L'actina filamentosa (F-actina) svolge un ruolo importante nella spinogenesi, nella plasticità sinaptica e nella stabilità sinaptica. La quantificazione dei F-actina puncta è quindi uno strumento utile per studiare l'integrità delle strutture sinaptiche. Questo protocollo descrive le procedure di quantificazione dei punti F-actina marcati con falloidina in colture neuronali corticali primarie a bassa densità.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Filamentosa proteine actina (F-actina) svolge un ruolo importante nella spinogenesis, plasticità sinaptica, e la stabilità sinaptica. Cambiamenti nelle strutture ricche dendritiche F-actina suggeriscono alterazioni nella integrità sinaptica e la connettività. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la coltura di ratto primario neuroni corticali, Colorazione falloidina per puncta F-actina, e successive tecniche di quantificazione. Innanzitutto, la corteccia frontale di embrioni di ratto E18 sono dissociato in coltura cellulare a bassa densità, allora i neuroni coltivati in vitro per almeno 12-14 giorni. Dopo il trattamento sperimentale, i neuroni corticali sono macchiati con AlexaFluor 488 falloidina (per etichettare il puncta F-actina dendritiche) e map2 (MAP2, per convalidare le cellule neuronali e l'integrità dendritiche). Infine, il software specializzato è utilizzato per analizzare e quantificare dendriti neuronali selezionati in modo casuale. F-actina strutture ricche sono identificati sul secondo ordine rami dendritiche (range 25-75 lunghezza &# 181; m) con continui immunofluorescenza MAP2. Il protocollo presentato qui sarà un metodo utile per studiare i cambiamenti nelle strutture sinapsi dendritiche successivi trattamenti sperimentali.
Introduzione
L'obiettivo primario di questo studio è quello di sviluppare un metodo affidabile di misura (stima) di integrità sinaptica della rete dendritica neuronale. Qui si descrive la quantificazione di puncta F-actina in primari di ratto neuroni in coltura utilizzando una combinazione di falloidina colorazione e rilevamento immunocitochimica (ICC) di dendriti con successiva analisi utilizzando software specializzati (NIS-Elements).
Phallotoxins etichettati hanno un'affinità simile per grandi e piccoli filamenti (F-actina), ma non si legano al monomero globulare actina (G-actina), a differenza di alcuni anticorpi actina 1. Legam....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i protocolli degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso degli animali presso la University of South Carolina (numero garanzia: A3049-01).
1. a bassa densità neuronale embrionale Cultura
- La preparazione per la cultura neuroni corticali primarie
- soluzioni:
- Preparare soluzione stock Poly-L-lisina sciogliendo 5 mg di poli-L-lisina in 10 ml di tampone borato.
- Preparare la soluzione di lavoro diluendo 1 ml Poly-L-lisina Archivio in 49 ml tampone borato.
- Preparare borato Buffer, pH 8.4 partendo da 395 ml di dH 2 O e quindi l....
- soluzioni:
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Nelle attuali metodi, in primo luogo abbiamo la cultura neuroni corticali di ratto a bassa densità in piatti con fondo di vetro da 35 mm, che ci permette di identificare i dendriti dei singoli neuroni. Nella figura 1, il contrasto di interferenza differenziale (DIC) immagini mostrano le variazioni morfologiche nello sviluppo fetale di ratto neuroni corticali nei giorni 4, 6, 10, 14, 21 e 27 in vitro. Si noti che la lunghezza e il numero di dendriti aumentano con.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questo protocollo, si descrive la coltura neuroni corticali di ratto a bassa densità in piatti con fondo di vetro da 35 mm, che ci permette di identificare dendriti dei singoli neuroni. Avanti, usiamo falloidina e MAP2 colorazione per rilevare i cambiamenti dendritiche. Poi, abbiamo utilizzato un software specializzato per quantificare i cambiamenti in puncta F-actina.
Per determinare le variazioni di puncta F-actina tutta la rete neuronale di un singolo neurone deve essere chiaramente vi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni NIH DA013137, DA031604 e HD043680. Un supporto parziale è stato fornito da una borsa di formazione NIH T32 in scienze biomediche-comportamentali.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatti con fondo in vetro da 35 mm n. 1,5 vetro di copertura | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Acido borico | Sigma | B0252 | |
| Borace | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucosio | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasale medio | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 integratore | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotico-Antimicotico soluzione | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Bicarbonato di sodio | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Forbici | World Precision Instruments | 500086 | |
| Forbici Iris | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forcipe | World Strumenti di precisione | 14097 | |
| Dumont #5 Pinze | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldeide | Sigma | P6148 | |
| Vetro di copertura | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Falloidina | Life Technologies | A12379 | |
| Siero di cavallo normale | Life Technologies | 26050-070 | |
| Pollo policlonale anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-capra coniugata anti-pollo IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Colorazione per cellule vive Reagente ReadyProbes Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| Pacchetto software NIS-Elements | Nikon Instruments Nikon Eclipse | ||
| TE2000-E microscopio fluorescente invertito controllato da computer | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μ m Filtro a membrana in nylon Nalgene | Fishersci | 151-4020 |
Riferimenti
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572(2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-a....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
