Qui vi presentiamo un romanzo di Ca 2+ approccio -imaging utilizzando un reporter bioluminescente. Questo approccio viene utilizzato un costrutto fuso GFP-equorina che si lega al Ca 2+ ed emette luce, eliminando la necessità di luce di eccitazione. Significativamente questo metodo permette di imaging lungo continuo, l'accesso alle strutture cerebrali profonde e alta risoluzione temporale.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Funzionale imaging in vivo è diventato un approccio efficace per studiare la funzione e la fisiologia delle cellule e strutture di interesse cerebrali. Recentemente è stato sviluppato un nuovo metodo di Ca 2+ -imaging utilizzando il reporter bioluminescenti GFP-aequorina (GA). Questa nuova tecnica si basa sulla fusione dei geni GFP e equorina, producendo una molecola in grado di legare il calcio e - con l'aggiunta del suo cofattore coelenterazine - emettono luce che può essere monitorato attraverso un collettore fotone. Linee transgeniche che trasportano il gene GFP-equorina sono stati generati per entrambi i topi e Drosophila. In Drosophila, il gene GFP-equorina è stato posto sotto il controllo del sistema di espressione binario GAL4 / UAS consentendo espressione mirata di imaging e nel cervello. Questo metodo è stato successivamente dimostrato di essere in grado di rilevare sia verso l'interno di Ca 2+ -transients e Ca 2+ -released dai depositi interni. Soprattutto consente una maggiore durata nel registrazione continua, imaging a maggiori profondità all'interno del cervello, e la registrazione ad alta risoluzione temporale (fino a 8,3 msec). Qui vi presentiamo il metodo di base per l'utilizzo di imaging bioluminescente per registrare e analizzare Ca 2+ -Attività in seno agli organi di funghi, una struttura centrale di apprendimento e la memoria nel cervello mosca.
Introduzione
Il patterning e la funzione di attività all'interno del cervello e le sue strutture discrete fondamentali sono stati a lungo una zona di intenso studio nel campo delle neuroscienze. Forse alcuni dei primi approcci di successo utilizzati per risolvere questo problema sono stati la misura fisiologica diretta della variazione dell'attività elettrica - metodi tuttavia alternativi che consentano l'imaging dal vivo di cambiamenti nelle concentrazioni di tensione, di pH o di calcio (come proxy per attività) hanno portato ulteriori funzionalità a lo studio dell'attività neuronale 1. Tecniche di imaging trasportare una vasta gamma di vantaggi, come ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione dei campioni
- Preparazione di soluzioni e impostare
- Mantenere tutte le linee di Drosophila melanogaster a 24 ° C sulla media cibo standard. Posteriore e tenerli a bassa densità nel flacone di generare formato standardizzato e peso di mosche.
- Aggiungere 10 femmine vergini con 10 maschi in un flaconcino, farli combaciare e trasferirli ogni 2 giorni per una nuova fiala. Poi 10 giorni più tardi, quando le mosche iniziano a Eclose, raccogliere linea ogni giorno. Tenere un registro preciso dell'età delle mosche e conservarli in buone condizioni.
- Al giorno 3, separare i maschi dalle femmine e tenere le femmi....
- Mantenere tutte le linee di Drosophila melanogaster a 24 ° C sulla media cibo standard. Posteriore e tenerli a bassa densità nel flacone di generare formato standardizzato e peso di mosche.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La fusione della GFP di equorina ci permette di visualizzare la nostra regione di interesse prima di imaging bioluminescente con eccitazione di GFP in modalità fluorescenti sul microscopio (Figura 3A, 4A, 6A, 6E). Uno dei modi più semplici per stimolare gli organi fungo è attraverso l'attivazione dei recettori nicotinici ionotropici. Sebbene acetilcolina è il ligando endogeno di questo recettore abbiamo trovato che la nicotina produce risposte più riproducibili nei corpi fungo. Questo è in parte per.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'approccio GFP-equorina basato bioluminescenti-recentemente sviluppato qui presentato permette in vivo registrazione funzionale Ca 2+ -Attività in neuroni diversi, così come se lo si desidera, in altri tipi di cellule, come le cellule stellate rene come riportato in Cabrero et al. 2013 5.
Modifiche, guasti, componenti aggiuntivi e passaggi critici
Drosophila Zootecnica
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo in debito con E. Karplus, di Sciences Wares, USA, per il suo prezioso e utile aiuto e consigli. Ringraziamo E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier e J. Stinnakre per il loro contributo allo sviluppo e al miglioramento di questa tecnica. Ringraziamo anche B. Pfeiffer e G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, per la linea pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Chateaubriand Fellowship, Ambasciata di Francia, Washington, USA ad A. Lark, dalla National Science Foundation (IOS 1352882) a T. Kitamoto, e dalle ANR francesi (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, e FlyBrainImaging, 2011), dal Conseil ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| saccarosio | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotina | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato |
| benzil-celeterazina | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazina h | http://www.prolume.com/ |
| colla dentale | 3M ESPE™ | 46954 | Colla |
| siliconica | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Nastro rapido |
| 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape | |
| puntali per pipette | Corning Incorporated | 4868 | 100-1.000 &; l Pipetta Univesal Camera |
| e supporto per puntali (tavolino) | |||
| di incubazione | fatte a mano | ||
| (n. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Pinze per micro-dissezione |
| pinze curve | Sigma-Aldrich | F4142 | Pinze per micro-dissezione |
| applicatore di colla | fatto a mano | ||
| coltello | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Profondità 15° pugnalata |
| Telecamera EM-CCD | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (raffreddato a -80 ° C) |
| Microscopio | Nikon | Eclipse-E800 | |
| obiettivo a immersione | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| microscopio di dissezione con fluorescenza | Leica MZ Fl III | leica cannocchiale di dissezione e lampada fluorescente | |
| a tenuta di scatola oscura | Science Wares | Costruito su misura da Science Wares | |
| pompa peristaltica... | Tubi Gilson | Minipuls 2 | |
| Fisher Scientific | dipende dallo spessore | Tygon R3603, sistema di perfusione St-Gobain | |
| Warner | 64-0135 ( VC-66CS) | Sistema di controllo della valvola di perfusione, completo, con valvole a manicotto, | |
| regolatori di perfusione | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| esploratore di misurazione e automazione | Scienze Merci & National Instruments | N/A | http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| imager di fotoni | Articoli scientifici & National Instruments | N/A | http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| visualizzatore di fotoni | Science Wares & Istituzioni nazionali | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | accesso aperto | Software N/A | http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Rif. 1 | N/A | Nessuna azione {attualmente} disponibile pubblicamente |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima e Misenboeck, Ref. 11 | N/A | Nessuna azione {attualmente} disponibile pubblicamente |
| OK107 | Centro azioni Bloomington | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
Riferimenti
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
