Articolo metodologico

Le differenze di sesso in ippocampali di topo astrociti dopo

DOI:

10.3791/53695

⸱

25 ottobre 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli astrociti sono uno dei più importanti attori chiave del sistema nervoso centrale (SNC). Qui, stiamo riportando un metodo pratico di sessuato dell'ippocampo protocollo cultura astrociti al fine di studiare i meccanismi alla base della funzione degli astrociti in cuccioli di neonato maschio e femmina dopo ischemia in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrogliosis seguente ipossia / ischemia (HI) lesione cerebrale -related svolge un ruolo in un aumento della morbilità e mortalità nei neonati. Recenti studi clinici indicano che la gravità della lesione cerebrale sembrano essere il sesso dipendente, e che i neonati maschi sono più sensibili agli effetti di lesioni cerebrali HI-correlati, con conseguente esiti neurologici più gravi rispetto alle femmine con lesioni cerebrali simili. Lo sviluppo di metodi affidabili per isolare e mantenere le popolazioni altamente arricchito di sessuato astrociti dell'ippocampo è essenziale per comprendere la base cellulare di differenze di sesso e le conseguenze patologiche di HI neonatale. In questo studio, si descrive un metodo per la creazione di specifiche culture astrociti dell'ippocampo di sesso che sono sottoposti a un modello di ischemia in vitro, deprivazione di ossigeno e glucosio, seguito da riossigenazione. Successivamente astrogliosi reattiva è stata esaminata dal immunostaining per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e S100B. Questo metodo fornisce un utile strumento per studiare il ruolo del maschio e astrociti dell'ippocampo femminili seguente neonatale HI, separatamente.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli astrociti sono uno dei più importanti attori chiave del sistema nervoso centrale (SNC). crescente corpo di evidenze indicano che i ruoli di astrociti sono più di sostegno neuronale. Infatti, i ruoli di astrociti in condizioni fisiologiche possono essere molto complessa, come guidare la migrazione degli assoni sviluppo 1, regolazione del flusso sanguigno CNS 2, mantenendo l'omeostasi pH della sinaptica liquido interstiziale 3, e partecipando la barriera ematoencefalica 4 e 5 la trasmissione sinaptica. In condizioni patologiche, astrociti rispondono al danno con un processo chiamato astrogliosis reattiva in cui la morfologia, numero, la posizione, la topografia (rispetto alla distanza da insulto) e funzione delle astrociti possono cambiare in modo eterogeneo 6,7. Astrogliosis visto seguente neonatale encefalopatia ischemica ipossica forse contribuire alla morbilità e la mortalità dei neonati 8.

studi clinici e sperimentali recenti indicano che la gravità del danno cerebrale sembra essere il sesso-dipendente e che i neonati maschi sono più sensibili agli effetti di ipossia / ischemia (HI) lesione cerebrale -related, con conseguente esiti neurologici più gravi rispetto a femmine con lesioni cerebrali paragonabili 9-11. Sebbene la localizzazione della lesione dipende dall'età gestazionale e la durata e la gravità dell'insulto, ippocampo è una delle regioni più comunemente effettuata nel SNC dopo termine neonatale HI, e aumentato astrogliosis ippocampo è stato confermato da up-regolazione Protein fibrillare gliale acida (GFAP) 3 d dopo la HI neonatale 7,10,12,13. Differenze di genere nella funzione degli astrociti sono stati mostrati in entrambi i neonati e nei roditori adulti dopo ischemia cerebrale 14,15. Inoltre, maschio suscettibilità astrociti di ischemia in vitro è stato dimostrato da un aumento cell morte rispetto ai astrociti corticali femminili nella cultura 16.

Differenze di sesso iniziano in utero e continuare fino alla morte 17. Negli ultimi dieci anni, l'importanza di includere i sessi in condizioni sperimentali in coltura cellulare e in vivo studi sono stati l'enfasi dell 'Istituto di Medicina e NIH di cercare la conoscenza fondamentale nelle differenze di sesso visto in condizioni fisiologiche e patologiche 17,18 . Sviluppo di metodi affidabili di isolare e mantenere popolazioni di sessuato astrociti dell'ippocampo è essenziale per comprendere le basi cellulare di differenze di sesso e le conseguenze patologiche di HI neonatale. Il presente studio è stato progettato per fornire le tecniche per preparare culture dell'ippocampo astrociti sesso-specifici arricchito da topi appena nati al fine di valutare il ruolo degli astrociti GFAP-immunoreattive seguenti ossigeno / glucosio Deprivation (OGD) e riossigenazione (Reox), inducendoHI in ambiente di coltura cellulare. Questa tecnica può essere utilizzata per testare qualsiasi ipotesi di pertinenza astrociti dell'ippocampo nei maschi e nelle femmine neonatali in condizioni normossiche e ischemiche.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Questo studio è stato condotto in conformità con la raccomandazione della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institute of Health. Il protocollo animale è stato approvato dalla University of Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care e del Comitato Usa. Primaria protocollo cultura astrociti che viene qui presentata è adottato dai protocolli presentati da Zhang Y 19 et al. E Cengiz P 20 et al., Con alcune modifiche.

1. ippocampale dissezione e la cultura astrociti

  1. Preparare tutti i reagenti e materiali necessari, tra cui forbici chirurgiche, una pinza sottile liscia, pinze punta piatti, tovaglioli di carta, il sacchetto dei rifiuti, il 70% di etanolo e 2 piatti dissezione (3,5 centimetri di diametro) sul ghiaccio riempito con 2 Soluzione di ml Hank salina bilanciata (HBSS) ogni . Assicurarsi che il apparecchi chirurgici sono sterili (autoclave) prima procedura e usare tutti gli altri materiali (astrociti placcatura media: siero DMEM + 5% di cavallo +1% di penicillina-streptomicina, siero di cavallo, HBSS, 0,25% tripsina, vetrini, piastre di Petri, 15/50 mL, fiasche T25, etc.) come pre-sterile.
  2. Delicatamente tenere e spruzzare la testa e il collo del cucciolo del mouse con il 70% di etanolo e decapitare con le forbici sterili affilate [Figura 1 (1)].
  3. Eseguire un'incisione mediana da posteriore ad anteriore cranio con piccole forbici lungo il cuoio capelluto per esporre il cervello [Figura 1 (2-3)].
  4. Tagliare il cranio con cura dal collo al naso con piccole forbici. Poi tagliare cranio anteriore ai bulbi olfattivi e inferiore al cervelletto per scollegare il cranio dalla base del cranio.
  5. Fai una piccola incisione alla base del cranio e tagliare lungo la linea mediana. Utilizzare sterili pinze a punta piatta a staccarsi il cranio. Rimuovere il tronco cerebrale con l'aiuto di una pinza curve. Rimuovere il cervello dal cranio e posto in primo piatto dissezione [Figura 1 (4-9)] 21.
  6. Utilizzando una pinza curva, capovolgere il cervello in modo che la superficie ventrale del cervello è rivolto verso l'alto e poi separare entrambi gli emisferi con una lama chirurgica sterile tagliente [Figura 1 (10,11)]
  7. Staccare gli emisferi cerebrali e rimuovere con attenzione il tessuto mesencefalo e del talamo sporgenti con una sterile pinze curve piatte a rivelare l'ippocampo, una piccola struttura a forma di cavalluccio marino nel lobo temporale mediale [Figura 1 (12-14)].
  8. Rimuovere entrambi i lobi dell'ippocampo [Figura 1 (15,16)] e sezionare con attenzione le meningi dai lobi tirando con le belle pinze. Questo passaggio consente di evitare la contaminazione della cultura finale astrociti dalle cellule meningee e fibroblasti.
  9. Trasferire i lobi dell'ippocampo preparati nel secondo piatto pieno di HBSS e riportarlo sul ghiaccio [Figura 1 (17,18)]. Pool sia dell'ippocampo lobi da un singolo mouse (P0 - P2) per la preparazione di Ipponaculture Campal astrociti. Questo dà la giusta densità astrociti. Tritare lobi dell'ippocampo usando una lama affilata chirurgico sterile (circa 4 volte).
  10. Aspirare HBSS da piatto con una punta sterile, collegato a un mL pipetta 1 e aggiungere 3 ml di 0,25% tripsina, mescolare, trasferire in un tubo conico sterili 15 ml e incubare il tessuto a 37 ° C per 20 minuti agitando delicatamente.
  11. tubo Centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante con cura utilizzando una pipetta di vetro sterile, collegato a una linea di vuoto. Aggiungere 10 ml astrociti placcatura medio e triturare (20 - 30 volte) utilizzando un incendio lucidato pipetta di vetro fino a pezzi di tessuto omogeneizzare.
  12. tubo Centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e aggiungere 2 ml di mezzi astrociti placcatura preriscaldata fresco. Passare cellule attraverso un filtro a maglia 70 micron (colino cella) in un nuovo tubo da 50 ml.
  13. intera sospensione cellulare piastra su un pallone di coltura T25 sterile Poly-D-lisina / laminina rivestito contenente 3 mL dimezzi astrociti placcatura, poi incubare il pallone a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
  14. Aspirare tutta la media al giorno- I n-vitro (DIV) 1, DIV 3 e DIV 7, e sostituirlo con 2 ml di mezzi freschi astrociti placcatura. Osservare la progressione e la confluenza astrocitari sotto microscopio ottico ogni volta che durante la sostituzione del supporto astrociti placcatura.
    NOTA: A DIV 1, tutti gli astrociti vitali sono attaccati alla superficie del pallone di coltura e le cellule morte o morenti che includono i neuroni sono galleggianti nel supernatante. A DIV 3, le cellule attaccate iniziano a dividersi per formare lo strato di cellule astrociti. In assenza di condizioni favorevoli, cultura è quasi privo di crescita neuronale. A DIV 7, strato astrociti è circa 80 - 90% confluenti e pochi microglia e cellule precursori degli oligodendrociti sono presenti sulla parte superiore dello strato di astrociti.
  15. Aspirare il mezzo di placcatura dal pallone, aggiungere 2 ml di preriscaldata astrociti placcatura mezzo fresco, sciacquare unND rimuovere di nuovo a DIV 11, quando gli astrociti sono confluenti e pronti per sub coltura.
  16. Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina, delicatamente ruotare il pallone un paio di volte e aspirare tripsina usando una pipetta di vetro sterile.
  17. Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina e lasciare che il pallone sedersi nella cappa coltura di tessuti per 4-5 minuti a temperatura ambiente.
  18. Rimuovere la tripsina e mantenere il matraccio a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 10 min. Aggiungere 5 ml preriscaldata astrociti placcatura medio e staccare lo strato di astrociti toccando il pallone contro il palmo della mano (3 - 4 volte), seguito da dolce triturazione per ottenere completo distacco e raccogliere i astrociti in un tubo da 15 ml.
  19. provetta da centrifuga a 300 xg per 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 1 ml di media astrociti fresco placcatura.
  20. Aggiungere 10 ml di sospensione cellulare per un emocitometro e contare le cellule nella grande area centrale reticolata (1 mm 2) usando un microscopio a contrasto di fase invertita (obiettivo 10X). Multiply da 10 4 per stimare il numero di cellule per ml. Un pallone T25 produrrà ~ 1 x 10 6 cellule totali dissociato. Seed ~ 1 x 10 5 cellule in 2 ml astrociti medio placcatura in 12 mm di diametro Poly-D-lisina coprioggetto vetro preverniciato nel pozzo di un piatto della cultura 24 pozzetti.
  21. Incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Eseguire OGD / Reox a DIV 12 - 14 (sezione 2).
  22. Trattare le colture di astrociti in DIV 3 con 5 mM estere metilico (LME) cloridrato L-leucina fino DIV 11 se si desiderano culture ippocampali privi di microglia. Dopo LME incubazione, culture soggetti a agitazione (300 rpm per 1 ora) per rimuovere la contaminazione microglia.
    NOTA: LME è un agente citotossico microglia che è stato ampiamente utilizzato come metodo per eliminare proliferanti microglia 22.

2. OGD / Trattamento Reox

  1. supporti Aspirare dal vetrino contenenti cultura astrociti aderente (DIV 12 - 14) e risciacquare 3 volteruotando delicatamente la cultura piatto 24 pozzetti tenendo il vetrino un paio di volte con 1 mL di soluzione isotonica OGD (pH 7,4) contenente (in mm): 0 di glucosio, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.27 CaCl 2, e 0,81 MgSO 4.
  2. Aggiungere 0,2 mL di soluzione OGD per bene per coprire il vetrino e incubare per 2 ore in un incubatore ipossico contenente il 94% N 2, 1% O 2 e il 5% di CO 2. Mescolare delicatamente con un agitatore orbitale (50 rpm) per i primi 30 min di ipossia per facilitare lo scambio di gas.
  3. Incubare le cellule di controllo normossiche per 2 h in 5% CO 2 e aria atmosferica in un buffer identica alla soluzione OGD eccetto per l'aggiunta di 5,5 mM di glucosio.
  4. Per Reox, aspirare la soluzione OGD e aggiungere 2 ml di astrociti placcatura media. Incubare in 5% CO 2 e aria atmosferica a 37 ° C per 5 ore.

3. Immunocytochemical colorazione

  1. Aspirare il terreno di coltura usando una pipetta di vetro sterile, collegato a una linea di vuoto e sciacquare rapidamente vetrino una volta con l'aggiunta di 1 ml di 0,1 M Tris Buffered Saline (TBS) (154 mM NaCl, 16 mm Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) al pozzo. Aspirare e aggiungere 2 ml di 4% paraformaldeide (PFA) in 1x tampone fosfato (PBS). Incubare per 15 minuti a RT.
  2. Aspirare e aggiungere 1 ml di 0,1 M TBS, poi posto su un agitatore a dondolo per 2 minuti. Ripetere 3 volte. Aggiungere 1 mL soluzione bloccante (10% siero di capra, 10 mg / ml BSA, 0,025% Triton X-100 in 0,1 M TBS) e incubare per 30 min a 37 ° C su un agitatore dondolo.
  3. Aspirare soluzione bloccante e aggiungere monoclonale primario del mouse anticorpo anti-GFAP (0,2 mL di una diluizione 1: 500 in soluzione bloccante) e policlonali di coniglio anti-S100B (1: 500) o policlonale di coniglio anti-HIF1α (1: 200) per 60 min a 37 ° C su un agitatore dondolo.
  4. In alternativa, alcuni astrociti vengono incubate con policlonale di coniglio anti-Iba1 (1: 200) e mon il mouseoclonal anti-MAP2 di accedere alla cultura purezza.
  5. Aspirare anticorpo primario e risciacquare vetrino con l'aggiunta di 1 ml di 0,1 M TBS e mettendo su un agitatore a dondolo per 2 minuti e poi aspirare. Ripetere due volte.
  6. Aggiungere 0,2 ml di una diluizione 1: 200 di capra anti-coniglio secondaria 488-coniugati e anti-topo anticorpi 568 coniugati nel bloccare soluzione per 60 min a 37 ° C su un agitatore dondolo.
  7. Aspirare anticorpo secondario e risciacquare vetrino con l'aggiunta di 1 ml di 0,1 M TBS e posto su un agitatore a dondolo per 2 minuti e poi aspirare. Ripetere due volte.
  8. Rimuovere vetrino da ben asciutta e mettendo su una diapositiva posizionato su una slide-asciugatrice. Monte vetrino su una nuova diapositiva invertendo su una sola goccia di Vectashield hardset mezzo di montaggio con DAPI (1,5 ng / mL).
  9. coprioggetto di immagine su un microscopio confocale utilizzando 20X obiettivo olio secco o 60X. Acquisire le immagini (512 x 512) per DAPI (405 nm ex / 450 nm em) e fluorocromo 488 tagged anticorpi GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Mantenere parametri di acquisizione costanti all'interno del 20X e 60X gruppi.

4. determinazione del sesso Usando PCR

  1. Calore pup punta o ritagli di barretta a 95 ° C per 45 min a 50 mM NaOH e neutralizzare con pari volume di 1 M Tris, pH 6,8.
  2. Aggiungere 1 ml di soluzione di DNA estratto da 19 ml della seguente miscela: 5 pmoli di primer per i geni Myog e Sry, tampone di reazione 1x, 0,2 millimetri ogni deossinucleotide e 8 U Taq polimerasi.
  3. Utilizzare primer sequenze; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' e Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Eseguire il seguente protocollo PCR: 95 ° C per 3 min quindi 30 cicli di denaturazione a 95 ° C per 15 s, ricottura a 58 ° C per 15 s, e l'allungamento a 72 ° C per 1 min. Dopo questi 30 cicli, la reazione si conclude con un finale C elongazione 72 ° per 1 min.
  5. PC separatoR prodotti elettroforesi su gel di agarosio etidio bromuro contenente 2% e visualizzare sotto illuminazione UV. (Figura 2A.) ATTENZIONE! Etidio bromuro è un potenziale cancerogeno e deve essere maneggiata con cura e smaltito correttamente come da regolamento dell'istituzione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La comprensione dei ruoli delle funzioni astrociti sessuati in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche sono stati immensamente chiarito coltivando queste cellule in condizioni in vitro. L'aspetto importante di eseguire coltura sessuato è quello di determinare il sesso del cucciolo del mouse prima del suo utilizzo. Abbiamo determinato il sesso del topo geneticamente mediante PCR e dalla valutazione visiva (Figura 2) 16. La metodologia di determi...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al fine di studiare le differenze di sesso nelle proprietà e la funzione degli astrociti in condizioni fisiologiche e patologiche, la preparazione degli astrociti primari sessuati in coltura cellulare è uno strumento importante da utilizzare. Nel presente studio riportiamo un altamente efficiente e un metodo riproducibile per la cultura di una popolazione omogenea altamente arricchito di astrociti dell'ippocampo sessuati da neonato (P0-P2) C57Bl / 6 (wild type) o K19F (GFAP null) cuccioli di topo in vitro. ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nessuno degli autori sono in competizione o interessi in conflitto.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Programma di premi per le scienze cliniche e traslazionali di NCATS UL1 TR0000427 e KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 all'UW ICTR da NIH/NCATS e fondi da Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 da NINDS (Cengiz P) e NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Vorremmo ringraziare Albee Messing, PhD, per averci fornito i topi knockout GFAP.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreni di coltura per astrociti
DMEM, cellula ad alto glucosiogro10-013-CV
Siero di cavalloGibco26050-070Concentrazione finale: 10%
Penicillina-StreptomicinaCellgro 30-002-CIConcentrazione finale: 1%
L-Leucina metil estere cloridratoAldrichL1002-25GConcentrazione finale: 5 mM
Soluzione per la digestione del tessuto cerebrale
HBSSLife Technologies14170-088
Tripsinacellgro25-050-CIConcentrazione finale: 0,25%
Other
70% (vol/vol) etanoloRoth9065.2
Poli-D-Lisina (PDL) 12 mm rotondo vetrini Corning354087
WaterSigmaW3500Grado per colture cellulari
PBScellgro21-040-CVGrado per colture cellulari
0,05% Tripsina-EDTA Tecnologie di vita25300-062
70 μ m Filtro cellulare sterile Fisher scientific22363548
Piastra di Petri da 3,5 cmBD Falcon353001
Provetta Falcon da 15 mLBD Falcon352096
Provetta Falcon da 50 mLBD Falcon352070
Pinze, fine Dumont2-1032; 2-1033# 3c; # 5
Pinze, punta piattaKLS Martin12-120-11
Forbici chirurgiche da 13 cmAesculapBC-140-R
Microscopio confocaleNikonA1RSi 
CentrifugaEppendorf5805000.0175804R
Agitatore orbitaleThermo ScientificSHKE 4450-1CEMaxQ 4450 
Anti-IBA1Wako019-19741Coniglio monoclonale
Anti-MAP2SigmaM2320Topo monoclonale
Anti-HIF1alphaabcamab179483Coniglio monoclonale
Anti-S100BSigmaHPA015768Coniglio policlonale
Anti-GFAP (cocktail)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Coniglio IgG)Vector LabsPK-6101contiene 4 reagenti 
Capra Anti Coniglio Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
Capra Anti Topo Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294(2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282(2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Privazione di ossigeno e glucosiocoltura di astrocitiastrogliosi reattivaespressione di GFAPespressione di S100Blesione cerebrale neonatalecolorazione in immunofluorescenza

Articoli correlati