare fori nelle aree esposte a stress fisico e calore. Questo è normale e usura inevitabile e lacrimogeni. - Modificare i filtri siringa in tutte le camere ogni 6 mesi.
- Sostituire o lavare tha prefiltro sulla cappa a flusso laminare appena comincia ad apparire sporco.
- Fare riferimento ai documenti del produttore regolarmente per informazioni sulla sostituzione delle parti principali.
7. Pulizia del sistema
- Nel caso di un evento contaminazione che incide sulla maggior parte delle colture cellulari, spostare qualsiasi colture cellulari superstite fuori dal sistema, o (se possibile) in un incubatore inalterati.
- Spegnere il controllo del gas per tutte le camere ad eccezione di quella di incubatori inalterati.
- Rimuovere il pannello frontale flessibile dell'apparecchio e rimuovere i ripiani in acciaio inox dal interessato incubatore di coltura cellulare. Rimuovere anche la vaschetta dell'acqua.
- Autoclave gli scaffali incubatore e vaschetta dell'acqua, e rimetterli in incubatrice. Pulire le superfici interne del incubatore con il 70% di etanolo. Lasciare che l'etanolo evaporare, e chiudere la porta dell'incubatore.
- Pulire le superfici della camera di processo e microscopio con il 70% etHANOL. Riposizionare il pannello frontale dell'apparecchio.
- Pulire le superfici interne dell'apparecchiatura, compresa quella del incubatore interessata, con disinfettante non infiammabile. Lasciare la porta del aperta incubatore interessata, ed eseguire un fattore di diluizione sulla camera di processo. Assicurarsi che le porte della camera di microscopio sono aperti anche.
- Per la pulizia ordinaria degli incubatori di coltura cellulare, in modo che l'incubatore e la camera di processo sono le stesse impostazioni atmosferici. Aprire la porta incubatore e posizionare tutti i piatti di coltura di cellule sulla superficie della camera di processo.
- Pulire gli scaffali di incubazione e le superfici interne con disinfettante non infiammabile. Lasciare che il disinfettante evaporare, e spostare le colture di cellule di nuovo per l'incubatore. Lavora più rapidamente possibile per evitare essiccazione delle colture cellulari.
Risultati
Questo manoscritto descrive in dettaglio un impianto di produzione di cellule, e gli aspetti peculiari della coltura di cellule in un sistema chiuso. La maggior parte della struttura di produzione di celle e dispone di un apparecchio che ha un ingombro ridotto e può essere facilmente alloggiata all'interno di un 6 x 7,5 m 2 Camera (Figura 2) su misura, chiuso, coltura cellulare. In nessun momento sono le cellule all'interno dell'apparato esposta al personale di laboratorio o ambiente. L'apparecchiatura consiste di diversi moduli: una camera di processo, una cappa a flusso laminare, 2 camere buffer tenuta stagna tra il cappuccio e la camera di processo, due incubatori per colture cellulari, e una camera di microscopio adiacente alla camera di processo (Figura 3). Il sistema è controllato da un software consentendo variabili ambientali di essere controllati e monitorati (Figura 1). Il computer che esegue questo software è in un gruppo di continuità. I gas sono alimentati in the sistema da una serie di collettori per ossigeno, azoto e anidride carbonica (Figura 4). Gas per il dispositivo siano alimentati da sistemi molteplici che hanno due serie di vasche di ciascuno - un set attiva e una serie di riserva. Quando il set attivo viene prelevato, il collettore passa automaticamente ai serbatoi di sostituzione ordine di riserva impostato e del personale. L'alimentazione è presente un sistema generatore di backup.
Pluripotenti e cellule staminali neurali possono essere coltivate in condizioni di ipossia in questa struttura utilizzando i protocolli sviluppati in precedenza 9, con le complicazioni aggiunti inerenti alle apparecchiature romanzo. Le cellule staminali pluripotenti possono essere derivate utilizzando virus di Sendai, utilizzando anticorpi specifici pluripotenza per identificare colonie completamente transfettate, che vengono poi isolate ed espanse. (Figura 5A e B), Da queste iPSCs, cellule staminali neurali e neuroni possono essere derivate usando l'inibizione doppia SMAD, e il loro fenotipo USI verificati ng anticorpi NSC-specifici (Figura 5C e D).
Figura 1. Interfaccia grafica per la produzione di celle strumento. (A) La rappresentazione grafica del CPF è la schermata di default e corrisponde al disegno CAD mostrato in Figura 3. Un clic del mouse sul buffer Modulo 1 (2F nella figura 1) apre il suo schermo di controllo (B), dove sono impostati O 2 valori per abbinare la camera di trattamento (3 nella Figura 3). Allo stesso modo, cliccando sul processo di Camera o Incubator 1 porta le loro rispettive schermate di controllo (C e D, rispettivamente), dove i valori possono essere modificati o controllati a seconda dei casi. rget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. The Cell Production Facility. (A) Il sistema come visto da una vista anteriore destra. Notare i collegamenti di alimentazione e di gas nel soffitto e il carrello con gli accessori microscopio e il computer a destra. (B) La cappa a flusso laminare con le porte di accesso ai moduli buffer visti a destra. (C) La camera di processo con i due incubatori (porte nere) visto nella parte posteriore. (D) Una vista attraverso il lato destro del sistema che mostra il microscopio e monitorare con le porte delle camere di tampone visto in lontananza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Un disegno CAD della cella Production. Tutti gli elementi che entrano nel dispositivo vengono dapprima pulito con alcool ed aria secca nella cappa a flusso laminare (1). Gli articoli vengono quindi trasferiti nella atmosfera appropriata nel modulo front buffer (2F) prima di passare nel modulo UCPC, o Process sezione (3). Le cellule sono coltivate in due incubatrici (4, 5). Colorazione delle cellule vive, colonia raccolta, valutazione della morfologia cellulare generale e analisi di migrazione avviene nel modulo UPC, o Microscopio Camera (6). Infine, i rifiuti esce dal sistema attraverso il modulo di buffer posteriore (2R). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. < / P>
Figura 4. Fonti di gas e di potere. (A) Il collettore di CO 2 è una configurazione 4 x 4 in quanto fornisce tutti gli incubatori del laboratorio. (B) Il collettore O 2 è un 2 x 2 di installazione e fornisce solo l'impianto di produzione di cellule. Azoto per il sistema è generata in un vaporizzatore (C, appena sotto il segno Exit) collegato ad un collettore azoto liquido (verso destra) che riempie anche automaticamente cryofreezers (in basso a sinistra). Il collettore è una configurazione 2 x 2 è rifornita da due coppie di 160 L serbatoi di azoto liquido. CO 2, O 2 e N 2 sono forniti dal soffitto tramite Shutoffs (D). Casa vuoto viene fornito anche in questa posizione. Visto appena dietro le Shutoffs gas di alimentazione sono una coppia di cavi elettrici che alimentano il sistema.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. cellule staminali pluripotenti derivate in ipossia con il virus di Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenclatura si trovano in Stover et al. 9), contrasto di fase 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs live-macchiato con AF-594-marcato Tra-1-60, diluizione 1: 100 in media. Tutti iPSCs sono state trasdotte nella struttura di produzione di celle a 5% O 2 con il virus di Sendai. (C) contrasto di fase di NSCs SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC-derivati, cresciuto al 5% O 2 in camera di diapositive. Le cellule sono state poi fissate in paraformaldeide al 4% e colorati con anticorpo primario Nestin anti-umano, e Alex-488 anticorpo secondario. Tutte le barre di scala sono a 1001;. M Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussione
Le cellule coltivate nei CPF vedono alcun cambiamento nelle concentrazioni di ossigeno o di anidride carbonica mentre si spostano da incubatrice al trattamento da camera al microscopio da camera e indietro. È fondamentale che le condizioni in ciascuna camera sono abbinati al particolare incubatore in cui le cellule sono mantenute prima che le cellule vengono rimosse dal termostato. L'atmosfera all'interno dell'apparato è continuamente HEPA filtrata ed è personalizzabile in materia di concentrazioni di ossigeno e anidride carbonica. Le cellule possono essere coltivate in concentrazioni standard per PSC o NSC, 5% e il 9%, rispettivamente; o concentrazioni alternative possono essere scelti per diversi tipi di cellule o per esperimenti specifici. Pertanto, l'apparato è fornito con fonti costanti di grado medico ossigeno, anidride carbonica e azoto (Figura 4). Tutti e tre di questi gas sono forniti da sistemi molteplici specifiche di gas che garantiscono forniture costanti. L'apparecchio è fornito con una miscela di gas di taratura rappresentati10% (± 0,01%) di anidride carbonica in ossigeno. I sistemi di collettore si trovano al di fuori dello stabilimento di produzione delle cellule e i gas vengono convogliati nella struttura attraverso il soffitto. Il gas di taratura è alloggiato all'interno della struttura. L'apparecchio è inoltre fornito con il vuoto casa, anche attraverso il soffitto. L'utilizzo di un sistema di monitoraggio elettronico e wireless unità invio, le pressioni di uscita di tutti i collettori sono costantemente monitorati. Nel caso in cui qualsiasi pressione scende fuori campo, i gestori di impianti di produzione di celle vengono automaticamente telefonato e notificate in modo tale che l'azione appropriata può essere adottata.
I requisiti di alimentazione degli apparecchi sono soddisfatte da sei dedicati 120 V circuiti che scendono dal soffitto e collegate a generatori di back-up dell'ospedale al fine di garantire un costante rifornimento. Il funzionamento dell'apparecchiatura è controllata via software su un computer basato su PC alimentato tramite un gruppo di continuità. Queste disposizioni di potenza e computergarantire che il sistema funzioni continuamente anche in caso di guasto del sistema di alimentazione pubblica. Il software che controlla l'apparecchio ha un'interfaccia grafica user-friendly (figura 1) che consente il controllo delle concentrazioni di ossigeno e anidride carbonica e pressioni di temperatura, umidità, e da camera. I valori di tutti questi parametri vengono registrate in continuo per fornire una registrazione parziale di tutti i parametri dell'apparato. Questi dati viene eseguito il backup su un server remoto ogni notte per proteggere la loro integrità. Il computer e il software è possibile accedere in remoto dagli utenti amministrativi per valutare e / o modificare qualsiasi parametro. Inoltre, il computer e il software è possibile accedere in remoto, consentendo la valutazione interattiva dei parametri di apparecchi e la risoluzione dei problemi con gli utenti locali. Un ulteriore unità di invio allarme è collegato all'apparato tale che gli operatori degli impianti di produzione di celle vengono informati di qualsiasi condizione out-of-range dell'apparecchiatura. L'accesso a distanza capabilities permettono il login e la valutazione delle specificità della condizione out-of-range.
L'apparecchio è progettato come un sistema modulare sia in una macro e micro senso. I singoli moduli di coltura cellulare, quali incubatori e camere di lavorazione, possono essere personalizzati in vista delle loro dimensioni e requisiti nonché nella loro disposizione rispetto all'altro. Inoltre, la maggior parte delle funzioni di controllo dei singoli moduli sono essi stessi modulare tale che singoli regolatori gas atmosferici, per esempio, può essere facilmente sostituito senza notevoli disagi al sistema.
camere di elaborazione specializzati, ad esempio uno per visualizzazione microscopica e manipolazione di colture cellulari, possono essere facilmente adattati al sistema. Sia a contrasto di fase e microscopio a fluorescenza sono all'interno del sistema (figura 6) in modo che le cellule possono essere vivo macchiati, e le colonie possono essere sezionati nelle stesse condizioni atmosferiche come all'interno tegli incubatrici. Routing dei cavi attraverso occhielli sigillati nelle pareti laterali della camera di trattamento consente apparecchiature come alimentatori e computer per essere tenuti al di fuori dell'apparato, di solito su un carrello (Figura 6).
Le camere di elaborazione nella struttura di produzione di cellule hanno un modello diverso da quello del flusso d'aria BSC convenzionali. In BSC convenzionali, il flusso d'aria scorre verso il basso da una bocca di scarico centrale e si divide in due flussi separati, che vengono poi ripresi da due differenti prese d'aria nella parte anteriore ed a poppa del pavimento del cabinet. Per contro, il CPF ha un unico sfogo nella porzione anteriore del soffitto. L'aria fluisce verso il basso e verso la parte posteriore della camera, dove viene quindi trascinato verso l'alto in una bocchetta di aspirazione. Sebbene il CPF è intrinsecamente molto pulito, questo campo di flusso unico significa che i tecnici devono modificare leggermente la tecnica per ridurre il rischio di contaminazione. Come con un BSC convenzionale, un tecnico di laboratorio should evitare di mettere le mani monte di piastre di coltura di cellule aperte e bottiglie di media. Tuttavia, la direzione che è a monte è stato alterato nel CPF
L'impianto di laboratorio di produzione cellula stessa è abbastanza standard ed è dotato di un congelatore C -20 °, a -80 ° C congelatore, un frigorifero C 4 °, una centrifuga, e un bagno di acqua. Il laboratorio ha anche un lavandino con i comandi a pedale per il funzionamento conveniente a mani libere. Affinché questo laboratorio per diventare un impianto di produzione di celle funzionale clinica, tuttavia, devono ancora essere effettuate diverse modifiche aggiuntive. In primo luogo, l'apparato stesso deve essere aggiornato per avere la capacità di monitorare i composti organici volatili, particolato, e le concentrazioni di biossido di cloro che viene utilizzato per la decontaminazione. In secondo luogo, una camera di trattamento contenente una macchina FACS può essere alloggiato e collegato al resto del dispositivo tramite un modulo buffer. Ciò consentirà di selezione cellulare e purificazione di trpopolazioni di cellule ansplantable alle condizioni ambientali adeguate. Infine, l'intero apparato deve essere alloggiata all'interno di una stanza pulita muro morbido. Ciò fornisce un International Organization for Standardization (ISO) Classe 8 ambiente per l'apparato 5.
L'elevata sterilità e la natura controllato dal computer del CPF lo rende un sistema ideale per le applicazioni future con la terapia a base di cellule e buoni processi di fabbricazione. Il rischio di contaminazione è notevolmente mitigato, ma ancora più importante, le condizioni di espansione delle cellule vengono automaticamente registrati e archiviati dal sistema informatico. Deviazioni in concentrazioni di gas, temperatura, umidità, e tutti gli eventi di accesso al sistema sono rigorosamente documentati. Questo può essere di grande aiuto quando si studiano i problemi di qualità del prodotto. Tuttavia, vi sono ancora limiti. L'utilizzo di qualsiasi e tutti i reagenti e materiali di consumo (ad esempio, i componenti multimediali, pipette, piastre) deve essere documentata separatamente. Aggiungereitionally, ci sono una moltitudine di potenziali problemi (tra cui molte forme di errore umano) che possono sorgere che sono completamente estranei alle variabili documentate dal sistema di monitoraggio del CPF. Pertanto, la necessità di personale altamente qualificato e documentazione dettagliato manuale di compiti rimane al suo posto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere il personale Biospherix per il loro aiuto per imparare a utilizzare il sistema di coltura cellulare Xvivo chiusa, soprattutto Matt Freeman; il personale di Miles & Kelley Construction Company, Inc. per il loro lavoro nella creazione delle infrastrutture di laboratorio, in particolare Russ Hughes; il personale dell'ospedale dei bambini del dipartimento Orange County di Strutture e servizi di supporto per il loro lavoro nel coordinare la ristrutturazione di laboratorio, in particolare Adam Lukhard e Devin Hugie; il personale dell'ospedale dei bambini del dipartimento Orange County di Sistemi Informativi per il loro aiuto nella creazione delle infrastrutture di gestione dei dati e l'accesso remoto, in particolare Viet Tran; Ospedale dei Bambini di Orange County Executive Management team per il loro lunga sostegno del progetto, in particolare il Dr. Maria Minon e Brent Dethlefs. Questo lavoro è stato finanziato dal Children Hospital di Orange County e il California Institute for Regenerative Medicine attraverso la concessione TR3-05476 a PHS. Tutti gli autori hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | su misura | |
| Xvivo Software | Biospherix | versione i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Collettore | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| Collettore CO2 | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscopio con fotocamera DP21 e fluorescenza | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Nome | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagenti | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| Integratore StemPro hESC Life | Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Clone | sodio tamponato con fosfato | 9236 | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti 2 | R& D Systems | AFL233 | |
| Dimetil solfossido | Protide | PP1130 | |
| Dissociazione cellulare a base di Hank Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Fattore di crescita epidermico | R& D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Anticorpo | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Anticorpo | Millipore | MAB4260 | |
| Anticorpo SSEA4 | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Integratore di siero | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Consumabili Supplies | |||
| 2 ml Pipetta sierologica | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Pipetta sierologica | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Pipetta sierologica | Olympus Plastics | 12-104 | |
| pipetta sierologica da 25 ml | Olympus Plastics | 12-106 | |
| pipetta sierologica da 50 ml | Olympus Plastics | 12-107 | |
| piastra a 6 pozzetti | Corning | 353046 | |
| piastra a 12 pozzetti | Pallone Corning | 353043 | |
| T25 | TPP | 90026 | |
| Pallone T-75 | TPP | 90076 | |
| 20 µ l. puntali per pipette | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µ l puntali per pipette | Eppendorf | 22491148 | |
| 1.000 puntali per pipette | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% etanolo | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| candeggina | Clorox | A714239 |
Riferimenti
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
Ristampe e permessi
