Isolamento, caratterizzazione e esame funzionale della cella di rete gengivale immunitario

Summary

Abbiamo stabilito una tecnica per l'isolamento, la caratterizzazione fenotipica e analisi funzionale di cellule immuni dalla gengiva murino.

Abstract

Le reti di cellule immunitarie nei tessuti svolgono un ruolo vitale nel mediare l'immunità locale e nel mantenere l'omeostasi dei tessuti, ma si sa poco delle popolazioni di cellule immunitarie residenti nella mucosa orale e nella gengiva. Abbiamo messo a punto una tecnica per l'isolamento e lo studio delle cellule immunitarie dai tessuti gengivali murini, un'area di costante esposizione microbica e un sito vulnerabile a una comune malattia infiammatoria, la parodontite. Il nostro protocollo consente una caratterizzazione fenotipica dettagliata delle popolazioni di cellule immunitarie residenti nella gengiva, anche allo stato stazionario. La nostra procedura produce anche un numero sufficiente di cellule con un'elevata vitalità per l'uso in studi funzionali, come la valutazione della secrezione di citochine ex vivo. Questa combinazione di caratterizzazione fenotipica e funzionale della rete di cellule immunitarie gengivali dovrebbe aiutare a studiare i meccanismi coinvolti nell'immunità orale e nell'omeostasi parodontale, ma farà anche progredire la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nell'immunopatologia locale.

Introduction

Tessuti gengivali circondano la dentatura murino e umano e sono costantemente esposti al complesso biofilm del dente ^1. La rete di cellule immunitarie sorvegliare la barriera gengivale è fondamentale per mantenere l'integrità del tessuto, garantendo omeostasi con i microbi commensali locali e, al tempo stesso, assicura immunità efficace contro sfida patogenicità ^2. Per raggiungere l'omeostasi, il sistema immunitario è attentamente su misura per l'ambiente gengivale creazione di una rete di cellule immunitarie altamente specializzato, ma piccolo dettaglio si sa delle popolazioni di cellule immunitarie gengivali e il loro ruolo nel man....

Protocol

Tutte le procedure sperimentali descritte in questo protocollo seguite le linee guida necessarie e sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, NIDCR / NIH.

1. preparare in anticipo

1. Preparare supporti Completa: RPMI integrato con 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e il 10% FBS.
2. Preparare supporti DNase: 50 ml di media RPMI con 7,5 mcg DNasi (Fai fresca, tenere in ghiaccio in ogni momento).
3. Preparare supporti Collagenasi-DNasi: 5 ml di media DNasi oltre 3,2 mg / ml di Collagenasi di tipo IV (Fai fresca, tenere in ghiaccio in ogni momento).
4. Pr....

Results

Per illustrare l'applicazione del protocollo, si mostra risultati rappresentativi esaminando la rete delle cellule immunitarie nella gengiva di topi con e senza parodontite (WT vs LFA ^{- / -,} Figura 2a - C). FACS Rappresentante grafici mostrano le cellule CD45 ⁺ ematopoietiche dal vivo nella gengiva (Figura 2A, 2C). L'isolamento e la trasformazione delle cellule immunitarie con questo protocollo rend.......

Discussion

L'attuale tecnica produce con successo un gran numero di cellule immunitarie (da un singolo mouse) adatto, non solo per la caratterizzazione fenotipica, ma anche per studi funzionali ex vivo. Un altro gruppo aveva già pubblicato un protocollo per isolare e caratterizzare le cellule immunitarie murino gengivali e ha introdotto il valore di usare multicolore citometria a flusso nello studio di parodontite in modelli animali ^9. A seguito di una notevole risoluzione dei problemi della modifica chiave.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forbici fini	Strumenti per la scienza fine	14058-11
Manico per bisturi #3	Strumenti per la scienza fine	10003-12
Lame per bisturi #10	Strumenti per la scienza fine	10010-00	Pinze sterili
per schegge	Integra Miltex	6-304
Aghi con smusso regolare	BD Medical	305109	27 G, lunghezza 12,7 mm
Siringhe monogetto	Covidien	8881513934	punta Luer-lock, 3 ml
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Senza calcio e magnesio
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Senza L-glutammina
DNasi I da pancreas bovino	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Collagenasi di tipo IV	Gibco (di Life technologies)	17104-019
Fetale Siero Bovino	Gemini Bio-prodotti	100-106
Gentamicina 50 mg/ml	Biologico di qualità	120-098-661EA
Pen Strep	Gibco (di Life technologies)	15140-122
L-Glutammina	Gibco (di Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Qualità biologica	351-027-721EA
Provette da 50 ml	Corning	352070	Polipropilene, sterile
70 μ Filtri cellulari M	Corning	352350
Piastre di Petri	Corning	351029
Provette FACS sterili da 5 ml	Corning	352052
Sterile BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Contiene brefeldina A soluzione
Phorbol 12-Myristate 13-Acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Ionomicina Calcio Sale	Sigma-Aldrich	13909
Saponina dalla corteccia di quillaja	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Kit di macchie di cellule morte Aqua riparabile	Life Technologies	L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-Topo gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-Topo IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-Topo IFN-γ PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-Topo NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-Topo CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-Topo CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-Topo CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-Topo CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-topo CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-topo TCR beta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-topo Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-topo Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104