Un sistema di iniezione di pressione per Indagare la Neurofarmacologia di Information Processing in Svegliatevi Comportarsi Macaco Cortex

Sommario

Qui, mostriamo l'iniezione di pressione di sostanze neurofarmacologiche durante la registrazione di una singola cellula in una scimmia macaco sveglia e comportante. Questa procedura consente la manipolazione farmacologica nelle immediate vicinanze di un sito di registrazione corticale.

Abstract

La modulazione top-down dell'elaborazione delle informazioni corticali feed-forward è funzionalmente importante per molti processi cognitivi, inclusa la modulazione dell'elaborazione delle informazioni sensoriali da parte dell'attenzione. Tuttavia, si sa poco su quali sistemi di neurotrasmettitori siano coinvolti in tali modulazioni. Un modo pratico per affrontare questa domanda è quello di combinare la registrazione di singole cellule con la manipolazione neurofarmacologica locale e temporanea in un modello animale adatto. Qui dimostriamo una tecnica che combina registrazioni acute di singole cellule con l'iniezione di agenti neurofarmacologici nelle immediate vicinanze dell'elettrodo di registrazione. Il video mostra la preparazione del sistema di iniezione/registrazione a pressione, compresa la preparazione della sostanza da iniettare. Mostriamo una scimmia rhesus che esegue un compito di attenzione visiva e la procedura di registrazione di una singola unità con manipolazioni farmacologiche a blocchi.

Introduzione

Nelle aree corticali e sottocorticali, l'attività neuronale è influenzata da vari neuromodulatori, ad esempio l'acetilcolina¹. Questi effetti modulatori sulle risposte neuronali sono stati riportati in studi in vitro ², nonché in registrazioni elettrofisiologiche di animali anestetizzati³ e manipolazioni farmacologiche sistemiche nell'uomo⁴. Tuttavia, il ruolo esatto dei diversi neuromodulatori e il coinvolgimento di vari sottotipi di recettori sono in gran parte sconosciuti. Per misurare gli effetti di specifici neuromodulatori sull'attività di singoli neuroni, è auspicabile indurre un cambio temporaneo del neuromodulatore il più vicino possibile all'elettrodo di registrazione. Inoltre, è importante che tali manipolazioni vengano eseguite negli animali svegli, poiché le funzioni cognitive sono presenti solo in assenza di anestesia. Inoltre, l'anestesia interagisce con i sistemi colinergico e GABAergico^5,6 e può portare a cambiamenti nell'attività neurale³.

Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati e perfezionati due metodi principali di somministrazione locale di farmaci: la ionoforesi e l'iniezione a pressione. In entrambi i metodi, i farmaci vengono somministrati attraverso micropipette in vetro o acciaio. Con la ionoforesi, una corrente elettrica regola il rilascio del farmaco⁷. Inoltre, esiste un contributo significativo dell'elettroosmosi alla quantità totale di molecole espulse⁸, correlato con il diametro della punta⁹ della micropipetta e con la concentrazione⁸ della sostanza utilizzata. La ionoforesi è un potente strumento per manipolare in modo rapido e preciso piccoli volumi di tessuto nervoso. Per le iniezioni ionoforetiche, vengono solitamente utilizzate micropipette multi-barile¹⁰, una delle quali funge da dispositivo di registrazione mentre le altre posizioni fungono da pipette di erogazione. Una limitazione di questo metodo è che possono essere utilizzate solo molecole cariche, limitando fortemente la selezione dei farmaci.

L'iniezione a pressione utilizza la compressione dell'aria o la pressione meccanica per espellere una sostanza da una micropipetta. Con questo metodo può essere utilizzata qualsiasi sostanza solubile, carica o non caricata, comprese le grandi molecole. Il metodo di iniezione a pressione è stato descritto per la prima volta da Reyniers nel 1933 e ulteriormente perfezionato negli anni '50 (vedi Lalley¹¹ per una recensione). Negli anni '80 il metodo è stato ulteriormente perfezionato per consentire la somministrazione di quantità nell'ordine dei nanolitri (principalmente lidocaina¹²) in un'area cerebrale definita¹³, eseguendo contemporaneamente la registrazione di singole cellule. Il volume espulso veniva solitamente monitorato osservando il movimento di un marcatore, come il menisco nella parte superiore della pipetta¹³. L'iniezione a pressione è stata utilizzata per la prima volta negli anni '90 negli animali svegli, sia a livello extracellulare¹⁴ che intracellulare^15,16. Sulla base dell'esperienza cumulativa acquisita in questi studi, è ora possibile registrare in modo affidabile da diverse strutture cerebrali in combinazione con la manipolazione farmacologica (vedi¹⁷ per un confronto dei recenti sistemi di iniezione a pressione).

Un problema aperto per entrambi i metodi di somministrazione dei farmaci è la difficoltà nel determinare il volume preciso iniettato. Questa è una sfida ancora più grande per gli esperimenti con scimmie rhesus sveglie e comportamentali in cui l'animale svolge il compito sperimentale in una stanza separata. Questo può essere alleviato dall'uso di un sistema controllato da software invece di fare affidamento su un marcatore visivo per monitorare continuamente un'iniezione.

Il sistema qui descritto è un'estensione di un sistema di registrazione elettrofisiologica ben consolidato (Mini Matrix System) e combina una pipetta per iniezione con più elettrodi di registrazione orientati in parallelo a distanze definite in una disposizione personalizzabile. La manipolazione farmacologica del tessuto vicino all'elettrodo di registrazione è possibile utilizzando solo una piccola quantità di sostanza, garantendo un rapido recupero e consentendo più blocchi di iniezione e controllo/recupero all'interno della finestra temporale limitata offerta dal compito comportamentale dell'animale.

Protocollo

La cura degli animali e tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le leggi tedesche in materia di cura degli animali e approvati dal governo del distretto di Braunschweig, Bassa Sassonia, in Germania.

Nota: Poiché l'esperimento viene eseguito in vivo, è fondamentale per garantire il massimo standard di igiene possibile. Quando possibile, lavorare in condizioni sterili.

1. Preparazione della iniezione / Sistema di registrazione

1. Sterilizzare il tubo che collega la micropipetta con la siringa. Utilizzare la lunghezza più corta del tubo possibile nel set-up sperimentale fra la pompa di iniezione e di registrazione elettrofisiologica.
2. Pulire i tubi di guida del sistema di registrazione con fili di pulizia. immergeteli in olio di silicone sterile e dar loro da mangiare attraverso i singoli tubi di guida più volte.
3. Inserire la micropipetta di vetro di quarzo in un tubo guida del sistema di registrazione. Vedere la Figura 1A.
4. Dopo aver fissato la micropipetta inil sistema di registrazione, collegare il tubo sterile per il perno metallico della micropipetta. Stai attento; anche se la micropipetta è fissato nel sistema si può facilmente rompere quando si collega il tubo. Utilizzare due pinzette sterili per applicare la stessa pressione sul pin e tubo.
5. Utilizzare colla super liquido per sigillare la giunzione tra tubo e micropipetta. Attendere almeno 3 ore per la colla per indurire prima di riempire la micropipetta con liquido.
6. Inserire microelettrodi (ad esempio, vetro di quarzo isolati platino tungsteno) nelle altre posizioni del sistema di registrazione prima o dopo l'inserimento micropipetta.

2. Preparazione della sostanza

1. Sterilizzare provette da 1,5 ml microcentrifuga per la conservazione successiva di soluzioni di iniezione con autoclave o altra procedura affidabile.
2. Pesare il corrispondente cloridrato sostanza scopolamina per preparare 5 ml di una soluzione 0,1 molare. Sciogliere in soluzione fisiologica sterile (0.9% NaCl).
3. In condizioni sterili ina fumi cappuccio, filtrare la soluzione con un filtro a siringa con sufficientemente grande diametro dei pori, ad esempio, di 0,2 micron.
4. Sotto la cappa, aliquote la soluzione in volumi sufficienti per un singolo esperimento, ad esempio, per la scopolamina, 500 ml di sterile provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Utilizzare tubi scuri di proteggere la sostanza dalla luce; In alternativa, avvolgere i tubi in un foglio di alluminio. Per scopolamina, conservare la soluzione per 14 giorni a 4 ° C.

3. Preparazione giornaliera della iniezione / Sistema di registrazione

Nota: Quando montato nel sistema di registrazione, gli elettrodi e micropipette sono memorizzati in una soluzione enzimatica (Tergazyme, soluzione all'1% con acqua deionizzata) tra le registrazioni. Le seguenti operazioni devono essere eseguite prima di ogni registrazione.

1. Raccogliere un tubo della sostanza da iniettare. Permettono di raggiungere RT se refrigerato.
2. Rimuovere il sistema di iniezione / registrazione dal soluzione enzimatica e sciacquare gli elettrodie micropipetta con acqua deionizzata per pulire completamente di soluzione enzimatica.
3. Rimuovere il coperchio anteriore del sistema di registrazione, al fine di controllare visivamente la tenuta tra micropipetta e tubo.
4. Applicare l'olio di silicone sterile per il divario tubo di guida (vedi figura 1A) e punte di elettrodi e micropipetta per lubrificare il sistema per il movimento regolare.
5. Controllare punte di elettrodi e micropipetta utilizzando un microscopio per assicurare che siano intatti. Allineare gli elettrodi e la micropipetta sotto il microscopio in modo che si estendono fuori dai tubi di guida con la stessa lunghezza. spingerli nei tubi di guida, fermandosi non appena non sono più visibili. Questa viene definita come posizione zero dell'elettrodo. Impostare la profondità degli elettrodi e micropipetta a 0 nel software.
6. Riempire una siringa sterile con soluzione salina sterile e inserire l'ago nel tubo, facendo attenzione a non perforare la parete del tubo. Guidare la micropipetta fuori dal tubo di guida per visuil controllo al flusso di sostanza.
7. Lavare almeno 2 fisiologica sterile ml attraverso il tubo e micropipetta per garantire aria rimane nella siringa o nel tubo. Non applicare troppa pressione sullo stantuffo della siringa. Assicurarsi che la giunzione tra tubo e micropipetta è sigillata. Se la perdita è visibile, ri-incollare la giunzione (vedi punto 1.5) e di rinviare la registrazione.
8. Riempire una siringa sterile con la soluzione da iniettare e scambiare con il cilindro della siringa salina, cioè, mantenere l'ago della siringa soluzione salina nel tubo. Assicurarsi che l'aria non viene trasferito nel sistema. Ciò si ottiene riempiendo il mozzo dell'ago con soluzione salina dopo aver rimosso la canna salina-riempita.
9. Lavare il sistema con 250 microlitri della soluzione da iniettare, al fine di rimuovere completamente la soluzione salina dal tubo.
10. Utilizzando il software di controllo del motore, ritrattare elettrodi e micropipetta nella guidetubesto una profondità di almeno -500 micron.
11. Abbassare l'anello di tubo di guida (Figura 1A) alla parte inferiore dei tubi di guida per mantenere la loro posizione relativa fissa.
12. Pulire la base del sistema con etanolo, in particolare quando toccherà camera di registrazione della scimmia.
13. Chiudere il sistema di registrazione sostituendo il coperchio anteriore e serrare le viti.

4. La convalida del sistema di iniezione

Nota: Anche se l'azienda calibra il sistema, si consiglia di convalidare i volumi espulsi con i materiali utilizzati nel set-up sperimentale (tubi, siringhe ecc).

1. Preparare il sistema come descritto al punto 3, mantenendo gli elettrodi e micropipette esteso fuori dai tubi di guida. Si consiglia una profondità di almeno 7.000 micron per evitare la perdita di volume di misura a causa dell'adesione lungo la superficie esterna della micropipetta e elettrodi.
2. Posizionare il sistema di registrazione nella posizione verrà utilizzato durante l'esperimento e mettere il Syringe nella pompa microiniezione. Fissare la siringa in posizione utilizzando l'elastico e la presa regolabile (vedi figura 1A). Far scorrere la parte mobile della pompa finché è saldamente in posizione dietro lo stantuffo della siringa.
3. Utilizzando il gruppo motore controllato tramite software, espellere un volume abbastanza grande da misurare con precisione, ad es., 1000 nl. È preferibile utilizzare un unico passo per espellere il volume totale per evitare effetti di capillarità lungo la superficie micropipetta. velocità molto bassa (1 NL / s) può portare anche a questo effetto durante la procedura di convalida.
4. Raccogliere il volume totale in un contenitore posto sotto la micropipetta, o raccogliere accuratamente la goccia espulsa direttamente dalla punta della micropipetta. Stimare il volume espulso con una pipetta o pesando con una bilancia di precisione.
5. Ripetere la procedura diverse volte per confermare le misurazioni.

5. Registrazioni acuta

1. Impostare la posizione xydel sistema di registrazione. Questo definisce il punto in cui i tubi di guida raggiungono la dura madre all'interno della camera di registrazione cronicamente impiantati. Assicurarsi che i tubi di guida sono rientrati completamente (tubo di guida z posizione 0).
2. Portare il sistema di registrazione in posizione e posizionare la siringa nella pompa microiniezione. Fissare la siringa in posizione utilizzando l'elastico e la presa regolabile (vedi figura 1A). Far scorrere la parte mobile della pompa finché è saldamente in posizione dietro lo stantuffo della siringa. Se una goccia di sostanza è visibile sulla punta dei tubi guida, rimuovere con attenzione utilizzando un batuffolo di cotone sterile.
3. Preparare l'animale per la registrazione in base alla procedura del laboratorio (vedi ¹⁸ ad esempio le linee guida).
4. Montare saldamente il sistema di registrazione sulla camera di registrazione della scimmia.
5. Lentamente abbassare manualmente i tubi di guida nella camera di registrazione fino al raggiungimento della dura madre, poi guidare gli elettrodi utilizzando il co motoresoftware ntrol.
6. Poiché non è possibile misurare l'impedenza del micropipetta, prima unità con elettrodi e controllare le impedenze regolarmente a diverse profondità. Dopo una penetrazione della dura viene eseguita con successo senza danneggiare gli elettrodi, far avanzare la micropipetta.
7. Guidare gli elettrodi e la micropipetta alla profondità elettrodo di destinazione in cui si prevede l'area del cervello di interesse da trovare. Avanzare lentamente l'elettrodo finché è abbastanza vicino per registrare l'attività di una singola unità, come evidenziato da un buon rapporto segnale-rumore nel segnale registrato. È importante sottolineare, posizionare l'elettrodo di registrazione e la micropipetta alla stessa profondità per garantire la distanza minima tra elettrodo e micropipetta.
   1. Se possibile, mantenere gli elettrodi e micropipette a questa profondità per l'intera registrazione. Tuttavia, se l'unico modo per mantenere la qualità della cella registrata segnale è di spostare gli elettrodi, quindi guidare gli elettrodi e la micropipettacontemporaneamente di mantenere la distanza tra loro.

6. Attenzione spaziale Task

1. In una serie di prove, presentano due mobili motivi di punti sullo schermo, uno posizionato all'interno del campo recettivo del neurone registrato e l'altro al di fuori di esso, insieme con un punto di fissazione presentato centralmente che l'animale deve foveate durante ogni prova ^{19, 20.}
   Nota: La scimmia è addestrato a rispondere a un cambio di direzione nel modello dot cued (l'evento di destinazione), ignorando ogni cambio di direzione in un altro modello di punti, e viene ricompensato con una goccia di liquido per ogni completamento di un processo ^{19, 20.} Come condizione di controllo sensoriale, la scimmia deve segnalare un cambiamento luminanza del punto di fissazione ignorando entrambi motivi di punti in movimento (vedi figura 2 per una descrizione più dettagliata del compito).

7. manipolazione farmacologica durante la registrazione

Nota: Durante la scimmia sta eseguendo il compito, iniettare la sostanza in un modo blocco-saggio. Tre blocchi consecutivi sono definite: controllo, che agisce come una linea di base; iniezione, durante la quale una sostanza viene espulso; e recupero, durante il quale le cellule bersaglio del ritorno iniezione al basale.

1. Durante un blocco di iniezione, iniettare una quantità predefinita di sostanza ad intervalli regolari ad es., 2 nl ogni minuto ad una velocità di 2 nl / s. Per questo esempio, utilizzare scopolamina cloridrato. Il processo di iniezione è controllato tramite il software che fornisce varie opzioni. Ad esempio, utilizzare la funzione passo per definire il volume di iniezione, e premere il pulsante di iniezione ogni minuto secondo l'orologio del software di registrazione.
   Nota: La durata esatta del blocco di iniezione è sostanza e sperimentare dipendente, ad esempio, per l'uso scopolamina 2 iniezioni nl ogni minuto per 10 min (20 nl in totale).. È preferibile non avanzare gli elettrodi e duri micropipettang il blocco di iniezione.
2. Notare il tempo e la prova durante il quale la sostanza viene iniettato, la profondità degli elettrodi e micropipette, così come la quantità di sostanza espulso.
3. Seguire il blocco di iniezione con un blocco di recupero, in cui nessuna sostanza viene iniettata. La durata del blocco recupero è sostanza specifica e deve essere definito in pre-test. Monitorare e mantenere la qualità di registrazione delle singole unità selezionate fino alla fine del blocco di recupero.
4. Ripetere i tre blocchi finché la qualità di registrazione e la motivazione della scimmia consentono.

8. Procedure successive di registrazione

1. Dopo la registrazione dei dati, ritrattare elettrodi e micropipetta nei tubi di guida e poi rientrare manualmente i tubi di guida. Rimuovere il sistema di registrazione dalla camera di registrazione della scimmia. Rilasciare la siringa dalla pompa di iniezione e trasferire il sistema alla zona di preparazione per la pulizia.
2. Maneggiare l'animale(compresa la pulizia della camera di registrazione ¹⁸⁾ secondo le procedure standard di laboratorio e riportarlo alla struttura abitativa.
3. Risciacquare all'esterno dei tubi di guida con acqua ossigenata (3%) e poi con acqua deionizzata. elettrodi di azionamento e micropipetta fuori dei tubi guida, sciacquare con acqua ossigenata e poi acqua deionizzata.
4. Sostituire il cilindro della siringa con un barile di una siringa riempita di soluzione fisiologica sterile, mantenendo l'ago nel tubo. Lavare il tubo e la micropipetta con 1-2 ml di soluzione fisiologica. Dopo il lavaggio, rimuovere la canna e riempirlo con l'aria. Reinserire la canna nell'ago e asciugare il tubo e la micropipetta dall'interno spingendo delicatamente aria attraverso.
5. Conservare le provette di guida, elettrodi estesi e micropipetta immersi nella soluzione enzimatica per evitare l'essiccamento nonché per garantire la ripartizione del materiale organico.

Risultati

La figura 2 illustra il compito attenzione spaziale la scimmia eseguita quando il processo di iniezione è stato condotto. La scimmia è stato addestrato per assistere a uno stimolo situato all'interno del campo recettivo del neurone registrato (frequentare-in), lo stimolo trova al di fuori del campo recettivo (frequentare-out) oppure il punto di fissazione (frequentare-fix). Queste condizioni consentono un confronto tra attività neuronale in diversi stati di attenzione.

La figura 3 mostra una peri-stimolo tempo istogramma di un neurone campione in un esperimento utilizzando scopolamina, un antagonista muscarinico colinergico. La trama dimostra la soppressione di risposta durante l'iniezione scopolamina contro nessuna iniezione, quando un modello si muove in direzione preferita della cella viene presentata all'interno del campo recettivo del neurone ed è frequentato dall'animale. I primi due picchi rappresentano il neurone9; s risposta alla on e l'offset della stecca spaziale, che appare all'interno del suo campo recettivo. Questo è seguito dalla risposta al modello mobile che appare sullo schermo 500 ms dopo cue esordio. L'area ombreggiata grigia rappresenta il periodo di analisi utilizzato per calcolare il tasso medio di tiro per ogni prova. L'area verde mette in evidenza l'influenza soppressiva di iniezione scopolamina sulla frequenza di scarica della cellula. La regione verde scuro indica la soppressione entro il periodo di analisi.

Figura 4A mostra l'effetto della scopolamina sul tasso medio cottura del neurone del campione in ciascuna delle tre condizioni di attenzione. tasso del neurone cottura per le due condizioni di attenzione spaziali (attenzione all'interno o all'esterno del campo recettivo del neurone registrazione), nonché per la condizione sensoriale (attenzione al punto di fissazione) caduto poco dopo la prima iniezione del blocco di iniezione (in grigio siamoa) e durante il blocco recupero aumentato dopo un ritardo allo stesso livello come prima dell'iniezione.

La figura 4B mostra un controllo registrazione da un neurone secondo campione in cui è stato iniettato salina (0,9% NaCl), utilizzando lo stesso protocollo per l'iniezione scopolamina. Durante l'iniezione bloccare alcun cambiamento nella frequenza di scarica del neurone è stato osservato rispetto al blocco di controllo.

Figura 1. Set-up utilizzato per la manipolazione farmacologica durante la registrazione. (A) rappresenta la pompa microiniezione e il sistema di registrazione elettrofisiologica dotato di elettrodi e micropipetta. Il divario guidetube, in cui viene inserito olio al silicone per lubrificare gli elettrodi e micropipetta, viene mostrata ingrandita. (B) Consente di visualizzare un esempio micropipetta (sopra)ed elettrodo di registrazione (di seguito). Per confronto le dimensioni, un centesimo di euro (diametro: 16 mm). È posto sotto Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. progettazione compito di guidare l'attenzione spaziale. Le scimmie sono stati addestrati per rilevare un cambio di direzione del movimento nel modello dot cued. Lo spunto era o collocato all'interno del campo recettivo del neurone (frequentare-in), come mostrato in figura, o all'esterno di esso (assistere-out). Come controllo sensoriale, la scimmia è stato addestrato per rilevare un cambiamento luminanza del punto di fissazione (frequentano-fix). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

< img alt = "Figura 3" src = "/ files / ftp_upload / 53724 / 53724fig3.jpg" />
Figura 3. Influenza della antagonista scopolamina sulla frequenza di attivazione. Il tempo istogramma peri-stimolo per un neurone campione viene mostrato per la frequentare-in condizione (attenzione all'interno del campo recettivo del neurone registrato) durante il blocco di iniezione e durante il blocco di controllo. L'asse x rappresenta il tempo in millisecondi dopo spunto insorgenza e l'asse y mostra la frequenza di scarica in spighe / sec. L'area grigia rappresenta il periodo di analisi (300-800 ms dopo stimolo insorgenza) utilizzato per calcolare il tasso di prova della cotta-media. L'area ombreggiata verde mostra la soppressione di sparare tasso tra le due condizioni. Il colore verde scuro mette in evidenza la soppressione entro il periodo di analisi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

iles / ftp_upload / 53724 / 53724fig4.jpg "/>
Figura 4. Effetto della scopolamina e soluzione salina a sparare tasso. (A) Antagonista iniezione di scopolamina. La velocità di fuoco trial-media della cella campione dalla figura 3 nel corso dell'esperimento sono presentati sotto lo stimolo preferito per le tre condizioni di attenzione. L'asse x rappresenta l'ora di inizio di prova in pochi minuti e l'asse y mostra frequenza di scarica dell'unità in spighe per pochi secondi. Simboli ( frequentare-in, frequentare-fix, frequentare-out) rappresentano frequenza di scarica del neurone entro il periodo di analisi in ogni prova eseguita con successo, e le linee orizzontali (linea continua: frequentare-in, linea tratteggiata: frequentare-fix, linea tratteggiata: frequentare-out) mostrano tasso medio di fuoco per la tre diversi bl sperimentalegreggi (controllo, iniezione, il recupero). L'area ombreggiata grigia indica il blocco di iniezione, a cominciare dalla prima iniezione e termina 1 minuto dopo l'ultima iniezione. Durante l'iniezione blocco 2 nL 0,1 scopolamina molare stato iniettato ogni minuto con una velocità di iniezione 2 nl / s. (B) iniezione di soluzione salina. La frequenza di scarica di una cella campione nel corso dell'esperimento controllo è mostrato per lo stimolo preferito per le tre condizioni di attenzione. Grigio zona ombreggiata visualizza il blocco di iniezione di soluzione salina. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui abbiamo illustrato in dettaglio come eseguire le iniezioni affidabili e precisi e registrazioni monocellulari di alta qualità con un sistema di iniezione a pressione "off-the-shelf". Mentre questo metodo di somministrazione di farmaci è stato precedentemente utilizzato nel comportarsi scimmie (recensiti ^17), il sistema qui presentato ha vantaggi, illustrate nel seguito.

Come illustrato nella Figura 4A, il sistema qui descritto può fornire una misurazione stabile di attività neuronale singola con e senza iniezioni farmacologici nelle immediate vicinanze del sito di registrazione. Come mostrato in figura 4B, l'iniezione di una sostanza di controllo, soluzione salina, non ha portato ad un cambiamento nella frequenza di attivazione. Questo controllo dimostra che il processo di iniezione stessa non influisce misurabili sulle proprietà di cottura dei neuroni registrati.

La configurazione spaziale del neurone, elettrodo registrazione e micropipetta è di cruciale importanza in questi esperimenti. Sebbene una misurazione precisa delle loro posizioni relative del tessuto durante la registrazione non è possibile, possiamo considerare e controllo per possibili fonti di varianza. Prima, durante l'iniezione del volume vi è il rischio che il neurone di interesse può essere spostato lontano dal elettrodo di registrazione, compromettere la stabilità segnali registrati. Per questo motivo è opportuno confrontare la velocità di fuoco prima e dopo il blocco di iniezione per verificare la stabilità del segnale. In secondo luogo, la configurazione tubo di guida del sistema di registrazione definisce la distanza tra gli elettrodi e micropipette (ad es., 305 micron di sistema 3 canali concentrici utilizzato in questo esperimento). Poiché il sistema consente un controllo preciso per la profondità di elettrodi e micropipetta nel tessuto, la distanza tra loro può essere minimizzato calibrando accuratamente profondità relativa prima della registrazione (passo 3,5), e mantenendole ad una profondità comune durante le registrazioni.

ent "> I potenziali limitazioni
Oltre al controllo della qualità in-house da parte del produttore, il sistema deve essere convalidata in condizioni di laboratorio, come diverse marche di tubi, siringhe, ecc possono essere usati e potrebbero portare a differenze nei volumi espulsi. Sebbene il sistema può essere utilizzato per iniettare volumi molto piccoli come nell'esperimento qui illustrato, questi sono sotto il volume minimo che può essere convalidato per limiti misurazioni pratiche in un ambiente di laboratorio normale. Tuttavia, volumi di iniezione più grandi possono essere utilizzati per ricavare la relazione tra il volume definita dal software e il volume eiettato dall'hardware. Se si utilizzano tubi trasparenti, un ulteriore controllo visivo del processo di iniezione è possibile misurando lo spostamento di un marcatore visivo.

Inserimento della micropipetta nel sistema è più ambizioso inserzione dell'elettrodo, come il diametro della micropipetta è leggermente più grande e il materiale è più fragile. Inoltre,unendo il tubo al perno della micropipetta è impegnativo in quanto comporta un elevato rischio di rompere la parte superiore della micropipetta. Tuttavia, la durata di una micropipetta caricata correttamente è diversi mesi, anche con l'uso quotidiano.

In pratica, non abbiamo ancora incontrato un blocco nel sistema di iniezione durante la pulizia post-registrazione del sistema. Tuttavia, nessun controllo "on-line" è possibile, e vi è il rischio che un blocco fisico (come il tessuto sulla punta micropipetta) potrebbe impedire iniezione sostanza. Potrebbe quindi essere opportuno analizzare i dati in modo conservativo, come includere solo quelle celle ulteriori analisi che mostrano variazioni significative cottura tassi tra controllo e iniezione blocchi dell'esperimento.

Nonostante la loro piccolo diametro, microelettrodi e pipette sposteranno tessuto cerebrale e può causare alcuni danni ai tessuti locali. Questo può essere minimizzato posizionando manualmente la punta di thtubi e di guida appena sopra la dura madre. Gli elettrodi poi penetrano la dura e la loro integrità viene dedotta misurando le loro impedenze on-line. In seguito, viene inserita la micropipetta. Quando si utilizza questo approccio, è consigliabile regolare rimozione di tessuto sopra la dura per ridurre ulteriormente il rischio di elettrodo o pipetta rottura.

Confronto con metodi alternativi
Il sistema utilizzato qui mostra chiari vantaggi rispetto ad altri sistemi di iniezione a pressione. Un notevole vantaggio è il diametro della micropipetta (circa 100 micron), che è la metà di altre sonde disponibili ¹⁷ e minimizza così danni tessuto neurale. Contrariamente ai disegni precedenti, l'attuale sistema impiega spazialmente separati registrazione elettrodo e micropipetta. Sebbene altri sistemi forniscono una distanza minore tra l'elettrodo e pipetta, il sistema qui descritto permette approfondite indipendenti di elettrodi e pipetta, quindi permitalla zio distanze relative variabili all'interno di una sessione di registrazione. È importante sottolineare che nessun compromesso riguardo qualità di registrazione deve essere fatta, come il sistema di iniezione è un'estensione di un dispositivo di registrazione stabilito. Mentre solo una micropipetta e quindi una sostanza è utilizzata in questo protocollo, è possibile iniettare più sostanze entro una procedura sperimentale. Per raggiungere questo obiettivo, diversi micropipette possono essere infilati nei tubi di guida separati e collegati alle siringhe montati nelle pompe di iniezione singole. Infine, il controllo del sistema è facile, come è necessario solo un programma per computer per avanzare gli elettrodi e micropipetta, e per eseguire l'iniezione di pressione durante l'esperimento.

Confrontando iniezione pressione per iontoforesi, ci sono vantaggi e svantaggi. Ad esempio, pressione di iniezione richiede maggiori volumi da introdurre nel tessuto di ionoforesi, aumentando così il rischio di spostamento neuronale. Il proto correnteCol utilizzato volumi nella gamma nL, e raramente abbiamo sperimentato notevoli cambiamenti nella qualità del segnale della cellula registrata. Il sistema permette inoltre grandi volumi da iniettare, che è potenzialmente utile per le manipolazioni comportamentali ma potrebbe influenzare la stabilità della registrazione neuronale. Un chiaro vantaggio di iniezione a pressione sopra ionoforesi è la più ampia varietà di sostanze utilizzabili in quanto non vi è alcuna necessità di usare sostanze caricate. Tuttavia, i valori di pH devono essere controllati e confrontati tra le sostanze sperimentali e di controllo (ad es., Soluzione fisiologica).

La domanda potrebbe sorgere il motivo per utilizzare il metodo di lunga data di iniezione pressione invece di tecniche più recenti, come optogenetics per la manipolazione di attività neurale. Anche se ben consolidata nei roditori, optogenetics non è ancora affidabile stabilito nelle scimmie rhesus. In particolare, essa non consente ancora la manipolazione locale cellule selettivi per un particolare tipo di neurotrasmettitore. A lungo termine, vediamogrande potenziale per la combinazione dei vantaggi di manipolazioni farmacologiche con i vantaggi di manipolazioni optogentic nel chiarire le basi neurali delle funzioni cognitive.

Qui abbiamo mostrato come iniezione a pressione può essere utilizzato per manipolare farmacologicamente un'area ristretta localmente nel cervello di veglia, comportandosi scimmie rhesus. Ci auguriamo che questo metodo ispira altri scienziati per indagare i contributi neuromodulatori alle dinamiche di attività neuronale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(-)-Scopolamina cloridrato	Sigma-Aldrich	55-16-3	Mr 339,81 g/mol
NaCl 0,9%	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	detergeno enzimatico
Perossido di idrogeno	Roth		Utilizzato in soluzione al 3% con acqua deionizzata
Etanolo	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
Acqua
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	Siringa e ago
Eppendorf Provette per microcentrifuga Safe-Lock, ambra	Eppendorf	0030 120.191	1,5ml
Micropipetta in quarzglass	Thomas Recording
Elettrodo di registrazione	Thomas Recording		elettrodo in fibra di quarzo/platino-tungsteno; valore di impedenza 1-2 MΩ   e 0,3-0,5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	Dimensioni: 0,25 x 2,05 mm (Ld: 0,9 mm)
Loctite 401	Henkel	233641	Supercolla
Olio siliconico	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761----------R	Filtro per siringa
Sistema di microiniezione multicanale	Thomas Recording		manipolatore di microelettrodi multicanale " Sistema Eckhorn" dotato di microelettrodi e micropipette e di una pompa di microiniezione multicanale di precisione
personalizzato		McLab	per controllare la presentazione dello stimolo

deionizzataSoftware di laboratorio interno