En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

Sommario

In questo articolo descriviamo un metodo relativamente semplice adattato utilizzando il colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) per en face rilevazione simultanea e la visualizzazione di ossido nitrico intracellulare (NO) e di anione superossido (O ₂ ^.- ), rispettivamente, in appena isolato aortas intatte di un modello di obesità del mouse.

Abstract

ossido nitrico endotelio-derivato (NO) prodotto da endoteliale NO-sintasi (eNOS) è uno dei più importanti molecole vasoprotettive nella fisiologia cardiovascolare. Disfunzionale eNOS quali sganciamento eNOS porta alla diminuzione NO biodisponibilità e aumento anione superossido (O ₂ ^.-) di produzione, e, a sua volta promuove malattie cardiovascolari. Pertanto, la misura appropriata di NO e O ₂ ^.- livelli nelle cellule endoteliali sono fondamentale per la ricerca sulle malattie cardiovascolari e complicanze. A causa della natura estremamente labile di NO e O ₂ ^.-, è difficile misurare NO e O ₂ ^.- direttamente in un vaso sanguigno. Sono stati sviluppati numerosi metodi per misurare NO e O ₂ ^.- produzione. È, tuttavia, sia insensibile, o non specifici, o tecnicamente impegnativo e richiede attrezzature speciali. Qui si descrive un adattamentodel metodo colorante fluorescente per en Face Detection e la visualizzazione di intracellulare NO e O ₂ simultanea ^.- utilizzando la cellula permeabile diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE), rispettivamente in aorte intatte di un modello di obesità del mouse indotti per l'alimentazione ricca di grassi-dieta. Abbiamo potuto dimostrare diminuzione intracellulare NO e O migliorato ₂ ^.- livelli nelle aorte intatti appena isolati di topo obesità rispetto al controllo del mouse magra. Abbiamo dimostrato che questo metodo è una tecnica semplice per la rilevazione diretta e visualizzazione di NO e O ₂ ^.- nei vasi sanguigni intatti e può essere ampiamente applicato per l'indagine della funzione endoteliale (dis) sotto (fisio) condizioni patologiche.

Introduzione

Le cellule endoteliali vascolari mantenere l'integrità strutturale e funzionale vascolare rilasciando fattori vasoattivi ^1. Tra questi fattori, l'ossido di azoto endotelio-derivati ​​(NO) prodotto da L-arginina tramite endoteliale NO-sintasi (eNOS) è il fattore più importante e meglio caratterizzato nella fisiologia cardiovascolare ^2. NO provoca il rilassamento della muscolatura liscia e inibisce la proliferazione delle cellule, inibisce l'aggregazione piastrinica e l'adesione delle cellule infiammatorie e l'infiltrazione nello spazio sottoendoteliale, quindi la protezione contro lo sviluppo della malattia vascolare ^3.

Protocollo

lavoro Animal è stato approvato dal Comitato Etico del veterinario di Friburgo, in Svizzera. Il protocollo segue le linee guida sulla cura degli animali e la sperimentazione presso il nostro istituto.

1. Preparazione di un set-up per l'incubazione di isolato arterie

1. Costruire un sistema di bagno per organi che può essere riscaldato a 37 ° C e aerato con 95% O ₂ e 5% CO ₂ da un serbatoio di carbonio.
2. Preparare quanto tampone bicarbonato di Krebs-Ringer, se necessario con la concentrazione della seguente composizione: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl _2, 1.2 mM MgSO _4,....

Risultati

L'obesità è un importante fattore di rischio di malattia coronarica ischemica ed è associata a diminuzione endoteliale NO biodisponibilità, un segno distintivo della malattia vascolare aterosclerotica ^21. eNOS-disaccoppiamento ha dimostrato di essere un importante meccanismo di disfunzione endoteliale in numerose condizioni fisiologiche e patologiche inclusi anziani ^22, arteriosclerosi, l'obesità e ^14. Pertanto, qui mettiamo a confronto i topi mag.......

Discussione

Rilevazione di NO o O ₂ ^.- con coloranti fluorescenti è stato spesso usato in molti studi in cellule endoteliali in coltura e anche in tessuto criosezioni ^23. Qui abbiamo esteso questo metodo per i vasi sanguigni di vita intatto, vale a dire, en face detection di NO e O ₂ ^.- livelli nello strato endoteliale con rispettivamente DAF-2DA e DHE, che è efficace, relativamente semplice, e intuitivo. In confronto con il metodo criosezioni vascola.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Diidroetidio (DHE)	Invitrogen	D 1168	si dissolve con DMSO a 5  mmol/L come 1.000x stock, immagazzinato a -20  ° C
Diaminofluoresceina-2 Diacetato (DAF-2DA)	Calbiochem	251505	sciogliere con DMSO a 5  mmol/L come 1.000x stock, immagazzinato a -20  ° C
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Invitrogen	D 1306	sciogliere con acqua a 300  µ mol/L come 1.000x stock, immagazzinato a 4  ° C
Supporto di montaggio	Lavoro vettoriale. (reactolab)	H-1000
Nω -Nitro-L-arginina metil estere cloridrato (L-NAME)	Sigma-aldrich	N5751
Pentobarbital	Sigma-aldrich	P3636
Multi-Myograph System	Microscopio danese Myo Technology A/S	modello 610M
	Microscopio	SMZ800
	Leica	DM6000
Software di elaborazione	delle immagini National Institute of Health (NIH)	Image J
Forbici chirurgiche	S& T AG	SDC-11
Forbici per microchirurgia	F.S.T	15000-01
Pinze	S& T AG	JF-5
Vetrino coprioggetti rotondo diametro 15  mm	VWR	631-1579
Punte da 1 ml	VWR	RFL-1200c
Suggerimenti 200 μ l	VWR	613.0659
Eppendorf Provette Safe-Lock 1,5 ml	Eppendorf
Cloruro di acetilcolina	Sigma-aldrich	A-6625

confocale Nikon 30120086