Articolo metodologico

En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

DOI:

10.3791/53718

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25 febbraio 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular and Aging Research, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg, 2Kidney Control of Homeostasis, Swiss National Centre of Competence in Research, 3System Physiology, Department of Medicine, Division of Physiology, Faculty of Science, University of Fribourg

In questo articolo

Sommario

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In questo articolo descriviamo un metodo relativamente semplice adattato utilizzando il colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) per en face rilevazione simultanea e la visualizzazione di ossido nitrico intracellulare (NO) e di anione superossido (O 2 .- ), rispettivamente, in appena isolato aortas intatte di un modello di obesità del mouse.

Abstract

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ossido nitrico endotelio-derivato (NO) prodotto da endoteliale NO-sintasi (eNOS) è uno dei più importanti molecole vasoprotettive nella fisiologia cardiovascolare. Disfunzionale eNOS quali sganciamento eNOS porta alla diminuzione NO biodisponibilità e aumento anione superossido (O 2 .-) di produzione, e, a sua volta promuove malattie cardiovascolari. Pertanto, la misura appropriata di NO e O 2 .- livelli nelle cellule endoteliali sono fondamentale per la ricerca sulle malattie cardiovascolari e complicanze. A causa della natura estremamente labile di NO e O 2 .-, è difficile misurare NO e O 2 .- direttamente in un vaso sanguigno. Sono stati sviluppati numerosi metodi per misurare NO e O 2 .- produzione. È, tuttavia, sia insensibile, o non specifici, o tecnicamente impegnativo e richiede attrezzature speciali. Qui si descrive un adattamentodel metodo colorante fluorescente per en Face Detection e la visualizzazione di intracellulare NO e O 2 simultanea .- utilizzando la cellula permeabile diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE), rispettivamente in aorte intatte di un modello di obesità del mouse indotti per l'alimentazione ricca di grassi-dieta. Abbiamo potuto dimostrare diminuzione intracellulare NO e O migliorato 2 .- livelli nelle aorte intatti appena isolati di topo obesità rispetto al controllo del mouse magra. Abbiamo dimostrato che questo metodo è una tecnica semplice per la rilevazione diretta e visualizzazione di NO e O 2 .- nei vasi sanguigni intatti e può essere ampiamente applicato per l'indagine della funzione endoteliale (dis) sotto (fisio) condizioni patologiche.

Introduzione

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Le cellule endoteliali vascolari mantenere l'integrità strutturale e funzionale vascolare rilasciando fattori vasoattivi 1. Tra questi fattori, l'ossido di azoto endotelio-derivati ​​(NO) prodotto da L-arginina tramite endoteliale NO-sintasi (eNOS) è il fattore più importante e meglio caratterizzato nella fisiologia cardiovascolare 2. NO provoca il rilassamento della muscolatura liscia e inibisce la proliferazione delle cellule, inibisce l'aggregazione piastrinica e l'adesione delle cellule infiammatorie e l'infiltrazione nello spazio sottoendoteliale, quindi la protezione contro lo sviluppo della malattia vascolare 3. In molte condizioni fisiologiche e patologiche, tra cui l'invecchiamento, ipertensione, diabete, iperlipidemia, ecc, disfunzione endoteliale caratterizzata da ridotta biodisponibilità di NO e aumentato O 2 .- produzione è presente e promuove la patogenesi dell'aterosclerosi 2. Gli studi degli ultimi anni dimostrano che il disaccoppiamento di eNOS è unimportante meccanismo per la disfunzione endoteliale, in cui l'enzima eNOS genera O 2 .- invece di NO, nelle varie condizioni suddette 1,4. Pertanto, l'analisi della funzione endoteliale, in particolare, endoteliali produzione di NO e O 2 .- generazione è fondamentale per la ricerca sperimentale sulle malattie cardiovascolari e complicanze.

Ci sono numerosi approcci metodologici che sono stati sviluppati per analizzare e misurare la produzione di NO in campioni biologici. A causa della natura estremamente labile di NO che viene facilmente ossidato a NO 2 - e NO 3 - con un'emivita di 3 a 6 sec, è difficile da misurare direttamente NO. Pertanto determinazione di NO 2 - / NO 3 - nei campioni di liquido è stato usato come indice di NO liberato dalle cellule o tessuti 5. Anche se la procedura è relativamente semplice, il metodo è, tuttavia, easily affetto da alta sfondo di NO stabile 2 - / NO 3 - contenuto nella soluzione. Perché NO stimola solubili della guanilato ciclasi per la produzione di guanosina monofosfato ciclico (cGMP) 6, il livello di cGMP cellulare è stato anche determinato a stimare il rilascio di NO 7. Anche in questo caso, si tratta di una stima indiretta e non può essere specifica, dal momento che alcuni fattori endotelio-derivati ​​come il C-peptide natriuretico di tipo (CNP) potrebbe anche aumentare i livelli di cGMP attraverso l'attivazione di particolato guanilato ciclasi 8. NO è prodotto da L-arginina con generazione di L-citrullina come sottoprodotto 9, misura della produzione di L-citrullina è quindi utilizzato anche come un metodo indiretto per stimare la produzione di NO. I principali svantaggi di questo metodo sono che è radioattivo e non misura i livelli di NO bioattivi, dal momento che NO Liberatoria potrebbe essere rapidamente inattivato da O 2 .-; Inoltre, L-citrullina può essere riciclato a L-arginina 10. Altri metodi chimici come il rilevamento chemiluminescenza 11, risonanza di spin elettronico 12, o porfirinico elettrochimico NO sensore 13 sono utilizzati da molti ricercatori. Questi metodi non sono di solito facile in funzionamento, le procedure di rilevamento e richiedono attrezzature speciali. E 'anche ricordare che molti studi si applicano esperimenti bagno per organi con i vasi sanguigni isolati con o senza l'endotelio per valutare la funzione endoteliale e indirettamente misura non mediata rilassamenti vascolare endotelio-derivati. Tuttavia, questo metodo, anche se è principalmente vicino alla situazione fisiologica, ma strettamente a dire, non misura NO funzione, piuttosto valuta endotelio-mediata risposte vasomotorie in generale che riflettono effetti netti della funzione eNOS, produzione di altri derivazione endoteliale rilassante fattori e fattori contraenti endotelio-derivati, la produzione di O 2 .-, e anche le risposte delle cellule muscolari liscea questi fattori. Un'analisi specifica della funzione eNOS e la produzione di NO è di solito necessario 3.

Molti gruppi di ricerca hanno compreso il nostro, negli ultimi anni ha usato il metodo colorante fluorescente per rilevare la produzione intracellulare di NO 14-19. In questo metodo è stato utilizzato il cellulare spia permeabile fluorescenza diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) per misurare la libera funzione NO e NOS in cellule e tessuti in vitro o ex vivo vivente. Il principio è che nelle cellule viventi, DAF-2DA è deacetilata da esterasi intracellulare di non fluorescente 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) che è stato poi convertito in fluorescente DAF-2 triazolo (DAF-2T) reagendo con NO . La fluorescenza da DAF-2T può essere osservata sotto un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale a fluorescenza 14. L'intensità della fluorescenza intracellulare riflette quindi la produzione NO intracellulare nelle cellule o dell'endotelio di un intatto in vesse sanguel. In combinazione con uno specifico colorante fluorescente come dihydroethidium (DHE), si può valutare contemporaneamente intracellulare NO e O 2 .- generazione nelle cellule o nei vasi sanguigni 14. Analogamente, DHE è anche un composto cellula-permeabile che viene ossidato da O 2 .- all'interno delle cellule, e il prodotto ossidativo poi intercala con acidi nucleici per emettere un colore rosso vivo rilevabile quantitativamente mediante microscopio a fluorescenza o microscopio a fluorescenza confocale. DHE è un colorante molto specifica per il rilevamento di O 2 .- da campioni biologici, in quanto rileva essenzialmente radicali superossido, viene mantenuto bene da cellule, e può anche tollerare fissaggio lieve 20. Uno dei vantaggi di questo metodo colorante fluorescente è che rileva e visualizza NO e / o O 2 .- en face direttamente sullo strato endoteliale intatto di un vaso sanguigno vivente.

In questo documento,descriviamo questo metodo colorante fluorescente per rilevare NO e O 2 .- che abbiamo adattato per en face detection di NO e O 2 .- in aorte intatte di un modello murino di obesità indotta da alto contenuto di grassi, la dieta (HFD) di alimentazione. Abbiamo dimostrato che questo metodo potrebbe con successo e in modo affidabile misurare NO e O 2 .- livelli e valutare la funzione eNOS (dis) nello strato endoteliale di appena isolate aorte intatte mouse in obesità.

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Protocollo

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lavoro Animal è stato approvato dal Comitato Etico del veterinario di Friburgo, in Svizzera. Il protocollo segue le linee guida sulla cura degli animali e la sperimentazione presso il nostro istituto.

1. Preparazione di un set-up per l'incubazione di isolato arterie

  1. Costruire un sistema di bagno per organi che può essere riscaldato a 37 ° C e aerato con 95% O 2 e 5% CO 2 da un serbatoio di carbonio.
  2. Preparare quanto tampone bicarbonato di Krebs-Ringer, se necessario con la concentrazione della seguente composizione: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1.2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3, 0,026 mM EDTA, e 11,1 mm D-glucosio).
  3. Mantenere la scorta su ghiaccio e aerare il buffer con il 95% O 2 e il 5% di CO 2.
  4. Accendere il sistema bagno per organi, impostare la temperatura a 37 ° C, aggiungere 5 ml del tampone pronte all'uso per ciascuna camerae mantenere aerare il buffer con 95% O 2 e 5% CO 2.
  5. Lavare le camere una volta con tampone Krebs-Ringer per 30 min.
  6. Aggiungere 5 ml di Krebs-Ringer buffer per ciascuna camera e coprire la camera per evitare l'evaporazione.

2. Isolamento di mouse aorte

  1. Iniettare pentobarbital che viene sciolto in 0,9% NaCl intraperitoneale alla concentrazione di 150 mg / kg di sacrificare i topi.
  2. Posare il mouse supinamente su una tavola chirurgica.
  3. Spruzzare la pelliccia della regione toracica con il 70% di etanolo a fini di sanificazione e umidità.
  4. cavità aperta petto da taglio intorno al costola per esporre il cuore ei polmoni, e rimuovere i polmoni.
  5. Rimuovere il sangue nella cavità toracica delicatamente con un fazzoletto di carta.
  6. Afferrare cuore delicatamente con una pinza e staccare l'aorta toracica tagliando il tessuto adiposo perivascolare tra l'aorta e la colonna vertebrale con le forbici chirurgiche.
  7. immergere immediatamente il da te tessuti a freddo ghiaccio (4 ° C) tampone Krebs-Ringer.
  8. Rimuovere cuore e l'arco aortico sotto un microscopio di dissezione e mantenere il segmento aortico toracico nel buffer.
  9. Sezionare l'aorta libera di aderire il tessuto perivascolare al microscopio con le forbici e pinze chirurgiche.
  10. Afferrare il bordo fine dell'aorta con una pinza, e lavare via il sangue nel lume vascolare da vampate di calore delicatamente tampone Krebs-Ringer con un 26 G × 1 / 2" siringa.
  11. Tagliare gli anelli aortici puliti in segmenti lunghi 3 mm.
    Nota: Prestare attenzione a questo passaggio per non danneggiare strato endoteliale.

3. DHE e DAF-2DA colorazione

  1. Trasferire i segmenti aortici puliti con una pinza verso le camere di bagno per organi pieni di Krebs-Ringer tampone a 37 ° C aerato con 95% O 2 e 5% CO 2.
    Nota: toccare solo il lato avventiziale degli anelli aortici con una pinza e non bloccare il bvasi lood.
  2. Equilibrare le arterie nella camera vasca organo per 30 min.
  3. Aggiungere acetilcolina (ACh) al bagno per organi alla concentrazione finale 1 mM, e incubare le arterie per 10 min.
  4. Preparare 1 ml di soluzione DHE / DAF-2DA (5 micron di ogni colorante, diluito da 1.000 × magazzino) con pre-riscaldato tampone Krebs-Ringer in 1,5 ml provetta. Avvolgere la provetta con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
  5. Dopo la stimolazione, trasferire gli anelli aortici da bagno per organi alla soluzione DHE / DAF-2DA in una provetta a 37 ° C aerato con 95% O 2 e 5% di CO 2 e incubare gli anelli aortici per 30 min.
    Nota: Da questo punto, tenere le aorte sempre nel buio.
  6. Trasferire gli anelli aortici ad una nuova provetta con tampone Krebs-Ringer per il lavaggio e ripetere il lavaggio tre volte entro 1 min.
  7. Trasferire gli anelli aortici alla soluzione di paraformaldeide al 4% per il fissaggio per il 30min.
  8. Preparare 1 ml 4 ', 6-soluzione diamidino-2-phenylindole (DAPI) (300 Nm, diluito da 1.000 × magazzino) con tampone fosfato (PBS) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Controcolorare le aorte per 3 min.
  9. Trasferire i aorte alla nuova provetta con tampone PBS per il lavaggio per 1 min. Ripetere il lavaggio tre volte.
    Nota: Fare attenzione a non bloccare gli anelli aortici o danneggiare lo strato endoteliale.

4. En Face di montaggio

  1. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio alla diapositiva.
  2. Tagliare gli anelli aortici longitudinalmente con le forbici microchirurgia al microscopio, apportare le aorte arrotolati piatta e montarlo en face sul mezzo di montaggio con l'endotelio rivolto verso il basso sul vetrino. Non spostare le aorte avanti e indietro.
  3. Coprire il vetrino con copertura di slittamento e sigillare il vetrino con smalto.
  4. Dopo l'essiccazione aria sotto protezione dalla luce, utilizzare gli scivoli per l'imaging directly entro poche ore o conservarli a -20 ° C per i prossimi giorni.

5. confocale microscopico Imaging

  1. Utilizzare un microscopio confocale per rilevare i segnali di fluorescenza. Accendere la macchina e ottimizzare le impostazioni di imaging, come l'ingrandimento, la velocità di scansione, la risoluzione, Z-stack.
    1. Per questo protocollo, utilizzare un 200 Hz velocità di scansione, risoluzione di 1.024 × 1.024 pixel e la dimensione Z-passo di 0,25 micron. Eccitare la fluorescenza da DAF-2DA con 488 nm laser ad argon e rilevare a 515 nm, mentre eccitare la fluorescenza da DHE a 514 nm e rilevare a 605 nm di emissione.
  2. Utilizzare 10X ingrandimenti di concentrarsi sul campione fino a quando il segnale è chiaro DAPI con raggi ultravioletti, e quindi regolare l'obiettivo a 40x ingrandimenti.
  3. Definire l'intervallo dello strato endoteliale regolando la posizione Z sul pannello di controllo. I segnali di nuclei DAPI macchiati sono punti ovale o rotonda nello strato endoteliale.
  4. Scansione dall'alto(Strato endoteliale sul confine lume) del campione attraverso l'intero spessore di immagini segnale e registrare endoteliali. Scegli almeno 3 campi diversi per la scansione di ogni campione.

6. Analisi di Immagini

  1. Utilizzare il software per aprire i dati acquisiti al microscopio confocale. Scegliere tre immagini consecutive per campo per l'analisi e la valutazione di almeno 3 diversi campi per campione. Esportare le immagini scelte e salvarle come file JPEG.
  2. Quantificare le immagini da DAF-2DA, DHE e colorazione DAPI con il software di elaborazione delle immagini. Per l'immagine dalla colorazione DAPI, scegliere 'Plugin' → 'analizzare' → 'cellulare Contatore' per contare il numero di DAPI nucleo positivo.
    1. Per le immagini da DAF-2DA e DHE colorazione, scegliere 'Analizza' → 'Misura' per analizzare l'intensità dei segnali, e prendere il valore 'medio', come l'intensità del segnale relativo. Presenti poi i risultati come il rapporto tra DAF-2DA pernuclei positivi DAPI o il rapporto di DHE per DAPI. Per ogni campione, prendere il valore medio di ogni immagine e campo.
  3. Dividere il risultato di ogni campione per la media del gruppo di controllo per ottenere il cambiamento piega. L'analisi statistica è stata effettuata con test t di Student spaiato o ANOVA con Dunnett o Bonferroni post-test. Dare dati come media ± SEM. Considerate le differenze di valori medi, come significativa a p <0.05 14.

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Risultati

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L'obesità è un importante fattore di rischio di malattia coronarica ischemica ed è associata a diminuzione endoteliale NO biodisponibilità, un segno distintivo della malattia vascolare aterosclerotica 21. eNOS-disaccoppiamento ha dimostrato di essere un importante meccanismo di disfunzione endoteliale in numerose condizioni fisiologiche e patologiche inclusi anziani 22, arteriosclerosi, l'obesità e 14. Pertanto, qui mettiamo a confronto i topi magri e obe...

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Discussione

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Rilevazione di NO o O 2 .- con coloranti fluorescenti è stato spesso usato in molti studi in cellule endoteliali in coltura e anche in tessuto criosezioni 23. Qui abbiamo esteso questo metodo per i vasi sanguigni di vita intatto, vale a dire, en face detection di NO e O 2 .- livelli nello strato endoteliale con rispettivamente DAF-2DA e DHE, che è efficace, relativamente semplice, e intuitivo. In confronto con il metodo criosezioni vascola...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica (310030_141070/1), dalla Fondazione Svizzera per la Lotta al Cuore e dal Centro Nazionale di Competenza per la Ricerca (NCCR-Kidney.CH) Svizzera. Yu Yi è supportato dal Chinese Scholarship Council.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Diidroetidio (DHE)InvitrogenD 1168si dissolve con DMSO a 5  mmol/L come 1.000x stock, immagazzinato a -20  ° C
Diaminofluoresceina-2 Diacetato (DAF-2DA)Calbiochem251505sciogliere con DMSO a 5  mmol/L come 1.000x stock, immagazzinato a -20  ° C
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)InvitrogenD 1306sciogliere con acqua a 300  µ mol/L come 1.000x stock, immagazzinato a 4  ° C
Supporto di montaggioLavoro vettoriale. (reactolab)H-1000
Nω -Nitro-L-arginina metil estere cloridrato (L-NAME)Sigma-aldrichN5751
PentobarbitalSigma-aldrichP3636
Multi-Myograph System Microscopio danese Myo Technology A/Smodello 610M
MicroscopioSMZ800
Leica DM6000 
Software di elaborazionedelle immagini National Institute of Health (NIH)Image J 
Forbici chirurgiche S& T AGSDC-11
Forbici per microchirurgia F.S.T15000-01
PinzeS& T AGJF-5
Vetrino coprioggetti rotondo diametro 15  mmVWR631-1579
Punte da 1 mlVWRRFL-1200c 
Suggerimenti 200 μ lVWR613.0659
Eppendorf Provette Safe-Lock 1,5 mlEppendorf 
Cloruro di acetilcolinaSigma-aldrichA-6625
confocale Nikon 30120086

Riferimenti

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