L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un in perdita e guadagno-di metodo di funzione che è applicabile per identificare neogenin come un recettore specifico stadio che porta a trophectoderm e la differenziazione massa cellulare interna di embrioni preimpianto mouse.
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Articolo metodologico
Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le tecniche di silenziamento genico e di sovraespressione sono fondamentali per l'identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo embrionale. La modificazione genica bersaglio diretta negli embrioni preimpianto fornisce un mezzo per studiare i meccanismi sottostanti dei geni implicati, ad esempio, nella differenziazione cellulare nel trofoectoderma (TE) e nella massa cellulare interna (ICM). Qui, descriviamo un protocollo che esamina il ruolo della neogenina come autentico recettore per la determinazione iniziale del destino cellulare negli embrioni di topo preimpianto. In primo luogo, discutiamo le manipolazioni sperimentali che sono state utilizzate per produrre guadagno e perdita di funzione della neogenina mediante microiniezione di cDNA e shRNA della neogenina; l'efficacia di questo approccio è stata confermata da una forte correlazione tra i livelli di espressione a coppie della proteina fluorescente rossa (RFP) o della proteina fluorescente verde (GFP) e la quantificazione immunocitochimica dell'espressione della neogenina. In secondo luogo, la sovraespressione di neogenina negli embrioni di topo preimpianto porta al normale sviluppo dell'ICM, mentre il knockdown della neogenina provoca lo sviluppo anomalo dell'ICM, il che implica che la neogenina potrebbe essere un recettore che trasmette segnali extracellulari per guidare i blastomeri verso i primi destini cellulari. Dato il successo di questo protocollo dettagliato nello studio della funzione di un nuovo recettore specifico per lo stadio di sviluppo embrionale, proponiamo che abbia il potenziale per aiutare nell'esplorazione e nell'identificazione di altri geni specifici per lo stadio durante l'embriogenesi.
Introduzione
Preimpianto sviluppo embrionale può essere diviso in più fasi distinte, dalla fase unicellulare alla morula e blastocisti. Molte prove suggeriscono che la polarità e spunti di posizione hanno un ruolo nella determinazione presto il destino della cellula nella trophectoderm (TE) e la massa cellulare interna (ICM). Tuttavia, la natura dei segnali, come sono trasdotti in segnali cellulari e contesti fisiologici in cui tali segnali sono in grado di avviare differenziazione linea cellulare non sono noti. Queste cellule differenziate poi subiscono la specializzazione, cominciando ad assumere strutture caratteristiche e le funzioni necessarie per la corretta formazione dell'embrione e la crescita della placenta 1-3.
embrioni pre-impianto sono particolarmente suscettibili di manipolazione da parte di iniezione diretta del materiale genetico modificato come siRNA o cDNA bersaglio e, quindi, possono essere utilizzati per studiare specifiche molecole bersaglio. Vi è una crescente comprensione che geneticaanalisi degli embrioni dei vertebrati è fondamentale per far progredire la nostra comprensione dello sviluppo embrionale 4. introduzione precisa di un gene wild-type o una forma mutante in un embrione in un contesto tempestivo per realizzare GAIN- o la perdita di funzione del gene ha notevolmente facilitato lo studio dei geni evolutivamente regolamentati. In perdita e guadagno-di-funzione tramite microiniezione di materiale genetico in singoli embrioni non-mammiferi e mammiferi primi è relativamente semplice a causa delle loro grandi dimensioni e di grande ricettività 5. Microiniezione viene in genere eseguita utilizzando vettori non virali. Vantaggio particolare è stata presa la facilità di utilizzo di vettori non virali su vettori virali e transgeni. Una rapida in perdita o il guadagno-di-funzione sistema di espressione in embrioni di topo è stato sviluppato che ci permette di sezionare e capire le funzioni del gene in embriologia vertebrati 6,7.
etichettatura fluorescente di embrioni faciliterebbe notevolmente la selezione di MICRoinjected o geneticamente manipolati embrioni e allo stesso tempo garantire un mezzo per quantificare indirettamente il livello di espressione di microiniezione siRNA o cDNA basato su intensità di fluorescenza 8. Per fare questo l'etichettatura, cDNA proteina fluorescente, GFP o RFP, sono co-iniettata sia come costrutti di fusione o separatamente. L'intensità di fluorescenza di GFP o RFP rivela il grado di espressione di siRNA o il DNA estraneo a garantire che in perdita o guadagno-di-funzione è stato compiuto.
Qui, vi presentiamo un protocollo micromanipolazione per la tecnica funzioni in perdita e il guadagno-of che ci ha permesso di identificare neogenin come un recettore che trasmette segnali extracellulari importanti nella differenziazione delle cellule presto embrioni preimpianto mouse.
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure per l'allevamento degli animali e le cure sono state condotte secondo le norme IACUC di Sahmyook University, Seoul, Corea del Sud.
1. Superovulazione, Allevamento e isolamento Ovidotto
- Mantenere inbred 6 topi C57BL / nelle seguenti condizioni: 22 ± 3 ° C, ~ 60% di umidità, 12 ore di luce / buio ciclo, e acqua e cibo ad libitum.
- Indurre superovulazione di 3-5 settimane di età topi di sesso femminile con un'iniezione intraperitoneale di 5 UI incinta siero di cavalla gonadotropina (PMSG) a 0,1 ml / testa seguita 48 ore dopo da un'iniezione intraperitoneale di 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) a 0,1 ml /capo.
- Immediatamente dopo l'iniezione di hCG, amico femmine superovulazione indotta con i maschi sessualmente maturi dello stesso ceppo mantenendoli nella stessa gabbia durante la notte.
- La mattina successiva, confermare accoppiamento successo dalla presenza di una spina di accoppiamento o la spina vaginale sul tratto genitale femminile.
- Sacrificio incinta topi di sesso femminileda CO 2 intossicazione seguita da cervicale dislocazione 18-20 ore dopo l'iniezione di hCG.
- Aprire la cavità addominale tagliando la pelle e poi lo strato peritoneale con forbici sottili.
- Raccogliete le corna uterine con una pinza sottile e tirare via l'utero, ovidotto, ovaio, e cuscinetto adiposo delicatamente dalla cavità del corpo.
- Tagliare l'area tra il ovidotto e dell'ovaio con le forbici sottili. Riposizionare la pinza e tagliare l'utero prossimità nell'ovidotto, lasciando almeno 1 cm dalla parte superiore dell'utero allegata.
- Trasferire l'ampolla tubarico di 35 mm piastra di Petri contenente medio M16 a temperatura ambiente. Si riuniscono gli ovidotti di diversi topi nello stesso piatto.
- Porre le capsule allo stereomicroscopio per il recupero degli embrioni.
2. Recupero e la cultura di 2 pronuclei (2-PN) Embrioni
- Tagliare la fine di un 30 o 32 G ago ipodermico, macinare in una punta smussata, e usarlo come un ago di lavaggio.
- Usopinza sottile di scivolare alla fine del ovidotto l'ago di lavaggio. Premere delicatamente la punta dell'ago di lavaggio contro il fondo del piatto per tenerlo in posizione. Lavare il ovidotto con ~ 0,1 ml di terreno M16 per liberare gli embrioni 2-PN in una capsula di Petri.
- Recuperare gli embrioni 2-PN con circostante masse cumuliformi dal mezzo M16 lavata con lo stereomicroscopio utilizzando una pipetta di vetro sterile e trasferirli in un nuovo piatto di Petri.
- Dissociare cellule del cumulo da embrioni 2-PN mediante digestione enzimatica con 1,0 ml di 0,1-0,5% ialuronidasi in tampone fosfato salino di Dulbecco (DPBS) a 37 ° C per 5-10 min.
- Spogliare embrioni pipettando delicatamente con una pipetta di vetro e la rimozione fisica delle cellule del cumulo.
- Lavare gli embrioni denudate tre volte con 30-50 ml di fresco tampone fosfato salino (PBS) per embrione.
- Incubare gli embrioni in 35 mm di plastica Petri nei media M16 integrato con 10 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA, Fraction V) a 37 ° C in 5% CO 2 in un incubatore umidificato finché non viene effettuata la microiniezione, che è di solito meno di 4 ore più tardi.
3. embrioni trascrizione inversa (RT) e Reazione a catena della polimerasi (PCR)
- Raccogliere almeno 10 embrioni da ogni fase fino alla fase di blastocisti e piscina in 4,0 ml di 5x trascrittasi inversa soluzione pre-miscela contenente trascrittasi inversa, inibitori della RNasi, oligo dT primer 6mers casuali, miscela dNTP, e il tampone di reazione in un provetta PCR.
- Aggiungere privo di RNasi H 2 O distillata O ad un volume totale di 20 microlitri e sonicare gli embrioni aggregati per 30 sec a 200 W. Iniziare la reazione RT immediatamente a 42 ° C per 1 ora seguito da 5 minuti di incubazione a 95 ° C.
- Per ogni 5,0 ml di soluzione di cDNA generato, condurre normale amplificazione PCR con primer per neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, o β-actina (sequenze di primer riportati nella tabella 1. PCR consiste di 40 cicli di incubazione 15 sec a 95 ° C, 30 sec a temperatura di ricottura (indicata nella Tabella 1), e 30 sec a 72 ° C.
- I prodotti di PCR separate mediante elettroforesi su gel di agarosio 2% e visualizzare il gel sotto luce UV dopo colorazione con bromuro di etidio.
- Normalizzare l'espressione del gene bersaglio contro i livelli di beta-actina.
4. Immunocitochimica di embrioni
- Fix embrioni di ogni fase con 4% paraformaldeide in PBS per 30 min a temperatura ambiente seguita da una breve lavaggio 3 volte con PBS contenente 0,01% BSA.
- membrane cellulari permeabilize incubando 10 embrioni in 1,0 ml di PBS contenente 0,1% di Tween 20 e 0,1% TritonX-100 a temperatura ambiente per 10 min.
- Per bloccare vincolante incubare gli embrioni permeabilizzate in 1,0 ml di PBS aspecifica supplementato con 10% siero di capra normale per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare la embrioni bloccato ingegnoh di coniglio anti-neogenin anticorpi a diluizione 1: 100 in PBS contenente 0,1% BSA notte a 4 ° C.
- Dopo tre lavaggi per 30 sec ciascuno in gocce di PBS, incubare embrioni sia con Alexa 488 coniugato IgG di capra anti-coniglio o Alexa 568 coniugato capra anti-IgG di coniglio a diluizione 1: 500 in soluzione PBS / BSA notte a 4 ° C .
- Per visualizzare filamenti di actina, incubare gli embrioni in 1 ug / ml falloidina in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Stain nuclei aggiungendo 5 ml di PBS contenente 1 mg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato) per 5 min a temperatura ambiente.
- Lavare embrioni tre volte brevemente con PBS.
- Trasferire gli embrioni di un vetrino e coprire con una goccia di olio minerale.
- Prendere immagini a 1,000X ingrandimento con un microscopio confocale ad eccitazione della lunghezza d'onda appropriata.
5. Preparazione di Neogenin-RFP e Neogenin-siRNA GFP Plasmidi
- Subclone cDNA codificante neogenin del mouse in una proteina fluorescente rossa (RFP) -contenenti vettore, con conseguente neogenin-bandiera-RFP.
- Sottoclone piccoli RNA tornante mira neogenin in una proteina fluorescente verde smeraldo (EmGFP) -contenenti vettore, con conseguente pcDNA-EmGFP-miR-neogenin (figura 1).
- Amplificare sia neogenin-bandiera-RFP e plasmidi pcDNA-EmGFP-miR-neogenin e purificare con i metodi convenzionali.
- Regolare le concentrazioni finali di plasmidi a ~ 1,0 mg / ml in tampone sterile Tris-EDTA (TE).
6. microiniezione di plasmidi in 2-PN embrioni
- Lavare le spoglie 2-PN embrioni una volta, brevemente, con i media M16 freschi.
- Centrifugare embrioni 2-PN per 10 min a 1000 xg in una centrifuga da tavolo per consentire l'osservazione della pronuclei.
- Incubare gli embrioni in un micro goccia di 20-30 ml di M16 mezzi per embrione in olio minerale a 37 ° C in 5% CO 2 per un additionale 1-2 ore.
- Fabbricazione pipette di iniezione e pipette in possesso tirando tubi di vetro al borosilicato capillare (OD = 1,2 mm, ID = 0.94 mm) con un estrattore meccanico.
- Realizzare pipette di iniezione di avere punte smussate e levigate aperture di
- Realizzare tiene pipette tale che essi hanno punte smussate e aperture lucidati con un diametro interno di 20 micron e un diametro esterno di 100 micron.
- pipette di iniezione di carico con una quantità sufficiente (> 200 nl) di soluzione plasmide a 1.0 mg / mL.
- Microinject ~ 10 pl di soluzione di plasmide per ogni embrione 2-PN in uno dei pronuclei utilizzando una microinjector collegato a un micromanipolatore motorizzato; durante questo processo, mantenere gli embrioni in posizione applicando pressione negativa con una pipetta tenuta.
- Dopo microiniezione, lavare gli embrioni 2-PN 3 volte con i media M16 fresca per less di 1 min ogni volta.
- Culture embrioni 2-PN in una goccia di supporti M16 fresche su un piatto di coltura di plastica ricoperto di una goccia di olio minerale per prevenire l'evaporazione media.
- Osservare gli embrioni a 24 intervalli hr sotto un contrasto interferenziale differenziale (DIC) microscopio invertito a 200X ingrandimento.
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Risultati
Abbiamo scoperto che neogenin è transitoriamente espresso durante le prime fasi di sviluppo di embrioni di topo preimpianto, che appare già nel allo stadio di 2 cellule e duratura fino agli inizi del morula, ma diventare carente al fine morula e blastocisti fasi (Figura 2A). Inoltre, la distribuzione spaziale dei neogenin era limitata principalmente a celle esterne. I risultati delle analisi RT-PCR sono stati coerenti con la natura precoce e transitoria di espressione ne...
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Discussione
Nel presente protocollo, dimostriamo nuovi metodi di microiniezione del materiale genetico, sia cDNA o shRNA, nelle embrioni 2-PN mouse per esplorare il ruolo di neogenin nella differenziazione delle cellule precoce durante l'embriogenesi mouse. La modificazione genetica degli embrioni preimpianto è una tecnica potente nello scoprire informazioni chiave su meccanismi di base molecolari per, ad esempio, la prima determinazione linea cellulare. La modificazione genetica è uno dei metodi più comunemente utilizzati per ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari di rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano inoltre ringraziare il gruppo del Dr. Xiong presso la Georgia Health Sciences University per la produzione e la condivisione dei costrutti per neogenin cDNA e shRNA vettori. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Science Research Program di base (2013R1A1A4A01012572) finanziato dalla Fondazione coreana di ricerca e da un assegno di ricerca da Sahmyook University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| M16 medio, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOTTO # 11A832 | |
| Siero di capra, | Dako (Glostrup, Danimarca) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Olanda | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Olio minerale | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| gonadotropina corionica umana e gonadotropina sierica cavalla incinta | (Intervet, Olanda) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Trascrittasi inversa | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre miscela | ( Bioneer, Daejon, Corea del Sud) | GenDEPOT, A0224-050 | |
| Agarosio (grado molecolare) | BioRad | 161-3101 | |
| Soluzione di paraformaldeide, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| anticorpo anti-neogenina di coniglio policlonale | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 marcato anticorpo anti-coniglio | Sonde molecolari (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 marcato con anticorpi anti-coniglio | Sonde molecolari (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Sonde molecolari di falloidina | (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilidolo, Dicloridrato) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| RGM-C / Emojuvelin umana ricombinante | R &;D sistemi | 3720-RG | |
| tutti i costrutti plasmidici | Prof. Wen Cheng Xiong presso la Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | per il presente gli studi sono stati gentilmente forniti da | |
| Neon® Sistema di trasfezione | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Sistema di microalimentazione con Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| macinatore | Narishige | EG400 | |
| Estrattore | Sutter Instrumnet azienda | P-97 | |
| CO2 incubatore | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | LifeTechnologies | 4388444 |
Riferimenti
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