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Articolo metodologico

Stimolazione diretta correnti e multi-elettrodo Array registrazione di sequestro simile attività nei topi cervello fetta di preparazione

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⸱

DOI:

10.3791/53709

⸱

7 giugno 2016

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 2Department of Anesthesiology, University of Alabama at Birmingham

In questo articolo

Sommario

Gli studi hanno dimostrato che la stimolazione transcranica catodica a corrente continua può produrre effetti soppressivi sulle convulsioni resistenti ai farmaci. In questo studio, è stata ideata una configurazione sperimentale in vitro in cui la stimolazione a corrente continua e la registrazione di array multielettrodi dell'attività convulsiva sono state valutate nella preparazione di fette di cervello di topi. Sono stati valutati i parametri di stimolazione a corrente continua.

Abstract

Catodica stimolazione in corrente continua transcranica (tDCS) induce effetti soppressivi sui sequestri di farmaco-resistenti. Per eseguire azioni efficaci, i parametri di stimolazione (ad esempio, l'orientamento, l'intensità del campo, e la durata stimolazione) devono essere esaminate in preparati fetta topi cerebrali. Test e disponendo l'orientamento dell'elettrodo rispetto alla posizione della fetta topi cervello sono fattibili. L'attuale metodo consente di mantenere il percorso thalamocingulate per valutare l'effetto di DCS sulle attività sequestro come corteccia cingolata anteriore. I risultati delle registrazioni matrice multicanale indicato che catodica DCS diminuito significativamente l'ampiezza delle risposte stimolazione evocati e durata di 4-aminopiridina e attività convulsiva-like bicucullina-indotta. Questo studio ha anche scoperto che le applicazioni DCS catodica a 15 min causato depressione a lungo termine nel percorso thalamocingulate. Il presente studio indaga gli effetti della DCS su thalamocingulate plasticità sinaptica e attività di sequestro simile acuti. L'attuale procedura in grado di testare i parametri ottimali di stimolazione compreso l'orientamento, l'intensità del campo, e la durata di stimolazione in vitro modello di topo in. Inoltre, il metodo può valutare gli effetti di DCS sulle attività sequestro simile corticali sia a livello cellulare e di rete.

Introduzione

L'epilessia è un disturbo neurologico comune. Il trenta per cento dei pazienti con epilessia soffre di convulsioni resistenti ai farmaci1. La stimolazione transcranica a corrente continua (tDCS) fornisce un approccio non invasivo per controllare o alterare le attività di rete in grandi aree cerebrali, come le convulsioni. Studi clinici hanno dimostrato che la tDCS tratta efficacemente le crisi intrattabili2 e può produrre effetti soppressivi sia a breve che a lungo termine sulle crisi3-5. Tuttavia, il meccanismo terapeutico delle azioni della tDCS non è ancora chiaro. Il modello di fetta cerebrale presentato è un metodo in vitro per studiare come il meccanismo terapeutico delle azioni della tDCS alteri i sintomi delle attività cerebrali simili alle convulsioni. Di conseguenza, per ottenere i suoi effetti ottimali, è necessario testare parametri di stimolazione specifici, tra cui l'orientamento, l'intensità del campo e la durata della stimolazione, in un modello sperimentale. Studi precedenti hanno dimostrato che l'orientamento del campo elettrico è importante per ottenere effetti terapeutici6. Pertanto, è possibile testare e organizzare l'orientamento degli elettrodi rispetto alla posizione della fetta di cervello testata.

L'epilessia del lobo frontale e le convulsioni della corteccia cingolata anteriore (ACC) sono spesso resistenti ai farmaci7,8. Alcuni studi hanno riportato l'applicazione della tDCS nella corteccia cingolata9-11. La tDCS ha dimostrato di influenzare la vigilanza, il processo decisionale e l'emozione attraverso l'alterazione delle attività dell'ACC e può modulare l'eccitabilità neuronale e l'attività convulsiva in questa regione del cervello12. Pertanto, gli effetti soppressivi della tDCS sulle crisi di ACC potrebbero essere utili per il trattamento clinico e la valutazione di trattamenti alternativi.

Il presente protocollo descrive la preparazione di un elettrodo nella camera di registrazione per la MDD di una fetta di cervello e il suo effetto sulla registrazione dell'attività simile a una crisi epilettica con un array multielettrodo (MEA).

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Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale utilizzo, Academia Sinica, Taipei, Taiwan.

1. Preparazione Soluzione sperimentale ed attrezzature per multielettrodico Array registrazione

  1. Preparare artificiale cerebrale fluido spinale (aCSF; 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 25 mM NaHCO 3, e 10 mM di glucosio, bollito con 95% O 2 e 5% di CO 2).
  2. Utilizzare due tipi di sonde MEA: 6 x 10 planare MEA e 8 x 8 MEA. La prima sonda copre la regione che comprende la corteccia, striato e talamo. Quest'ultima sonda copre solo la regione corticale.
  3. Utilizzare un amplificatore 60 canali con un filtro passa-banda impostata tra 0,1 Hz e 3 kHz a 1.200 amplificazione. Acquisire dati a una frequenza di campionamento a 10 kHz.
  4. Inserire due fili d'argento AgCl rivestite all'interno della camera di MEA per DCS. Utilizzare il AgClfili d'argento Rivestiti di produrre campi elettrici generati da uno stimolatore isolato.
  5. Posizionare un elettrodo di tungsteno (diametro, 127 m; lunghezza, 7,62 centimetri; 8 ° AC punta conica, resistenza, 5 MW) per la stimolazione talamica e posizionare l'elettrodo di riferimento nella camera di MEA. Fornire corrente dell'elettrodo di tungsteno utilizzando uno stimolatore isolato che è controllato da un generatore di impulsi.

2. Cervello Fetta Preparazione

  1. Utilizzare maschi C57BL / 6J, 4-8 settimane di vita. Casa gli animali in una stanza con aria condizionata (21-23 ° C; 50% di umidità; 12 ore di luce / 12 h / buio ciclo, si accende alle 8:00 AM) con libero accesso a cibo e acqua.
  2. Prendete una aliquota di 250 ml di aCSF che è stata preparata al punto 1.1, e metterlo in un bicchiere contenente ghiaccio. Allo stesso tempo, la fornitura di gas continuo che è composto di 95% O 2 e 5% CO 2.
  3. Chirurgia
    1. Anestetizzare l'animale con 4% isoflurano in un bicchierebox per circa 3 minuti. Una volta che l'animale raggiunge una profondità chirurgica di anestesia (indicato dalla mancanza di una risposta a pinch tep), posizionarlo su un vassoio poco profondo che viene riempito con ghiaccio tritato, e rimuovere la testa con le forbici.
    2. Esporre il cranio, e tagliare il muscolo restante. Successivamente, utilizzando rongeurs, staccarsi la superficie dorsale del cranio dal cervello. Tagliare via i lati del cranio con Rongeurs. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con una soluzione di etanolo al 75%.
    3. Utilizzando una spatola, tagliare i bulbi olfattivi e connessioni nervose lungo la superficie ventrale del cervello, e rimuovere il cervello. Dopo la decapitazione, trasferire rapidamente al cervello di un bicchiere pieno di aCSF ossigenato ghiacciata.
  4. Preparazione di mediale Talamo (MT) -ACC Cervello Slice
    Nota: Preparare le fette che contengono il percorso dal MT ACC 13.
    1. Hand-tagliare il blocco cervello con due tagli sagittali 2,0 mm lateralmente alla linea mediana di ciascun emisferoper visualizzare l'anatomia subcorticale. Poi fare due tagli angolati. Effettuare la prima traversa taglio parallelo al tratto di fibra visibile nello striato.
    2. Rendere il secondo cross-cut dalla connessione tra il cervelletto e corteccia visiva al punto medio tra commessura anteriore e tratto ottico che sono ventrale e parallela al percorso thalamocingulate.
    3. Fissare il blocco del cervello ad una piastra angolare (~ 120 °) con adesivo cianoacrilato, e fare un taglio appena sopra il punto di svolta del percorso. Aprire la piastra, appiattirla, e la colla sul palco camera di un vibratome.
    4. Fai mediale talamo-ACC fettine di cervello (500 micron di spessore) e poi immergerli in ghiacciata ossigenati fette aCSF.Transfer alla camera di registrazione, e mantenere a 32 ° C sotto perfusione continua (12 ml / min) con ossigenato aCSF per 1 hr.

3. Preparazione di perfusione Camera per multielettrodico Array registrazione

  1. Preparazionedi perfusione Camera
    1. Inserire una sonda MEA su un sistema multi-canale e utilizzare due tubi di polietilene separati per collegare la sonda ad una pompa peristaltica. Utilizzare un tubo per guidare il aCSF nella camera MEA e l'altro tubo per guidare il aCSF dalla camera. Infine, profumato continuamente la preparazione con acqua calda (29-30 ° C) aCSF ossigenato (8 ml / min).
  2. Trasferimento fetta cervello di MEA. Tenere premuto il fetta cervello su MEA utilizzando un tampone di cotone bagnato. Spostare con attenzione la fetta cervello per garantire la ACC è orientato sopra gli elettrodi.
  3. Utilizzare i kit di ancoraggio fetta e tenere di valore a premere la fetta cervello. Questo passaggio assicura un buon collegamento elettrico tra la fetta e elettrodi.

4. Generazione di campi elettrici da DCS

Nota: La definizione dell'orientamento campo elettrico si basa sulla direzione dell'asse axodendritic nella ACC. Gli orientamenti di dendrite e Soma scompartimenti eranoconfermato con colorazione di Golgi 12.

  1. Posizionare l'elettrodo AgCl (definito come anodo) prossimale alla ACC, e posizionare l'altro elettrodo (definito come catodo) distale al ACC. Registrare l'intensità del campo generato dai due orientamenti campo (parallele e perpendicolari alle fibre axodendritic ACC) nel MEA, e fornire le correnti dei campi elettrici utilizzando uno stimolatore.
  2. Fissare la distanza degli elettrodi AgCl (circa 1,5-2 cm), e regolare la forza attuale stimolatore per rendere il DCS tra 0,5 e 2 mA.

5. elettricamente indotte risposte corticali Synaptic

Nota: indurre risposte sinaptiche nel ACC dalla stimolazione elettrica in MT, in cui un generatore stimolo elettrico programmabile produce impulsi di corrente bifasici rettangolari.

  1. Ripetere la sezione 3 di cui sopra.
  2. Posizionare un elettrodo di tungsteno in MT, e inviare impulsi dallo stimolatore al thalregione amic delle fette tramite elettrodi di tungsteno bipolari.
  3. Utilizzare diverse intensità di corrente per determinare la soglia che suscita una risposta ACC. Qui, utilizzare una intensità di ± 150 μA e la durata di 200 msec, che ha suscitato una risposta massimale dell'80% nella ACC nella maggior parte delle fette.
  4. Spostare l'elettrodo di tungsteno lungo il percorso thalamocingulate (da MT a corpo calloso) nella fetta MT-ACC per ottenere i profili di risposta ottimali.
  5. Fare 10-20 spazza di risposte ACC, e utilizzare il software di media automaticamente tutti ACC evocata dalla stimolazione MT. Il risultato iss le risposte sinaptiche in ACC indotta dalla stimolazione MT da MT-ACC percorso.

6. elettricamente indotta attività di sequestro simile

Nota: Le crisi epilettiche-like è stata indotta mediante l'applicazione di 4-aminopiridina (4-AP; 250 mM) e bicucullina (5 mM). Precedenti studi di tempo-controllo hanno dimostrato che le risposte massime e stabili apparvero2-3 ore dopo l'applicazione di droga 14.

  1. ripetere il punto 5.
  2. Aggiungere farmaci alla soluzione di perfusione. Utilizzare 4-AP (250 micron) e bicucullina (5 micron). Mescolare i farmaci in modo uniforme, e continuare a perfusione per 2-3 ore.
  3. Per facilitare attività convulsiva-like, mantenere la pompa di perfusione ad una velocità relativamente veloce perfusione (8 ml / min), che può anche aiutare a prevenire l'accumulo di un gradiente di pH.
  4. Posizionare un elettrodo di tungsteno in MT, e fornire la stimolazione elettrica (150 μA, 200 msec durata) per ottenere profili di risposta ACC.
  5. Fare 10-20 spazza e la media delle risposte.
  6. Sostituire la soluzione di perfusione con fresco aCSF per lavare i farmaci. Ripetere il passaggio 6.5.

7. Effetto Test di DCS sulle risposte corticali evocati

  1. Ripetere sezioni 3 e 4. Assicurarsi che i campi elettrici uniformi sono generati da correnti di passaggio tra due fili d'argento AgCl rivestite paralleli che vengono inseriti all'interno del Mcamera di EA. Se non ci sono problemi, il DCS rimane tra 0,5 e 2 mA.
  2. Spegnere il DCS, e posizionare un elettrodo di tungsteno per stimolare il talamo (± 150 μA, 200 msec di durata). Per ottenere risposte sinaptiche massime nella ACC, fare 10-20 spazza e la media delle risposte.
  3. Contemporaneamente accendere il DCS (2 mV / mm forza DCS) e la stimolazione talamica (350 μA, 200 msec durata). Valutare le variazioni di ampiezza della risposta ACC stimolazione evocata talamica durante DCS.
  4. Spegnere il DCS, e aggiungere 4-AP (250 micron) e bicucullina (5 micron) alla soluzione di perfusione. Quindi attendere 2-3 ore. Quando i farmaci influenzano la fetta cervello, la fetta produce risposte sequestro corticali.
  5. Fare 10-20 spazza di risposte ACC, e quindi misurare l'ampiezza e la durata delle risposte sequestro corticali evocate elettrici.
  6. Dopo il punto 7.5, girare contemporaneamente sul DCS (2 forza mV / mm DCS) e la stimolazione talamica (150 μA, 200 duratisu msec). Valutare le variazioni di ampiezza e durata di risposte sequestro corticali evocate durante l'applicazione DCS.
  7. Sostituire la soluzione di perfusione con fresco aCSF per lavare i farmaci, e ripetere i passaggi 7.2 e 7.3.
  8. Raccogliere tutti i dati di registrazione, e raggruppare i dati nelle diverse condizioni sperimentali. Valutare l'ampiezza e la durata delle risposte corticali sequestro in diverse condizioni sperimentali.

Analisi 8. Dati

  1. Utilizzare un software (ad esempio, MC software Rack) per la media automaticamente le risposte registrate, ed esportare i dati grezzi di un foglio di calcolo. Analizzare l'ampiezza e la durata dei dati grezzi e generare figure a colori.
  2. Per rilevare gli eventi convulsivi oscillatori, utilizzare il software per misurare il valore della linea di base e le deviazioni standard (SD). Set 3 SD del livello di rumore come soglia. Ampiezze dei picchi durante un evento di oscillazione che superano questa soglia vengono rilevano automaticamenteed.
  3. Eseguire l'analisi statistica usando t-test di Student.
  4. Misurazioni espresso e analisi della varianza ad una via (ANOVA) risultati nel testo come media ± SE, con n che indicano il numero di fette studiati 12.

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Risultati

Preparazione del Setup Thalamocingulate Slice e MEA sistema di registrazione

La fetta MT-ACC da topi è una speciale preparazione slice che permette l'esplorazione delle proprietà elettrofisiologiche del percorso thalamocingulate. Figura 1A mostra il modo in cui è stato preparato il fetta MT-ACC. Il cervello di topo è stato rapidamente rimosso e conservato in luogo fresco aCSF ossigenato (Figura 1A,...

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Discussione

Nel presente studio, gli effetti della durata e orientamento DCS sull'attività convulsivo ACC sono stati testati. Per ottenere dati stabili in sezioni di cervello di topo, come mantenere l'integrità del pathway MT-ACC e per evitare danni è fondamentale, specialmente i passaggi in cui sono effettuati due tagli angolati ventrali e un taglio dorsale della corteccia. Inoltre, il tempo di preparare la fetta cervello può anche influenzare l'attività della fetta cervello, che dovrebbe essere il più breve tempo poss...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Siamo grati per il supporto tecnico del Neural Circuit Electrophysiology Core presso l'Academia Sinica. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Council (102-2320-B-001-026-MY3 e 100-2311-B-001-003-MY3) e dal Neuroscience Program di Academia Sinica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anestetico:
IsofluranoHalocarbon Products Corporation NDC 12164-002-254%
NameCompanyCatalog NumberComments
aCSF (totale:1 L):
D(+)-GlucosioMERCK1.08337.100010 mM
Carbonato acido di sodioMERCK1.06329.050025 mM
Cloruro di sodioMERCK1.06404.1000124 mM
(+)-L-ascorbato di sodio, >=98%SIGMAA4034-100G0,15 g/2 c.c
Solfato di magnesio, anidro, ReagentPlusSIGMAM7506-500G2 mM
Cloruro di calcio diidratoMERCK1.02382.10002 mM
Sodio diidrogeno fosfato monoidratoMERCK1.06346.10001 mM
Cloruro di potassioMaggio & Baker LTD Dagenham EnglandMS 76164.4 mM
NomeCompany>Numero di catalogo>Comments
Drugs:
(+)-BicucullineTOCRIS01305 &; M in aCSF
4-amminopiridinaTOCRIS0940250 µ M in aCSF
NomeCompanyNumero di catalogoComments
Brain slice Preparazione:
VibratomeVibratomeSeries 1000Blocco di taglio in 500 &; m fette spesse
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Sistema MEA:
Multielectrode array (MEA): 6 x 10 sistemi multicanale MEA planari60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10diametro dell'elettrodo, 30 & micro; m; spaziatura tra gli elettrodi, 500 & micro; m; impedenza, 50 kΩ a 200 Hz
Sonde multielettrodo (MEA): 8 x 8 MEAAyanda Biosystems60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8elettrodo di forma piramidale; diametro, 40 &; m; altezza della punta, 50 & micro; m; spaziatura tra gli elettrodi, 200 & micro; m; impedenza, 1.000 kΩ a 200 Hz
È stato utilizzato un amplificatore a 60 canali con un filtro passa-banda impostato tra 0,1 Hz e 3 KHz a 1.200X di amplificazione SistemimulticanaleMEA-1060-BC
MC Software rack a una frequenza di campionamento di 10 KHzSistemiSoftware per la raccolta e la registrazione dei dati
Controllo di un generatore di impulsiSistemi multicanaleSTG 1002
Kit di ancoraggio a fette e hold-downWarner InstrumentsSHD-26H/10; WI64-0250
Pompa peristaltica-minipuls3GilsomMINIPULS3 velocità di perfusione : 8 ml/min
NameAziendaNumero di catalogoComments
Sistema di stimolazione:
Stimolatore isolatoA-M SystemsModello 2100intensità di ± 350 μ A , durata di 200 μ sec
Elettrodo di tungstenoA-M Systems575300posizionato in talamo
multicanale

Riferimenti

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