Qui descriviamo una procedura che permette un'analisi dettagliata dell'attivazione dipendente dalla fosforilazione del fattore di trascrizione IRF3. Ciò si ottiene attraverso la combinazione di una SDS-PAGE ad alta risoluzione e di una PAGE nativa accoppiata a immunoblot utilizzando più anticorpi fosfospecifici.
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Articolo metodologico
A High Resolution metodo per monitorare l'attivazione fosforilazione-dipendente di IRF3
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il fattore di trascrizione IRF3 è fondamentale per la prima linea di difesa contro i patogeni, principalmente attraverso l'interferone β e l'espressione genica antivirale. Un'analisi dettagliata dell'attivazione di IRF3 è essenziale per capire come i patogeni inducono o eludono la risposta antivirale innata. Forme attivate distinte di IRF3 possono essere distinte in base alla loro fosforilazione e allo stato di monomero rispetto al dimero. La discriminazione in vivo tra le diverse specie attivate di IRF3 può essere ottenuta attraverso la separazione di forme fosforilate di IRF3 in base ai loro spostamenti di mobilità su SDS-PAGE. Inoltre, i livelli del monomero e del dimero IRF3 possono essere monitorati utilizzando l'elettroforesi non denaturante. Qui, descriviamo in dettaglio una procedura per raggiungere la massima risoluzione per ottenere il maggior numero di informazioni sullo stato di attivazione dell'IRF3. Ciò si ottiene attraverso la combinazione di una SDS-PAGE ad alta risoluzione e di una PAGE nativa accoppiata a immunoblot utilizzando più anticorpi totali e fosfospecifici. Questa strategia sperimentale costituisce un approccio economico e sensibile per acquisire tutte le informazioni necessarie per un'analisi completa dell'attivazione mediata dalla fosforilazione di IRF3.
Introduzione
Il fattore di trascrizione ubiquitariamente e costitutivamente espresso Interferone (IFN) Fattore di regolamentazione 3 (IRF3) è fondamentale per la prima linea di difesa contro i patogeni principalmente attraverso l'induzione di Interferone beta, ma anche attraverso l'induzione della chemochina (CC motivo) ligando 5 (CCL5 ) e diverse proteine antivirali tra cui proteine IFN-indotta con tetratricopeptide ripete IFIT1 / 2/3 1-3. Attivazione IRF3 è stata riportata a seguito dell'infezione da numerosi virus, o l'esposizione ad acido polyinosinic-policitidilico (poli I: C) o lipopolisaccaride (LPS) 4. È importante sottoline....
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Protocollo
NOTA: Il protocollo è descritto qui utilizzando cellule A549 infettate con il virus di Sendai (SeV). Tuttavia, il protocollo per SDS-PAGE e PAGE nativo funziona anche con tutti i tipi di cellule umane e murine testati finora, in particolare le cellule mieloidi stimolate con vari-IRF3 attivando 9,15,19,24,25 stimoli.
1. L'infezione di cellule A549
- Mantenere cellule A549 in coltura in una piastra 15 cm a 37 ° C / 5% di CO 2 in 20 ml F12K / mezzo Ham contenente il 10% di siero inattivato al calore fetale bovino (HI-FBS) e 1% di L-glutammina (completo F12K / Prosciutto di media).
NOTA: Tutte le solu....
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Risultati
La figura 2 mostra una tipica immagine immunoblot di IRF3 rilevato con IRF3 totale anticorpi e anticorpi IRF3-phosphospecific contro Ser396 e Ser398 dopo la risoluzione di WCE da ad alta risoluzione SDS-PAGE. Nelle cellule A549 stimolate, IRF3 viene rilevato come due bande a 50 e 53 kDa in SDS-PAGE corrispondente alla non fosforilata (modulo I) e il ipofosforilata (modulo II) specie di IRF3. L'esposizione delle cellule A549 di Sev per 3 - 9 risultati hr in uno sposta.......
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Discussione
Il protocollo che descriviamo qui costituito da una combinazione di alta risoluzione SDS-PAGE e native-PAGE accoppiato all'utilizzo di diversi anticorpi phosphospecific distinguere il monomero / dimero e phosphoforms I-IV di IRF3. Rilevazione adeguata di queste specie IRF3 è essenziale per caratterizzare completamente attivazione IRF3 in un ambiente specifico. Per esempio, LPS stimolazione dei macrofagi attivati porta alla formazione di dimerica, Ser396 / 398 IRF3 fosforilata che presenta un ipofosforilata (modulo.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i membri precedenti e attuali del laboratorio per lo sviluppo dei protocolli. Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [sovvenzione # MOP-130527] e dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG ha ricevuto una cattedra di ricerca canadese di livello II. AR detiene una borsa di studio del programma di formazione della Rete di ricerca sulla salute respiratoria del Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Caldo in un 37 gradi C bagno prima dell'uso. |
| Siero fetale bovino | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutammina | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Per colture cellulari. |
| Tripsina/EDTA 0,25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Virus Sendai Ceppo Cantell | River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA Bioshop | EDT001 | ||
| Glicerolo | Bioshop | GLY001.1 | Tagliare l'estremità del puntale e pipettare lentamente poiché è molto denso. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Marchio registrato corrispondente a Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergente |
| Leupeptin | Bioshop LEU001 | ||
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Fluoruro di sodio | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Ortovanadato di sodio | MP Biomedicals | 159664 | Attivazione dell'ortovanadato di sodio 0,2 M : 1) Regolare il pH a 10,0 utilizzando 1 N NaOH o 1 N HCl. Il pH iniziale della soluzione di ortotovanadato di sodio può variare con molte sostanze chimiche. 2) La soluzione è gialla a pH 10,0. 3) Far bollire fino a quando non diventa incolore. 5) Regolare il pH a 10,0 e ripetere i passaggi 3-4 fino a quando la soluzione rimane incolore e si stabilizza a 10,0. Conservare le aliquote di ortovanadato di sodio attivato a -20 °C. |
| p-nitrofenil fosfato sale disodico esaidrato | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Reagente per il dosaggio delle proteine Bio-Rad | Bio-Rad | 500-0006 | citotossico |
| acrilammide/bis-acrilammide (37,5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | citotossico |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Acido cloridrico (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Lavorare sotto cappa aspirante. Tossico e irritante. |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritante. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Tossico e irritante. |
| Blu di bromofenolo | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M6250 | Lavoro sotto cappa aspirante. Tossico per il sistema nervoso, le mucose. Può essere tossico per le vie respiratorie superiori, gli occhi, il sistema nervoso centrale. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Desossicolato di sodio | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritante. |
| Membrana in nitrocellulosa (0,45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acido acetico glaciale | Bioshop | ACE222.4 | Lavoro sotto cappa aspirante. Tossico, irritante e infiammabile. |
| Ponceau rosso | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Cloruro di potassio (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | Per la composizione di PBS per immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | Per la composizione PBS per immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Per la composizione di PBS per immunoblot. |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | per PBS-T-BSA composizione per immunoblot. |
| Latte scremato in polvere | Garofano | ||
| Polisorbato 20 (Tween) | MP Biomedicals 103168 | Tagliare l'estremità della punta e pipettare lentamente poiché è molto densa. | |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Negozio aliquotato a -20 oC. Evitare il congelamento/disgelo. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquotato a -80 oC. Evitare il congelamento/disgelo. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Tecnologia di segnalazione cellulare | 4947s | Conservare a -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquotato a -80 oC. Evitare il congelamento/disgelo. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Conservare aliquotato a -80 oC. Evitare il congelamento/disgelo. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Negozio aliquotato a -20 oC. |
| Reagente per chemiluminescenza Western Lightning Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD Apparecchio per telecamere | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Standard di peso molecolare, ampia gamma | Bio-Rad | 161-0317 | Conservare aliquotato a -20 oC. |
Riferimenti
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J.
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Ristampe e permessi
