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Articolo metodologico

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

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⸱

DOI:

10.3791/53705

⸱

8 gennaio 2016

 ,  , 
1Equipe: Imagerie Cérébrale Fonctionnelle et Comportements (ICFC), Institut des Neurosciences Paris-Saclay (Nero-PSI), UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Graduate College, University of Iowa, 3Department of Anesthesia, Carver College of Medicine, University of Iowa

In questo articolo

Sommario

Qui vi presentiamo un romanzo di Ca 2+ approccio -imaging utilizzando un reporter bioluminescente. Questo approccio viene utilizzato un costrutto fuso GFP-equorina che si lega al Ca 2+ ed emette luce, eliminando la necessità di luce di eccitazione. Significativamente questo metodo permette di imaging lungo continuo, l'accesso alle strutture cerebrali profonde e alta risoluzione temporale.

Abstract

Funzionale imaging in vivo è diventato un approccio efficace per studiare la funzione e la fisiologia delle cellule e strutture di interesse cerebrali. Recentemente è stato sviluppato un nuovo metodo di Ca 2+ -imaging utilizzando il reporter bioluminescenti GFP-aequorina (GA). Questa nuova tecnica si basa sulla fusione dei geni GFP e equorina, producendo una molecola in grado di legare il calcio e - con l'aggiunta del suo cofattore coelenterazine - emettono luce che può essere monitorato attraverso un collettore fotone. Linee transgeniche che trasportano il gene GFP-equorina sono stati generati per entrambi i topi e Drosophila. In Drosophila, il gene GFP-equorina è stato posto sotto il controllo del sistema di espressione binario GAL4 / UAS consentendo espressione mirata di imaging e nel cervello. Questo metodo è stato successivamente dimostrato di essere in grado di rilevare sia verso l'interno di Ca 2+ -transients e Ca 2+ -released dai depositi interni. Soprattutto consente una maggiore durata nel registrazione continua, imaging a maggiori profondità all'interno del cervello, e la registrazione ad alta risoluzione temporale (fino a 8,3 msec). Qui vi presentiamo il metodo di base per l'utilizzo di imaging bioluminescente per registrare e analizzare Ca 2+ -Attività in seno agli organi di funghi, una struttura centrale di apprendimento e la memoria nel cervello mosca.

Introduzione

Il patterning e la funzione di attività all'interno del cervello e le sue strutture discrete fondamentali sono stati a lungo una zona di intenso studio nel campo delle neuroscienze. Forse alcuni dei primi approcci di successo utilizzati per risolvere questo problema sono stati la misura fisiologica diretta della variazione dell'attività elettrica - metodi tuttavia alternativi che consentano l'imaging dal vivo di cambiamenti nelle concentrazioni di tensione, di pH o di calcio (come proxy per attività) hanno portato ulteriori funzionalità a lo studio dell'attività neuronale 1. Tecniche di imaging trasportare una vasta gamma di vantaggi, come riduzione invasività e la possibilità di monitorare l'attività all'interno delle strutture intere del cervello. Inoltre, in animali con la genetica trattabili compreso moscerino della frutta Drosophila, sviluppo di indicatori di calcio geneticamente codificati, come Cameleon, GCaMPs e altri 1 hanno permesso ai ricercatori di monitorare singoli neuroni, popolazioni neuronali e tutto il cervellostrutture. Mentre altri metodi di imaging di calcio fluorescenti tradizionali utilizzando GCaMPs (GFP fusa al calmodulina) o FRET (PCP e YFP fuso con calmodulina) hanno dimostrato di essere le tecniche utili che forniscono una buona risoluzione spaziale e temporale, il processo alla base dell'eccitazione luce genera alcune limitazioni sulla sua sperimentale applicazioni. A causa della natura della luce di eccitazione, autofluorescenza, fotometabolismo e fototossicità vengono inevitabilmente prodotte, che limita di conseguenza la profondità delle strutture che possono essere esposte, la durata della registrazione e la continuità tempo reale della registrazione. In altre parole, registrazioni devono spesso essere eseguite in modo intermittente per evitare questi effetti collaterali indesiderati.

A causa di questi problemi, sono stati sviluppati metodi alternativi aggiuntivi calcium imaging. Uno dei metodi più promettenti è l'imaging bioluminescente, che si basa sulla luce prodotta attraverso una reazione enzimatica dopo il legame del calcio. Bioluminescent di imaging non necessita di eccitazione luce e di conseguenza non sperimentare le stesse difficoltà di imaging di calcio tradizionale. Il reporter bioluminescente equorina - isolato da Aequorea victoria, la stessa Medusa da cui GFP è stato isolated- anche lega il calcio attraverso le sue tre strutture a mano EF e subisce un cambiamento conformazionale, che porta alla ossidazione del suo coelenterazine cofattore e il rilascio di luce blu (λ = 469 nm) 2,3. Equorina ha una bassa affinità per il calcio (K d = 10 mM) che lo rende ideale per il monitoraggio transienti di calcio perché produce poco rumore di fondo e non interferisce con il sistema tampone calcio intracellulare 4. Anche se equorina è stato precedentemente utilizzato per monitorare il processo di induzione neurale nell'uovo Xenopus 5 la luce prodotta è troppo debole da utilizzare per l'imaging in tempo reale di attività neuronale. Nel tentativo di affrontare questa sfida, Philippe Br &# 251; affitto e colleghi presso l'Istituto Pasteur ha creato un costrutto genetico fusione GFP e equorina geni, imitando lo stato nativo all'interno del meduse 4. Questo prodotto del gene di fusione lega nuovo calcio attraverso le tre strutture mano EF di equorina, che subisce un cambiamento conformazionale che porta alla ossidazione del coelenterazine, che trasferisce l'energia non radiativamente alla GFP. Questo trasferimento di energia provoca il rilascio di luce verde (λ = 509 nm) da GFP, invece di luce blu da equorina. La fusione di GFP e equorina conferisce anche una maggiore stabilità proteica aiutare la proteina di fusione producono luce da 19 a 65 volte più luminosa aequorina solo 4. Usando un approccio bioluminescente nel cervello espande l'attuale applicazione sperimentale dell'imaging calcio sia in termini di durata di registrazione continua e il numero di strutture all'interno del cervello che può essere registrato. Ampiamente nel contesto di lavoro precedente significa che sia globale e una maggiorevarietà di regionalizzato "attività" del cervello può essere monitorato (attraverso il proxy di transienti di calcio). Ancora più importante attività può essere monitorato per più, in un tempo reale e base continua, che si presta facilmente al perseguimento di una completa comprensione della funzione basale nel cervello.

Negli ultimi anni, il nostro laboratorio e altri hanno sviluppato mosche transgeniche esprimenti GFP-equorina sotto il controllo del sistema di espressione binario (GAL4 / UAS-GFP-equorina) 5,6. Abbiamo usato GFP-equorina bioluminescenza all'attività disco prodotto da stimoli naturali come profumo 7,8, nonché studiato i componenti cellulari modulanti Ca 2+ -Attività nei corpi fungo seguenti acetilcolina recettore stimolazione per applicazione diretta nicotinico 9. Inoltre, abbiamo utilizzato anche GFP-aequorina ad affrontare una serie di questioni sperimentali che non hanno potuto essere affrontate in precedenza, come a lungo terminel'imaging di transienti di calcio spontanee e visualizzazione delle strutture cerebrali profonde 10. Più di recente, abbiamo utilizzato il sistema / UAS GAL4 per esprimere il recettore dei mammiferi ATP P2X 2 11 un canale cationico, nei neuroni di proiezione (PN) e utilizzato il sistema LexA di esprimere GFP-aequorina nei corpi di funghi (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (una per gentile concessione di B. Pfeiffer, Janelia Fattoria, Stati Uniti d'America). Questo ha permesso di attivare l'PN per applicazione di ATP, che a sua volta attiva i corpi fungo (un bersaglio a valle del PN), simulando condizioni più naturali, come la risposta ad uno stimolo odore. Nel complesso questa tecnica che unisce P2X 2 e GFP-aequorina espande le possibilità sperimentali. In linea di massima, offre la possibilità di capire meglio i modelli di attività nel cervello, avviando nuovi studi su come i diversi stimoli e perturbazioni possono alterare il patterning basale di attività.

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Protocollo

1. Preparazione dei campioni

  1. Preparazione di soluzioni e impostare
    1. Mantenere tutte le linee di Drosophila melanogaster a 24 ° C sulla media cibo standard. Posteriore e tenerli a bassa densità nel flacone di generare formato standardizzato e peso di mosche.
      1. Aggiungere 10 femmine vergini con 10 maschi in un flaconcino, farli combaciare e trasferirli ogni 2 giorni per una nuova fiala. Poi 10 giorni più tardi, quando le mosche iniziano a Eclose, raccogliere linea ogni giorno. Tenere un registro preciso dell'età delle mosche e conservarli in buone condizioni.
      2. Al giorno 3, separare i maschi dalle femmine e tenere le femmine 20 mosche per flaconcino. Registrare le mosche a 4 o 5 giorni di età.
    2. Preparare la soluzione di Ringer alle seguenti concentrazioni: 130 mM NaCl, KCl 5 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM CaCl 2 saccarosio, 5 mM HEPES e 36 mM e regolare il pH della soluzione a 7,3 con precisione. Preparare le soluzioni di perfusione di 25 μ; M nicotina e KCl 100 mM in soluzione di Ringer.
    3. Preparare 1.000 puntale microlitri: con una punta forma lama di rasoio per un taglio (circa 35 ° rispetto alla fine della punta) e rimuovere la base in eccesso oltre 1 ½ centimetri dalla punta.
    4. Preparare scatola per la conservazione (23 cm x 17 cm x 8.5 cm) di campione durante l'incubazione. Inserire due spugne (12 cm x 8 cm x 3 cm) saturo di acqua in fondo [per prevenire l'essiccamento del campione] sotto una piccola apparecchiatura rastrelliera per posizionare campioni come loro preparazione è completata.
    5. Preparare mosche campioni in modo che contengano almeno 1 copia del UAS-GFP-equorina e una copia di una linea GAL4 a guidare l'espressione di GFP-aequorina. Linea OK107 Gal4 (un'espressione linea guida soprattutto nei corpi fungo) è attraversata con UAS-GFP-aequorina in questa preparazione.
      NOTA: L'interno della scatola deve essere impermeabile e l'esterno deve bloccare luce di entrare scatola impedire il degrado del coelenterazine durante l'incubazione.
  2. Preparazione dei campioni
    1. Ice anestetizzare Drosophila trasferendo in un flacone di vetro e tenere in ghiaccio per 2 minuti prima di essere trasferiti al piatto freddo Petri per il posizionamento nella punta della pipetta. Preparare i puntali delle pipette su carta da filtro leggermente inumidito in 100 ml di capsula di Petri sul ghiaccio sotto il microscopio dissezione.
    2. Delicatamente con una pinza posto volare all'interno del puntale.
    3. Utilizzando un pennello spingere delicatamente e allineare fly tale che la testa è completamente oltre il bordo della punta e la regione dorsale è parzialmente esposta dalla sezione rimosso durante punta sagomatura (Figura 2B).
    4. Combinare un piccolo (circa 3-4 mL) porzioni dei due componenti della colla dentale. Applicare la colla con cautela intorno alla parte anteriore e posteriore testa e il collo verso il basso e intorno al bordo punta della pipetta - evitando la parte superiore della testa. Lasciate asciugare la colla per 2 minuti.
    5. Punta pipetta con la mosca incollato attraverso il foro nella camera di registrazione (Figura 2D) e Gently premere per fissarlo in posizione.
    6. Combinare i due componenti della colla di silicio (circa 3-4 ml). Applicare la colla sul lato piatto della camera lungo il bordo dove la camera e pipetta punta si incontrano per prevenire fuoriuscita di soluzione del Ringer. Lasciate asciugare la colla per 2 minuti.
  3. Dissezione
    1. Applicare nastro sopra il canale di perfusione, lato corto e si estende verso la parte posteriore della camera.
    2. Posizionare camera con la mosca sul blocco dissezione al microscopio accendere lampada fluorescente. Dispensare 1 ml di soluzione di Ringer nella camera.
    3. Utilizzare bene bisturi per rimuovere la cuticola. Effettuare incisioni parallele dalla parte posteriore della testa a regione antenne. Poi tagliare lungo il bordo dell'occhio poi fare un'incisione perpendicolare sopra antenna collegare le incisioni precedenti. Effettuare una incisione finale parallela a quella nella parte posteriore della testa. Utilizzare le pinze taglienti multa per rimuovere la cuticola (Figura 2C).
    4. Utilizzare pinza sottile affilati per afferrare con delicatezza und sgombrare esposto tessuto respiratorio fino al cervello e [fluorescenti] corpo fungo è chiaramente visualizzati.
    5. Utilizzare pinze ultra-sharp di cogliere con attenzione e un pizzico di tessuto che copre neuroepiteliale cervello per consentire permeazione del coelenterazine.
      NOTA: In alternativa papaina può essere utilizzato per l'permeabilize neuroepiteli 9.
    6. Utilizzando una pipetta, lavare due volte con la soluzione di Ringer per rimuovere eventuali residui da dissezione e il campione posto nella scatola buia.
    7. Dispensare 1 ml di soluzione di Ringer contenente 5 mM benzilico-coelenterazine nella camera. Chiudere la finestra e lasciare incubazione con coelenterazine a temperatura ambiente per un minimo di 2 ore.

2. Imaging

  1. Impostare
    1. Avviare il sistema di registrazione: accendere il microscopio, computer, macchina fotografica e sistema di drenaggio e la sala impostare controlli ambientali di 25 ° C.
    2. Aprire Misurazione e programma Automation Explorer sul computer. Clicca su “, Dispositivi e Interfaces ", quindi fare doppio clic su" NI Motion Devices "e, infine, fare clic destro su" PCI-7334 "e selezionare" inizializzare dispositivo ".
    3. Aprire Photon Imager. Crea nuova cartella e il nome del primo file di registrazione. Fotocamera deve raggiungere -80 ° C prima che il sistema funzionerà.
    4. Impostare sistema di perfusione - aggiungere KCl, nicotina, e la soluzione di Ringer ai serbatoi e regolare in modo che i ogni soluzione scariche a 2 ml / min. Lavare con soluzione di Ringer prima di iniziare esperimento.
  2. Preparare campione
    1. Luogo di imaging montaggio piatto blocco sul monte al microscopio a ingrandimento 5X e inserire il tubo perfusione in canale attraverso la puntura.
    2. Impostare microscopio per la modalità a fluorescenza poi il centro e portare corpi di funghi (MB) a fuoco. Regolare a 20X e ri-center e messa a fuoco.
    3. Apparecchio drenaggio posizione sopra piscina drenaggio, regolare l'altezza dello shunt di drenaggio in modo che la punta è appena Above piscina, ed eseguire la soluzione di Ringer per 30 secondi al fine di garantire un adeguato drenaggio.
    4. Abbassare scudo per sigillare apparecchio dalla luce. Utilizzando il sistema automatizzato di fotoni imager effettuare regolare con precisione la messa a fuoco e prendere una immagine di riferimento fluorescente dei MB.
  3. Registrazione
    1. Regolare la velocità dei fotoni a velocità di registrazione desiderata (da 50 msec fino a 1 sec). Selezionare la modalità di fotoni e otturatore aperto. Record genotipo, sesso, età e numero del campione nelle voci di registro. Regolare la posizione di scatole ROI oltre calice e corpi cellulari (CCB) e lobi mediali cliccando sulle caselle ROI e trascinando mentre si tiene il controllo.
    2. Registra base per circa 5 a 10 min (come desiderato).
    3. Applicare nicotina per 1 min. Nota avviare / arrestare in log. Lavare con soluzione di Ringer per 5 min.
    4. Attendere 5 minuti per il recupero e la preparazione KCl voce di registro e il timer.
    5. Applicare KCl per 1 min. Nota avviare / arrestare in log. Lavare con soluzione di Ringer per 1 minuto.
    6. Interruttorealla modalità fluorescente, prendere l'immagine fluorescente finale, e spegnere la soluzione di Ringer.
    7. Premere il tasto "Stop". Finestra di dialogo chiederà di spegnere il sistema. Selezionare "No" per continuare la registrazione.
    8. Scudo aperto, sistema di drenaggio mossa, passare obiettivo obiettivo a 5X, rimuovere il tubo perfusione. Rimuovere campione / piatto registrazione da palcoscenico, pulire lente 20X con il risciacquo e pulire la lente due volte con acqua.
    9. Premere il tasto play bianca nella parte superiore della finestra del programma di avviare la registrazione successiva.

3. Analisi e creazione di video

  1. Estrarre i valori fotone
    1. Aprire il programma di analisi del fotone (ad esempio, Photon Viewer) e aprire il file foglio di calcolo di primo campione.
    2. Selezionare la scheda di controllo del display. Selezionare la ROI facendo clic sulla regione, mentre detiene il controllo. Regolare le dimensioni, l'orientamento e la forma delle regioni di interesse per comprendere GFP CCB illuminato e lobi mediali.
    3. Aggiungere un'aggiuntaal ROI facendo clic su "Definisci ROI" e cliccando e trascinando sullo schermo per creare il nuovo ROI.
    4. Selezionare la scheda "Movie" per riprodurre video fotone. Regolare "width sec" e "passi SEC", se lo desideri. Regolare il posizionamento del ROI, se necessario.
    5. Seleziona scatti rappresentativi dello schermo di fluorescenza GFP, la risposta nicotina e risposta KCl. Screenshot delle colture e immagine di pasta in una diapositiva della presentazione per una successiva analisi e comparazione.
    6. Regolare sia il "width sec" e "sec step" per la velocità di registrazione in secondi. Selezionare la lunghezza di analisi spostando marcatori grigio sul pannello superiore per regione staffa prima di stimolo iniziazione e solo dopo la fine di risposta.
    7. Selezionare "Sospendere viste durante la riproduzione di" premere "<< REW" e premere "PLAY>". Selezionare la scheda "Frequenza di conteggio Grafico" e regolare le unità come desiderato e colori di linea per abbinare il colore del ROI.
    8. Quando termine dell'analisi, Premere il tasto "Export Count Data Rate". Selezionare le schermate del combinato registrazioni CCB e regione del lobo mediale di interesse da ogni lato. Screenshot delle colture e immagine di pasta in una diapositiva con immagini di risposta. Questa diapositiva sarà poi utilizzata in ultima analisi.
  2. Esempio Analisi: un metodo per l'analisi dei dati di fotoni estratti dettagliati
    1. Aprire i file di foglio di calcolo nella cartella "Frequenza di conteggio esportazioni".
    2. Riformattare le celle della prima colonna etichettata volta per visualizzare l'ora in ora e minuti.
    3. Riferimento diapositiva corrispondente per il campione. Rimuovere tutti i valori tranne le colonne per il tempo e le due rappresentative ROI.
    4. Determinare nicotina ora di inizio stimolazione - disponibile nel file di voce di registro nella principale cartella- rimuovere dati aggiuntivi prima di avviare o valore di luce.
    5. Trova valore più alto / di picco sia per il BCC e del lobo mediale e segno / luce.
    6. Determinare inizio di risposta e di fine per entrambiCCB e del lobo mediale con la creazione di una stima utilizzando punto di tempo da corrispondente graficamente risposta sul vetrino e selezionare il valore effettivo cambiamento di valori in prossimità di questi punti. Evidenziare la regione tra questi punti sia nel CCB e lobi mediali. In alternativa, utilizzare una macro 9.
    7. Unire tutti i campioni di un gruppo sperimentale su un nuovo foglio di calcolo.
    8. Allineate sul picco determinando il valore di riga è per ogni valore di picco BCC. Sottrarre i valori più bassi dal valore più alto riga per determinare il valore approssimativo riga in cui che i dati di esempio devono essere ricopiati a. Verificare che tutti i valori di picco sono allineati.
    9. Copiare il foglio due volte ed eliminare sia le colonne lobo mediale o le colonne CCB la creazione di pagine di solo BCC o valori lobo mediale.
    10. Rimuovere i dati dopo le tutte le risposte CCB sono finiti. Crea quattro file etichettati Fotoni totali, Risposta lunghezza (durata), picco di ampiezza e risposta latenza. Copia e incolla questo nuovo sotto gli originali.
    11. Utilizzare la funzione SOMMA per determinare fotoni totali durante risposta. Utilizzare la funzione COUNT per determinare la lunghezza della risposta. Copia e collegare più alto cella valore per determinare il valore di ampiezza di picco. Utilizzare la funzione COUNT - selezionare dall'inizio della perfusione di nicotina per l'inizio della risposta - determinare Response latenza.
    12. I valori di copia utilizzando la funzione di collegamento e si moltiplicano (tutti tranne ampiezza di picco) registrando velocità in pochi secondi.
    13. Bar / box grafici possono essere creati per i parametri calcolati, come Fotoni totali, picco di ampiezza e la risposta intera, se lo si desidera (es .: figura 5B, C, D).
    14. Nella colonna dopo la prima risposta fotone dati, la media dei punti di dati grezzi per ogni punto di tempo usando la funzione media. Se follow desiderata con una colonna determinazione dell'errore standard della media (SEM), per ciascuno dei valori medi di fotoni in un punto temporale.
    15. Utilizzare la colonna media per costruire un profilo di risposta medioe [Grafico] per il gruppo campione di CCB. Per fare ciò selezionare la colonna specificando il momento in cui i valori dell'asse x e la colonna dei valori medi di fotoni come l'asse Y e infine selezionare lo strumento di creare un grafico a dispersione.
    16. Ripetere questa procedura di analisi con i dati provenienti dai lobi mediali.
  3. Creazione di immagini per il Video
    1. Aprire spettatore fotone.
    2. Selezionare la scheda di controllo del display. Clicca sul ROI mentre si tiene di controllo per selezionare, rimuovere e / o ridurre al minimo.
    3. Modifica "width sec" (tempo di accumulazione) come desiderato per determinare il contenuto di ciascun frame.
    4. Modifica "sec passo" per definire la sovrapposizione di ogni fotogramma.
    5. Seleziona "vista esportazioni durante la riproduzione di" premere "<< REW" poi "PLAY>". Le immagini per il video verranno esportati nella cartella "vista esportazioni" come una serie di file .png.
  4. Utilizzando Virtual Dub per rendere il video: un metodo per il video creation dettagliata
    1. Creare una nuova cartella denominata "resultats" nella cartella vista esportazioni contenente le immagini.
    2. Portate di script (renommer.VBS) nella cartella di immagini.
    3. Fare doppio clic su renommer.VBS per l'esecuzione.
    4. Le immagini verranno automaticamente rinominati numericamente e copiati nella cartella "resultats".
    5. Aperto VirtualDub.exe.
    6. Selezionare il file video aperto - selezionare prima immagine (immagini successive vengono caricati automaticamente).
    7. Selezionare il video - selezionare il frame rate regolare, se lo desideri.
    8. Selezionare il video - selezionare compressione selezionare Cinepak Codec per il raggio.
    9. Nel file di selezionare Salva come AVI il video verrà creato automaticamente.

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Risultati

La fusione della GFP di equorina ci permette di visualizzare la nostra regione di interesse prima di imaging bioluminescente con eccitazione di GFP in modalità fluorescenti sul microscopio (Figura 3A, 4A, 6A, 6E). Uno dei modi più semplici per stimolare gli organi fungo è attraverso l'attivazione dei recettori nicotinici ionotropici. Sebbene acetilcolina è il ligando endogeno di questo recettore abbiamo trovato che la nicotina produce risposte più riproducibili nei corpi fungo. Questo è in parte per...

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Discussione

L'approccio GFP-equorina basato bioluminescenti-recentemente sviluppato qui presentato permette in vivo registrazione funzionale Ca 2+ -Attività in neuroni diversi, così come se lo si desidera, in altri tipi di cellule, come le cellule stellate rene come riportato in Cabrero et al. 2013 5.

Modifiche, guasti, componenti aggiuntivi e passaggi critici

Drosophila Zootecnica

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo in debito con E. Karplus, di Sciences Wares, USA, per il suo prezioso e utile aiuto e consigli. Ringraziamo E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier e J. Stinnakre per il loro contributo allo sviluppo e al miglioramento di questa tecnica. Ringraziamo anche B. Pfeiffer e G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, per la linea pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Chateaubriand Fellowship, Ambasciata di Francia, Washington, USA ad A. Lark, dalla National Science Foundation (IOS 1352882) a T. Kitamoto, e dalle ANR francesi (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, e FlyBrainImaging, 2011), dal Conseil régional ile-de France (NeRF e DIM), dall'IFR-144, dal Physique-Chimie-Biologie Interface Program del CNRS (2009), e dal CNRS, Francia a JR Martin.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NaClSigma-AldrichS3014
CaCl2Merck1023911000
HEPESSigma-Aldrich7365-45-9
KClprolabo26 764.298normapur
MgCl2prolabo25 108.295normapur
saccarosioSigma-AldrichS0389
NicotinaSigma-AldrichN3876
ATPSigma-AldrichA2383Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato
benzil-celeterazinaProlume, nanolight Cat #301 Coelenterazina hhttp://www.prolume.com/
colla dentale3M ESPE™46954Colla
siliconica3M ESPE™36958Express 2 Regular Body Nastro rapido
3M Scotch122s3M Scotch Magic Tape
puntali per pipetteCorning Incorporated4868100-1.000 &; l Pipetta Univesal Camera
e supporto per puntali (tavolino)
di incubazionefatte a mano
(n. 5)Fine Science Tools11252-00Pinze per micro-dissezione
pinze curveSigma-AldrichF4142Pinze per micro-dissezione
applicatore di colla fatto a mano 
coltelloFine Science Tools10316-145 mm Profondità 15° pugnalata
Telecamera EM-CCD AndorDU-897E-CS0-#BViXon (raffreddato a -80 ° C)
MicroscopioNikonEclipse-E800
obiettivo a immersioneNikon20X Fluor .5w
microscopio di dissezione con fluorescenzaLeica MZ Fl IIIleica cannocchiale di dissezione e lampada fluorescente
a tenuta di scatola oscuraScience WaresCostruito su misura da Science Wares
pompa peristaltica...Tubi GilsonMinipuls 2
Fisher Scientificdipende dallo spessoreTygon R3603, sistema di perfusione St-Gobain
Warner64-0135 ( VC-66CS)Sistema di controllo della valvola di perfusione, completo, con valvole a manicotto,
regolatori di perfusioneLeventon201108Dosi-flow 3
esploratore di misurazione e automazioneScienze Merci & National InstrumentsN/Ahttp://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
imager di fotoni Articoli scientifici & National InstrumentsN/Ahttp://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
visualizzatore di fotoniScience Wares & Istituzioni nazionaliN/Asoftware http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
ExcelMicrosoftN/Asoftware https://www.microsoft.com
virtual dubaccesso aperto Software N/Ahttp://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2Martin et al., 2007, Rif. 1 N/ANessuna azione {attualmente} disponibile pubblicamente 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP   B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.(STOCK #1117340)pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2Lima e Misenboeck, Ref. 11 N/ANessuna azione {attualmente} disponibile pubblicamente 
OK107Centro azioni Bloomington854http://flystocks.bio.indiana.edu/
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Riferimenti

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  3. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
  4. Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
  5. Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943(2013).
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