Un quantitativo Glycomics e proteomica combinata strategia Purificazione

Sommario

È stato sviluppato un protocollo ad alto rendimento per la purificazione combinata di proteomica e glicomica e la quantificazione LC-MS/MS nel plasma. L'analisi della deamidazione dei motivi di glicosilazione legati all'N era specifica per i siti deglicosilati. La quantificazione accurata degli N-glicani è stata ottenuta accoppiando la separazione degli N-glicani assistita dal filtro alla normalizzazione dell'individualità durante la marcatura con la strategia dei tag glicano idrazide.

Abstract

C'è un crescente desiderio nelle scienze biologiche e cliniche di integrare e correlare più classi di biomolecole per svelare la biologia, definire percorsi, migliorare il trattamento, comprendere la malattia e aiutare la scoperta di biomarcatori. La glicosilazione legata all'N è una delle più importanti e robuste modificazioni post-traduzionali delle proteine e regola le funzioni cellulari critiche come la segnalazione, l'adesione e la funzione enzimatica. Le tecniche analitiche per purificare e analizzare gli N-glicani sono rimaste relativamente statiche nell'ultimo decennio. Sebbene accurati ed efficaci, richiedono comunemente competenze e risorse significative. Sebbene siano stati sviluppati alcuni schemi di purificazione ad alto rendimento, devono ancora trovare un'adozione diffusa e spesso si basano sull'arricchimento di glicopeptidi. Un metodo promettente, sviluppato da Thomas-Oates et al., la separazione N-glicano assistita da filtro (FANGS), è stato dimostrato qualitativamente sui tessuti. In questo caso, abbiamo adattato FANGS al plasma e lo abbiamo accoppiato alla normalizzazione dell'individualità durante la marcatura con la strategia dei tag di glicano idrazide al fine di ottenere un'accurata quantificazione relativa mediante cromatografia liquida, spettrometria di massa e ionizzazione elettrospray migliorata. Inoltre, abbiamo progettato nuove funzionalità per il protocollo ottenendo tandem, proteomica shotgun e analisi del sito di glicosilazione su plasma di gallina. Abbiamo dimostrato che gli N-glicani purificati sul filtro e derivatizzati dai tag idrazide idrofobici erano paragonabili in termini di abbondanza e classe a quelli per estrazione in fase solida (SPE); Quest'ultimo è considerato un gold standard nel campo. È importante sottolineare che la variabilità nei due protocolli non era statisticamente diversa. I dati proteomici raccolti in linea con i dati glicomici avevano la stessa profondità rispetto a un digestato standard di tripsina. La deamidazione peptidica è minimizzata nel protocollo, limitando la deammidazione non specifica rilevata nei motivi di glicosilazione. Ciò ha consentito l'analisi diretta del sito di glicosilazione, sebbene il protocollo possa ospitare anche la marcatura del sito ^{a 18}O. Nel complesso, abbiamo dimostrato un nuovo protocollo in linea ad alto rendimento, imparziale, basato su filtri per l'analisi quantitativa della glicomica e della proteomica.

Introduzione

Nel campo della proteomica, filtro aided preparazione del campione (FASP) è stato ampiamente adottato per la sua capacità di ridurre la quantità di materiale di partenza, ridurre artefatti preparazione del campione, e massimizzare la produttività del campione ^1. Tuttavia, un tale metodo è ancora emergere e guadagnare trazione per il campo di glycomics. Lo sviluppo di high-throughput, flussi di lavoro quantitativi sono necessari a causa del ruolo fondamentale di glicosilazione in difesa biologica e la sua modulazione da cancro o malattie ^2,3. Nei mammiferi, N -glycans sono composti di ripetere unità saccaridiche (esosi (Hex), esosamine (HexNac), acidi sialico (NeuAc), e fucoses (FUC)), che decorano una struttura di base (hex ₃ HexNac ₂₎ ⁴ a legame covalente a asparagina. Sebbene il glycospace è considerevolmente grande quando isomeri sono contati (> 10 ^12), è piuttosto modesto in termini di composizione e peso molecolare tipicamente variano da 1,000-8,000 Da ^{5 <}/ Sup>. L'omogeneità compositiva della classe e l'idrofilia dei glicani pongono sfide uniche per la purificazione, la separazione, e spettrometria di massa (MS) dei flussi di lavoro ^6.

Tradizionalmente, N -glycans vengono digeriti da proteine ​​o peptidi da peptide- N -glycosidase F (PNGase F) e poi arricchite da lectina cromatografia di affinità ^7, catturati da perline idrazide ^8, o purificati mediante estrazione in fase solida (SPE) ^9,10. Mentre questi metodi sono tutti altamente efficaci, introducono passaggi aggiuntivi per dissalazione e limitare il numero di campioni trattati simultaneamente. Negli ultimi dieci anni, sono stati proposti una serie di piattaforme high-throughput per glycomics. Kim et al. Pubblicato un metodo semi-automatico utilizzando una piastra SPE 96 pozzetti a depressione ^11. In alternativa, un metodo di affinità-filtro (N--glyco FASP) è stato sviluppato dal gruppo di Mann, che ha richiesto la derivatizzazione iniziale del filtro con un composito di lectine ^12. Infine, il gruppo di Thomas-Oates ha proposto un metodo semi-quantitativo, il filtro Aided N -Glycan di separazione (ZANNE), che ha sfruttato la dimensione composizione ristretta del glycospace ^13. Basandosi su filtri cut-off peso molecolare, piccoli contaminanti sono stati lavati per i rifiuti e poi i -glycans N sono stati digeriti e eluiti. proteine ​​deglicosilata rimangono sul filtro in questo protocollo e possono essere sottoposti a FASP in linea.

L'identificazione e la quantificazione dei glicani per ionizzazione elettrospray (ESI) MS richiede separazioni off-line per la risoluzione (parziale) di isomeri e derivatizzazione per il rilevamento di specie a basso abbondanti. Etichettatura nella individualità, quando la normalizzazione con la strategia glycan tag idrazide conferisce compatibilità con cromatografia liquida in fase inversa (RPLC) ^14,15. Il 4-fenetil-benzohydrazide (P2PGN) tag idrofobo media la idrofilia dei glicani, ENHarbitrare la ionizzazione da, in media, quattro volte ^16. Anche altre tecniche, come permethylation ¹⁷ o ammina reattiva chimiche codifica ^18, offrono vantaggi simili, nella reazione idrazide, glicani vengono fatti reagire 1: 1 stechiometricamente in condizioni facili. Quantificazione relativa è ottenuta mediante l'analisi di campioni tandem derivatizzati con nativo (NAT) o ¹³ C ₆ etichette stabile isotopi (SIL).

Il seguente metodo si evolve ZANNE per le applicazioni di plasma e le coppie con la variabile idrofobico P2GPN per un'accurata quantificazione relativa. Inoltre, è stato progettato per eseguire proteomica tiro-gun, deamidation profilatura e glycomics quantitativi una singola aliquota di campione, senza compromettere l'integrità delle analisi.

Protocollo

1. Proteine ​​e Glicoproteina Denaturazione e alchilazione

1. Per i preparati standard, carico di 2,5 microlitri di 0.1 mg / ml soluzione di glicoproteina (per esempio Fetuina o RNase B) su un 30 kDa o 10 peso molecolare filtro cut-off kDa (MW).
   1. Per i campioni di plasma biologici, controllare la concentrazione di proteine ​​da un saggio di ²⁰ (BCA) proteina titolato Bradford ¹⁹ o bicinconinico. Diluire il plasma, se necessario, con 100 mM di bicarbonato di ammonio (NH ₄ HCO ₃₎ in H ₂ O (PNGase Digest Buffer) a pH ~ 7 per contenere tra 10-100 mg / ml di proteine ​​totali. Carico 2,5 microlitri di plasma (25-250 mg proteine) su un filtro.
      Nota: Questo protocollo è stato testato solo su plasma da campioni di sangue raccolti in presenza di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
2. Aggiungere 2 ml di 1 M soluzione di ditiotreitolo (DTT) per ogni campione nel filtro.
3. Diluire il campione con 200 ml PNGase digerire tampone.
4. Tappare la provetta filtro e leggermente vortice, facendo attenzione a non disturbare il filtro dalla sua sede. Incubare il campione a 56 ° C per 30 minuti per denaturare le proteine ​​e glicoproteine.
5. Per alchilata i campioni, aggiungere 50 ml 1 M Iodoacetamide, per dare una concentrazione finale di ~ 200 mM, e incubare a 37 ° C per 60 min.
   NOTA: Se l'analisi proteomica non è desiderato, passo 1.5 può essere saltato.
6. Concentrare la glicoproteina denaturato sul filtro mediante centrifugazione campioni a 14.000 xg per 40 min. Gettare il flusso attraverso.

2. N linked Glycan digestione enzimatica

1. Lavare il campione con 100 ml PNGase digerire tampone. Concentrare la glicoproteina sul filtro a 14000 g per 20 minuti ed eliminare il flusso attraverso.
   1. Ripetere la fase di lavaggio e concentrato due volte, per un totale di tre volte, ottenendo un concentrato nel volume morto filtro (~ 5 microlitri). scartare tuttofluire attraverso.
   2. Scartare collezione fiala una volta lavaggi sono completi. Raccogliere tutte le eluenti futuri e lavaggi in un nuovo flacone di raccolta.
      NOTA: PNGase digerire buffer in H ₂ O ¹⁸ può essere utilizzato durante la fase di digestione PNGase F per l'etichettatura degli isotopi stabili di siti asparagina de glicosilata, che diventano chimicamente deamidato.
2. Aggiungere 2 ml di libero-glicerolo PNGase F (75.000 x unità / ml) per filtrare dopo il trasferimento in una fiala collezione fresca. Aggiungere 98 ml di PNGase digerire tampone, portando il volume totale di 100 ml, e delicatamente pipetta su e giù sul filtro per mescolare. Enzimatica digerire i glicani alle condizioni di passaggi 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 O.
   NOTA: tre metodi per la deglycosylation delle proteine ​​possono essere utilizzati. Per l'analisi esclusivamente glycomics (non proteomica), si raccomanda la lunga incubazione nel passo 2.2.1. Per glycomics e proteomica di ricerca, i passi 2.2.2 e 2.2.3 produrrà peptidi di alta qualità con il minimo non-spdeamidation ecific.
   1. Glycomics-unico protocollo di digestione (18hr): incubare i campioni a 37 ° C per 18 ore a fendere enzimaticamente tutti N -glycans.
   2. Spike-in protocollo digestione (SPI): incubare i campioni a 50 ° C per 2 ore. Lavorando in fretta, rimuovere i campioni e picco di un ulteriore 2 ml di libera-glicerolo PNGase F (75.000 x unità / ml). Leggermente vortice i campioni per 1-2 secondi per mescolare. Incubare i campioni a 50 ° C per un ulteriore 2 ore.
   3. protocollo di digestione a microonde (MD): I campioni in un rack provetta galleggiante. campioni galleggiare in un 1 L bicchiere riempito con 1 L di acqua deionizzata (DI). Il becher nel centro di un forno a microonde (950 W) con una piastra rotante. Forno a microonde a 60% di potenza (570 W) per 5 min. Per raffreddare, prelevare campioni e mantenere a temperatura ambiente per 2 min. Poi microonde per altri 5 min a 60% di potenza.
      NOTA: Le impostazioni di potenza a microonde dovranno essere regolati in base alla potenza massima del forno a microonde.potenza media deve essere mantenuta costante tra i modelli.

3. eluizione di N -glycans

1. Eluire glicani centrifugando il campione a 14.000 xg per 20 min a 20 ° C.
2. Aggiungere 100 pl di tampone di PNGase digeriscono al filtro e centrifugare a 14000 xg per 20 min a 20 ° C. Raccogliere lavaggio contenente ogni residuo N -linked glicani, nella stessa fiala di raccolta come eluente. Ripetere due volte. Rimuovere il filtro e mettere in nuova fiala di raccolta.
3. Incubare campioni glicani nella -80 ° C freezer fino congelati (30-60 min). Lavaggio a compimento, a temperatura ambiente, in concentratore sotto vuoto (4-6 hr).
   NOTA: N -glycans possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di sei mesi prima della derivatizzazione.

4. Le proteine ​​FASP Digestione

NOTA: Se proteomica o analisi del sito deamidation non è desiderato, sezione 4 del protocollo può essere saltato.

1. Risciacquare tegli filtro, che contiene i peptidi deamidati, con 400 ml di buffer di 8 M urea. Chiudere la fiala di raccolta e leggermente vortex per miscelare. Concentrati sul filtro a 14000 xg per 15 min. Eliminare tutte le flow-through.
   1. Ripetere passaggio 4.1 altre due volte, per un totale di tre lavaggi tampone urea.
2. Lavare il filtro, che contiene i peptidi deamidati, con 400 ml di 2 M urea, 10 mM CaCl ₂ Buffer (tripsina digerire buffer). Chiudere la fiala di raccolta e leggermente vortex per miscelare. Concentrati sul filtro a 14000 xg per 15 min. Eliminare tutte le flow-through.
   1. Ripetere passo 4.1 altre due volte, per un totale di tre lavaggi tripsina digerire tampone.
   2. Scartare collezione fiala una volta lavaggi sono completi. Raccogliere tutte le eluenti futuri e lavaggi in un nuovo flacone di raccolta.
3. Aggiungere 50 ml suina tripsina modificata in un 1:50 o 1: 5 tripsina: proteine ​​(w / w) Rapporto per gli esperimenti di scoperta o di proteomica quantitativa, rispettivamente.Chiudere la fiala di raccolta e leggermente vortex per miscelare.
4. Incubare i campioni a 37 ° C per 2 ore. Funzionando rapidamente, rimuovere i campioni e picco di altri 50 ml di tripsina a 1:50 o 1: rapporto proteine: 5 tripsina. Leggermente vortice i campioni per 1-2 secondi per mescolare. Incubare i campioni a 50 ° C per un ulteriore 2 ore.
5. Eluire i peptidi facendo girare a 14000 xg per 15 min.
6. Sciacquare i peptidi rimanenti dal filtro con acido formico 400 ml 1% e il 0,001% Zwittergent 3-16 (buffer di tempra). Eluire il filtro facendo girare a 14000 xg per 15 min.
7. Quantificare la concentrazione di peptide nei campioni da Bradford ¹⁹ o saggio BCA ^20.
8. Incubare campioni peptide nel -80 ° C freezer fino congelati (30-60 min). Lavaggio a compimento, a temperatura ambiente, in concentratore sotto vuoto (4-6 hr).
   NOTA: Secco peptidi possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di tre mesi.
9. Risospendere proteine ​​tryptic appena prima di liquid cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS) analisi 2% acetonitrile, 98% H ₂ O, e acido formico 0,1% (fase mobile A) alla concentrazione desiderata. Le concentrazioni di peptide tryptic della gamma plasma 2,5 ml 100-300 ng / ml.

5. Derivatizzazione di N -linked glicani con idrofobi idrazide Tag

1. Ricostituire secchi pesanti (SIL) o luce (NAT) reagenti P2GPN in 1 ml di MeOH 75:25: Acido acetico (soluzione derivatizzazione), per una concentrazione finale di 0,25 mg / ml. Reagenti saranno necessari fino a 10 minuti per solubilizzare completamente. Ampiamente vortice per garantire la completa solubilizzazione.
   Nota: Nel caso in cui questo protocollo derivatizzazione viene utilizzato con -glycans N standard, contro glicani purificati, il rapporto molare di P2GPN: glycan dovrebbe essere di circa (e non meno) di 17: 1.
2. Tag essiccato N -glycans con 200 ml (50 mg) di SIL o NAT P2GPN reagente. Pipetta su e giù per risospendere glicani secchi. Vortex samples e poi spin down campioni per ~ 5 sec su una centrifuga da banco.
3. Reagire i glicani con il reagente per 3 ore a 56 ° C.
4. Immediatamente passare glicani dal termostato al concentratore a vuoto. Secco a compimento a 55 ° C (3-5 ore).
   NOTA: Questo passaggio spegne la reazione di derivatizzazione; il campione deve essere completamente asciutta per evitare cross-reattività nelle fasi successive.
   NOTA: campioni essiccati, contrassegnati possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di sei mesi.
5. Risospendere tagged N -glycans in 25-50 ml di H ₂ O appena prima analisi LC-MS. Pipetta su e giù per garantire N -glycans sono completamente solubilizzato.
   NOTA: Il volume per risospensione dipende dalla concentrazione iniziale di glicoproteina, che può essere valutato dalla concentrazione proteica di partenza. Tuttavia, la gamma può variare in base alla tipologia del campione e deve essere ottimizzato individualmente.
6. Centrifugare i campioni a 14000 g per 5 min. Rimuovere il supernatant, facendo attenzione a non lasciare che la punta della pipetta toccare il fondo della provetta.
   Nota: tag eccesso può non essere visibile ad occhio, ma sarà ridotto di centrifugazione.
7. Combinare una coppia di campioni NAT e SIL, se desiderato per quantificazione relativa, in un rapporto 1: 1 per l'analisi tandem.

6. ultra-alta pressione cromatografia liquida e la spettrometria di massa Analisi

NOTA: Il LC e MS condizioni descritte per una facile NLC-1000 e un alto campo Q Exactive rispettivamente, sono stati ottimizzati in-house per l'analisi proteomica e per l'analisi dei glicani ^21. Queste condizioni possono essere adattati ad altri sistemi LC alla pressione o nano-ultra-alti e altri spettrometri ad alta risoluzione di massa di potenza, ma possono richiedere lievi modifiche. L'uso di alta risoluzione spettrometria di massa di potenza è necessario per l'identificazione e l'analisi glycan deamidation ^22,23.

NOTA: i passaggi 6,1-6,3 può essere skipped se si utilizzano un adeguato cromatografia in fase inversa o interazione idrofila trappola commerciale e colonna.

1. Sintetizzare un fritta in ID 100 pM capillare secondo Meiring et al. ²⁴ per l'uso come una trappola.
2. Confezione trappola sotto pressione con 2,6 mM, 100 Å, C ₁₈ materiale di imballaggio e tagliato ad una lunghezza di 5 cm.
3. Confezione un colonna ID emettitore 75 pM sotto pressione con 2,6 mM, 100 Å, C ₁₈ materiale di imballaggio e tagliato ad una lunghezza di 30 cm.
4. Preparare due diversi metodi LC-MS per la proteomica (6.4.1) e glicomica (6.4.2) i flussi di lavoro.
   Nota: Proteine ​​e campioni glycan possono essere eseguiti sulla stessa configurazione trappola / colonna in qualsiasi ordine.
   1. Per l'analisi delle proteine, iniettare ~ 400 ng di proteine ​​nella colonna in fase mobile A (MPA). Eseguire il campione a 300 Nl / min, secondo la Tabella 1, con 1 ml di pre-colonna equilibrazione (500 bar) e 5 microlitri colonna analitica equilibrazione(500 bar). Ionizzano proteine ​​nelle condizioni MS forniti in Tabella 2.
   2. Per l'analisi glycan, iniettare 5 ml di risospeso, P2GPN tagged campioni equimolari NAT / SIL sulla colonna. Eseguire l'esempio a 300 Nl / min, secondo la tabella 3, con un 2 ml di pre-colonna di equilibrio (500 bar) e un 5 ml equilibrio colonna analitica (500 bar). Ionizzano glicani alle condizioni MS previste nella tabella 4.

Tempo	% MPA	MPB%
0	100	0
5	98	2
105	80	20
135	68	32
136	5	95
151	5	95
152	100	0
167	100	0

Tabella 1. condizioni LC per l'analisi proteomica. Un eluizione gradiente con fase mobile B (MPB, 98% acetonitrile, 2% H ₂ O, 0,1% acido formico) è stata effettuata per eluire peptidi per la proteomica fucile da caccia, dipendente dai dati di acquisizione , esperimenti MS.

MS 1 Parametri
Range di massa (Th)	375-1500
Risoluzione	120.000
AGC	1 × 10 6
Max di ionizzazione Tempo	30
S-Lens FR livello	55
capillare Temp (° C)	300
Spray tensione	1.75
MS 2 Parametri
acquisizione Tipo	Top20
Risoluzione	15.000
AGC	1 × 10 5
Max di ionizzazione Tempo	30
Rapporto underfill	2%
Isolation Finestra (Th)	1.4
Esclusione stato di carica	+1
Normalizzato Collision Energy	27
Tempo di esclusione (s)	20

Tabella 2: condizioni di MS per l'analisi proteomica I parametri per Elettrospray, MS ¹ di acquisizione, e MS acquisizione ² in uno strumento Orbitrap utilizzando dissociatio alta energia.n (HCD) sono date.

Tempo	% MPA	MPB%
0	95	5
1	70	30
41	60	40
46	37	63
47	10	90
55	10	90
56	95	5
66	95	5

Tabella 3:. Condizioni per l'analisi LC glicani un gradiente di eluizione è stata effettuata per eluire idrazide tagged N -glycans per l'analisi MS.

MS 1 Parametri
Range di massa (Th)	600-1900
Risoluzione	60.000
AGC	5 × 10 5
Max di ionizzazione Tempo	64
S-Lens FR livello	65
Capillare Temp (° C)	325
Spray tensione	1.75
MS 2 Parametri
acquisizione Tipo	Top12
Risoluzione	15.000
AGC	5 × 10 4
Max di ionizzazione Tempo	100
Rapporto underfill	1%
Isolation Finestra (Th)	1.4
Fisso Prima Messa
Scalinata normalizzato Collision Energia	10/20/30
Esclusione Tempo (sec)	15

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Tabella 4: condizioni MS per idrazide tagged N analisi -glycan I parametri per Elettrospray, MS ¹ acquisizione, e l'acquisizione MS ² in uno strumento Orbitrap mediante dissociazione alta energia (HCD) sono date..

7. Proteomica e analisi deamidation

1. Identificare le proteine ​​/ peptidi che utilizzano standard di strumenti di ricerca bioinformatica.
   Nota: Il seguente protocollo di analisi è stato progettato utilizzando i database Swiss-Prot / TrEMBL in UniProtKB e la ricerca tramite SEQUEST nel software Proteome Discoverer 1.4, tuttavia, il protocollo può essere tradotto direttamente a qualsiasi motore di ricerca di proteine ​​e il punteggio utilizzando un software di interfaccia grafica. Tutti i comandi indicati di seguito sono accessibili in interfacce software attraverso i menu a discesa.
   1. Crea o scaricare un database di sequenze di proteine ​​organismo appropriato da dati genomici o database proteoma disponibili come descritto da Apweiler et al. ²⁵
      Nota: i database comuni proteoma includono Swiss-Prot, TrEMBL, e NCBI, ma possono essere costruiti a partire dai dati in-house come bene.
2. All'interno del software, scegliere un motore di ricerca del database e selezionare i parametri in funzione della qualità dei dati acquisiti e la rigorosità della ricerca desiderata, come descritto da Perkins et al. per mascotte ²⁶ o Eng et al. per SEQUEST ^27.
   1. Per i dati di massa elevata precisione, impostare i parametri per la ricerca nel software come segue: max 2 perse fratture, 5 ppm precursore tolleranza di massa, e 0.02 Da frammento tolleranza di massa (per ottimizzare il rilevamento preciso deamidation ²²⁾ e comprendono le seguenti modifiche peptide tryptic : "carbamidomethyl (C)" modifica statico e "deamidation (N / Q)" e "oxidation (M) "modifiche dinamiche. Se si utilizza ¹⁸ O etichettatura digestione, include" deamidation ¹⁸ O (1) ", come una modifica dinamica supplementare.
   2. Search, utilizzando il motore selezionato, i dati grezzi peptide contro il database di proteine ​​(7.1.1).
      Nota: le tolleranze di massa devono essere appropriate per lo strumento utilizzato e non arbitrariamente basso.
      Nota: La funzione di ricerca è completata automaticamente dal software utilizzando algoritmi specifici vari motori di ricerca. L'algoritmo di filtro (MASCOTTE), SEQUEST, o altre combinazioni di algoritmi sono impiegati per identificare le proteine ​​da peptidi e di segnare la validità dei colpi; ulteriori informazioni sugli strumenti disponibili sono coperti in una recensione da Gonzalez-Galarza et al. ^28,29. A seconda del software, può essere necessario selezionato a discrezione dell'utilizzatore parametri di ricerca aggiuntivi.
3. Esportare i peptidi identificati per curation manuale e Fürthanalisi ER.

Curare manualmente un elenco di peptidi contenenti un deamidation identificati sulla asparagina della N -linked motivo glicosilazione (NX (S / T), dove X ≠ P). Cross-convalidare questi siti con noti motivi di glicosilazione dalla letteratura e creare due piscine di risultati (validati e teorica).

Utilizzare il conteggio spettrale ³⁰ per confrontare l'occupazione per cento di un determinato sito di glicosilazione confrontando l'abbondanza di forme deamidati e non deamidati.

8. Glycan quantificazione relativa

Nota: L'identificazione e la quantificazione in seguito è stato completato utilizzando il software Xcalibur. Tuttavia, qualsiasi software che analizza i dati grezzi e automaticamente integra picchi cromatografici possono essere sostituiti.

1. Generare un elenco teorica di composizioni glicani dalle biologicamente possibili combinazioni di esosi, desossi-esosi, esosamine, acidi sialici, e altri saccharides. Per questo scopo, un database glycan umana è stato pubblicato da Walker et al. ¹⁵ e può essere usato così com'è. Per i database teorici, i vincoli biologici specifici per specie devono essere imposti sullo spazio combinatoria, e queste regole sono descritte da Kronewitter et al. ^31.
2. Calcolare le masse monoisotopico glycan (M) dalle masse atomiche per ogni composizione di carica del protone Uniti + 1-3. Modificare le masse monoisotopico per includere l'aggiunta del NAT (254,14,191 mila g / mol) o SIL (260,162,042 mila g / mol) tag P2GPN.
3. Aprire il programma "Setup Processing" dal punto di vista tabella di marcia in Xcalibur. Impostazione di un metodo di lavorazione come esattamente descritto nel materiale supplementare da Walker et al. ¹⁵ utilizzando l'elenco generato nel passaggio 8.2 contenente le masse monoisotopico teorici per la [M + H] ^1+, [M + 2H] ^2+, e [ M + 3H] ³⁺ specie.
   Nota: per confermare l'identità glycan oltre accuratadi massa, per NAT / SIL in fronte-retro viene eseguito, verificare che NAT e SIL N coppie -glycan co-eluire con lo stesso tempo di ritenzione. Qualitativamente, cross-validare identificazioni con gli spettri MS ^2, che deve contenere picchi appartenenti alla serie ossonio ione ^32.
4. Esportare la, cromatogramma ionico estratto integrato (XIC) aree di Excel per ottenere le abbondanze SIL e NAT come esattamente descritto nel materiale supplementare da Walker et al. ¹⁵
5. In Excel, programma le celle di una nuova colonna per calcolare la correzione per la sovrapposizione peso molecolare regolando l'abbondanza SIL secondo l'equazione pubblicato da Walker et al ^{1 5.:}
   ,
   dove A è il picco monoisotopico e la sovrapposizione isotopo teorica, , Può essere calcolato indipendentemente composizione.
6. In una seconda colonna, il programma le cellule per normalizzare i canali NAT e SIL usando l'equazione per il fattore glicani normalizzata totale (TGNF), per spettro, come descritto da Walker et al ^{1 5.:}
   ,
   dove N è il numero di N -glycans sopra del limite di quantificazione.
7. In una nuova colonna, programma le cellule di assorbire il rapporto SIL: glicani NAT (o viceversa) per calcolare la piega-cambiamento nella concentrazione tra i due campioni.

Risultati

Figura 1:. È dato Lo schema del metodo ZANNE-P2GPN codifica idrofobica accoppiato (Metodo A) per combinate proteomica e glycomics analisi passaggi che differiscono tra di lavorazione e tandem glycomics glicomica-only e di analisi proteomica, con l'individuazione dei siti di glicosilazione, sono evidenziati. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

L'in-linea proteomica e glycomics, filtro a base di P2GPN metodo di codifica idrofobica (Metodo A) è stato convalidato per l'identificazione, quantificazione e pregiudizi peso molecolare utilizzando campioni di plasma pool gallina (Figura 1). Per esclusivamente esperimenti glicomica, inter-comparazioni nelle abbondanze di N -glycans estratti con il metodoA Carbograph SPE (gold standard, Metodo B) sono state effettuate (Figura 2). Non ci sono state differenze significative nei abbondanze dei glicani tra i due metodi. La variabilità intra-è stata valutata anche attraverso la quantificazione della SIL: NAT rapporto tra glicani estratte con lo stesso metodo. I log ₂ -distributions di entrambi i metodi erano Gaussiana, centrata sullo zero, e non significativamente diverso (Figura 3A-B). Il peso molecolare compreso tra i due protocolli completamente sovrapposti, suggerendo che il filtro non discrimina N -glycans riferiscono al range di peso molecolare e idrofilicità (Figura 4).

Figura 2: una miscela equimolare di NAT e SIL N -glycans estratto secondo il metodo A o il metodo B è stata preparata da 2,5 ml di plasma gallina (n = 4) I campioni sono stati anale.yzed da UPLC-MS secondo i parametri raccomandati suggeriti nella sezione 6. Le abbondanze per ogni glicani, in ogni canale NAT / SIL, sono stati calcolati integrando l'area sotto il cromatogramma ionico estratto (MMA = 3 ppm), la correzione per il molecolare sovrapposizione peso e regolazione dal TGNF. Questi rapporti sono indicati con i loro errori standard. Le abbondanze di Metodo B: Metodo A N -glycans non erano significativamente differenti (p> 0,05). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Il intra-variabilità nella (A) Metodo A (N = 133) o (B) Metodo B (N = 123) è stata confrontata strategie. NAT e SIL miscele equimolari di N -glycans, dello stesso schema di estrazione, Sono stati analizzati più di tre repliche tecniche. I log ₂ -distributions sono stati centrati sullo zero e non erano significativamente differenti tra i due flussi di lavoro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Gli intervalli di peso molecolare di glicani da ogni strategia stati confrontati. I due flussi di lavoro ha prodotto glicani che attraversa lo stesso intervallo di peso molecolare. N -glycans rilevato in un protocollo contro l'altro è caduto appena sopra il limite di rilevazione (1 × 10 ⁵ abbondanza) e non riflettono distorsione sistematica. Cliccate qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.

(Tabella 5). Il nostro tipico filtro 18 ore basato PNGase F digestione, seguito da FASP tripsina digest (protocollo Std) ha portato a livelli significativi di deamidation non specifici, che possono interferire con l'identificazione di glycosites. Pertanto, un metodo che utilizza un tempo di incubazione più breve ad elevata temperatura (50 ° C) ed una fase picco-in PNGase F (SPI protocollo) è stato esplorato in alternativa, con un protocollo di digestione a microonde (protocollo MD), per ridurre al minimo non deamidation specifica. I glicani osservati nei nuovi metodi di digestione non erano significativamente differenti in composizioni o abbondanze dallo standard 18 ore, 37 ° C filtro PNGase F digest ( (Tabella 5).

		proteine					peptidi					Peptidi Deamidated					Glycosites					glicoproteine
		+		-			+		-			+		-			+		-			+		-
FASP								3083					795					5					5
18hr		217		304			6013		5086			1029		733			257		24			112		18
MD		270		266			5190		5125			465		455			254		8			102		7
SPI		281		288			4729		4482			602		573			232		10			145		8

. Tabella 5: confronto dei dati di proteomica da un tripsina standard di digerire rispetto al metodo di codifica in linea ZANNE-P2GPN sono stati fatti i preparativi sono stati eseguiti con (+) e senza (-) PNGase F per determinare i tassi di non-specifica deamidation e stima di fondo glycosite tassi di falsi positivi. Le proteine ​​sono state identificate con 1% false discovery rate (FDR); peptidi sono stati filtrati in base a "alto" fiducia peptide in Proteome Discoverer 1.4 (q <0.01); glycosites sono stati identifiEd in base a sequenze uniche che contengono deamidation del motivo glicosilazione conservata (NXS / T); e glicoproteine ​​sono stati definiti come proteine ​​identificate contenenti almeno un glycosite identificato.

Figura 5: accorciato protocolli per glicani sono stati sviluppati per ridurre al minimo deamination nei campioni e rispetto al 18hr ZANNE PNGase F digest. Le differenze medie di abbondanze erano il 10% e il 5% per il MD (2.2.3) e (2.2.2) protocolli SPI, rispettivamente. Dei 48 glicani individuati, il 90% appare meno variazione di 1,5 volte. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Sono necessari metodi quantitativi ad alto rendimento per facilitare l'analisi di routine dei glicani. Negli ultimi trent'anni, l'analisi della glicomica è stata limitata a un sottoinsieme di gruppi di ricerca, nonostante la sua importanza nelle malattie, nelle applicazioni cliniche e nei prodotti farmaceutici. Il metodo di purificazione e marcatura FANGS-P2GPN per glicomica e proteomica esegue la stessa analisi su una singola aliquota di campione, riducendo il costo delle forniture e la quantità di materiale necessario (particolarmente importante negli studi sull'uomo e sui topi). Inoltre, gli sforzi per ridurre al minimo la variabilità nelle preparazioni sono di fondamentale importanza, poiché ogni passaggio aggiuntivo contribuisce all'errore, mascherando potenzialmente cambiamenti importanti ma poco abbondanti negli studi caso-controllo. L'accoppiamento di FANGS alla marcatura idrofobica dell'idrazide consente di eseguire campioni di proteine e glicani sulla stessa colonna RPLC, migliora la ionizzazione dei glicani, fornisce una quantificazione relativa e può essere applicato quantitativamente al plasma.

Per l'analisi degli N-glicani, è fondamentale utilizzare il livello suggerito di PNGasi F per ottenere la completa deglicosilazione. Sebbene i glicani siano esposti ai solventi, la denaturazione delle proteine e l'eccesso di enzimi aiutano a garantire una scissione efficiente e completa. Per una quantificazione accurata dei glicani, è necessario assicurarsi che siano completamente essiccati dopo la derivatizzazione per estinguere la reazione e prevenire reazioni crociate quando si mescolano le specie NAT e SIL. Infine, quando si estende il flusso di lavoro all'analisi dei glicositi, la tempistica dei passaggi è fondamentale per ridurre al minimo la deamidazione non specifica. I protocolli modificati previsti per l'analisi combinata di glicomica e proteomica funzionano in modo coerente se eseguiti di conseguenza.

Il flusso di lavoro consente di ottenere un'accurata quantificazione relativa degli N-glicani dal plasma rispetto al metodo SPE gold standard. Non vi è alcuna distorsione apparente nei tipi di glicani estratti in termini di peso molecolare, idrofilia e struttura composizionale. Sebbene non abbiamo esplorato l'analisi qualitativa dei glicani legati all'O, ci aspettiamo che le FANGS possano accogliere l'aggiunta di una fase di eliminazione β dopo la digestione della PNGasi F dei glicani legati all'N. Tuttavia, le procedure richiederebbero modifiche significative per la pulizia dei reagenti prima della spettrometria di massa e l'analisi dei peptidi ne risentirà in modo significativo. Per la proteomica, si ottiene la stessa profondità di copertura del proteoma rispetto ai metodi FASP tradizionali. È importante sottolineare che i metodi raggiungono un tasso minimo di false scoperte per la deamidazione di N-glicano. Sebbene il metodo sia compatibile con la marcatura ^{con 18}O di Asn durante la fase di digestione PNGasi^22,23, il basso tasso di falsa scoperta del sito di glicosilazione suggerisce che potrebbe non essere necessario, riducendo ulteriormente i costi e la complessità.

Il proteoma non è arricchito per le glicoproteine in questo metodo, il che presenta sia vantaggi che svantaggi. Alcune glicoproteine a basso contenuto di abbondanza possono non essere rilevate nell'analisi. Tuttavia, l'occupazione di siti glicosilati per proteina può essere confrontata tra campioni biologici. Inoltre, vengono eliminati l'errore e la distorsione introdotti dalla purificazione dell'affinità delle lectine o dall'arricchimento chimico. In conclusione, l'accoppiamento di FANGS alla normalizzazione dell'individualità durante la marcatura con la strategia dei tag con glicano idrazide si traduce in un metodo semplificato, quantitativo e ad alto rendimento per l'analisi tandem del glicoma e del proteoma con un grande potenziale per l'applicazione in studi clinici caso-controllo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido acetico (50%)	Sigma Aldrich	45754
Acetonitrile, grado HPLC	Burdick & Jackson	AH015-4
Bicarbonato di ammonio	Sigma Aldrich	A6141
Reagente Bradford	Sigma Aldrich	B6916	Alternativa: Kit acido bicinconinnico (Sigma Aldrich BCA1)
Cloruro di calcio	Sigma Aldrich	Centrifuga C1016
Eppendorf		5804 R	Le centrifughe alternative che raggiungono i 14.000 x g sono adatte
DL-Ditiotreitolo, 1  M in soluzione	Sigma Aldrich
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	Alternate nano o ultra high pressure LC produrranno dati simili, come ad esempio: 1. Dionex UltiMate 3000 LC (Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC (Acque).
Portaprovette galleggiante	TedPella	20831-20
Fetuin	New England Biolabs	P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Forni da laboratorio	Fisher Scientific	11-690-625F	Incubatori alternativi che raggiungono i 56  ° C sono adatti
Acido Formico	Sigma Aldrich	56302
GE Forno a microonde General	Electric	57B5 E82904	Qualsiasi forno a microonde con impostazioni di potenza regolabili è adatto
INLIGHT Glycan Tagging Kit	Cambridge Isotope Laboratories	GTK-1000	Il kit INLIGHT fornisce le versioni NAT e SIL del reagente P2GPN.
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 fase stazionaria di massa	Phenomenex	Alternativa ai supporti sfusi	: Qualsiasi C18 fase stazionaria 5
mM Mascot Daemon Software e Server	Matrix Science		Alternativa: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Metanolo, grado HPLC	Burdick & Jackson	AH230-4
PicoFrit Colonna autoimballante: 360  μ m, OD 75  μ m ID, 15  μ punta m, non rivestita, 5 per scatola, 50 cm	Nuovo obiettivo	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (senza glicerolo), 75.000  unità/ml	New England BioLabs	P0705L
Q Spettrometro di massa ibrido HF exattivo quadrupolo-orbitrap	Thermo Scientific		Precisione di massa alternata (5  ppm) forniranno dati simili
RNasi B	New England Biolabs	P7817S
Tripsina dal pancreas suino	Sigma Aldrich	T6567-5X
Urea	Sigma Aldrich	51456
Concentratore a vuotoSavant SPD131DDA Concentratore SpeedVac	Thermo Scientific	SPD131DDA	I concentratori a vuoto alternativi sono adatti
Filtri Vivacon 500 30 kDa	Sartorius Stedim Biotech	VN01H22	alternativa: unità filtranti centrifughe Amicon Ultra 0.5 con Ultracel-10  Membrana kDa (Millipore UFC501096)
Acqua, grado HPLC	Burdick & Jackson	AH365-4
Acqua, 18O	Cambridge Isotope Laboratories	OLM-240-97-1	L'aggiunta di 18O nella fase di digestione PNGase F è facoltativa e potrebbe non essere necessaria per gli studi di deamidazione completati con un'affidabilità del 95%
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit	Merck Millipore	693030