Isolamento, caratterizzazione e esame funzionale della cella di rete gengivale immunitario

Summary

Abbiamo stabilito una tecnica per l'isolamento, la caratterizzazione fenotipica e analisi funzionale di cellule immuni dalla gengiva murino.

Abstract

Le reti di cellule immunitarie nei tessuti svolgono un ruolo vitale nel mediare l'immunità locale e nel mantenere l'omeostasi dei tessuti, ma si sa poco delle popolazioni di cellule immunitarie residenti nella mucosa orale e nella gengiva. Abbiamo messo a punto una tecnica per l'isolamento e lo studio delle cellule immunitarie dai tessuti gengivali murini, un'area di costante esposizione microbica e un sito vulnerabile a una comune malattia infiammatoria, la parodontite. Il nostro protocollo consente una caratterizzazione fenotipica dettagliata delle popolazioni di cellule immunitarie residenti nella gengiva, anche allo stato stazionario. La nostra procedura produce anche un numero sufficiente di cellule con un'elevata vitalità per l'uso in studi funzionali, come la valutazione della secrezione di citochine ex vivo. Questa combinazione di caratterizzazione fenotipica e funzionale della rete di cellule immunitarie gengivali dovrebbe aiutare a studiare i meccanismi coinvolti nell'immunità orale e nell'omeostasi parodontale, ma farà anche progredire la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nell'immunopatologia locale.

Introduction

Tessuti gengivali circondano la dentatura murino e umano e sono costantemente esposti al complesso biofilm del dente ^1. La rete di cellule immunitarie sorvegliare la barriera gengivale è fondamentale per mantenere l'integrità del tessuto, garantendo omeostasi con i microbi commensali locali e, al tempo stesso, assicura immunità efficace contro sfida patogenicità ^2. Per raggiungere l'omeostasi, il sistema immunitario è attentamente su misura per l'ambiente gengivale creazione di una rete di cellule immunitarie altamente specializzato, ma piccolo dettaglio si sa delle popolazioni di cellule immunitarie gengivali e il loro ruolo nel mantenimento del tessuto immunità ^2.

Quando l'omeostasi immunitaria è interrotta alla gengiva, sia attraverso una maggiore suscettibilità dell'ospite e / o la presenza di comunità microbiche disbiosico, una condizione infiammatoria, la parodontite si pone ^{3 4.} La parodontite è una malattia infiammatoria comune, con conseguente perdita del dente sstrutture upporting. Nelle sue forme più gravi si è visto in circa il 10% della popolazione generale ^5. Analisi dei fattori chiave coinvolti nella predisposizione e nella progressione della parodontite si è dimostrato difficile ^6. Tuttavia, i modelli animali sono stati estremamente utili per la comprensione dei meccanismi di iniziazione parodontite e la progressione ^7. I modelli possono essere utilizzati per definire le popolazioni di cellule chiave e mediatori molecolari che sono vitali per il mantenimento dell'omeostasi immunitario e lo sviluppo di auto di periodontite. Tale intuizione trasformerà la nostra comprensione di controllo specifico-gengiva di omeostasi immunitaria e ulteriormente la nostra attuale comprensione della patogenesi della malattia.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali descritte in questo protocollo seguite le linee guida necessarie e sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, NIDCR / NIH.

1. preparare in anticipo

1. Preparare supporti Completa: RPMI integrato con 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e il 10% FBS.
2. Preparare supporti DNase: 50 ml di media RPMI con 7,5 mcg DNasi (Fai fresca, tenere in ghiaccio in ogni momento).
3. Preparare supporti Collagenasi-DNasi: 5 ml di media DNasi oltre 3,2 mg / ml di Collagenasi di tipo IV (Fai fresca, tenere in ghiaccio in ogni momento).
4. Pre-cool tampone FACS: 0,5% FBS diluito in PBS.
5. centrifuga pre-raffreddare a 4 ° C.
6. Warm agitatore incubatore a 37 ° C.

2. Isolamento, Dissection, e l'isolamento delle cellule da gengivali Blocks

1. Euthanize topi esponendo loro di _CO 2 in una camera adeguata, secondo le linee guida ARAC.
2. Aprire la cavità toracica e addominale per esporre il cuore e gli organi interni. Per profumato, fare un'incisione nella vena cava inferiore e profumato 3 ml di PBS attraverso il ventricolo sinistro utilizzando una siringa da 3 ml con un ago 27 G.
3. Immobilizzare il corpo e la testa del mouse su un blocco con lo stomaco rivolto verso l'alto.
4. Tagliare ogni commessura del labbro verso il collo con le forbici, separando la pelle che copre la mandibola e collo regione, esponendo i tessuti sottostanti e muscoli. Sezionare il labbro inferiore per scoprire la mandibola.
5. Tagliare tra gli incisivi inferiori per separare entrambi i lati della mandibola e immobilizzare ogni lato per accedere alla cavità orale.
6. Visualizzare e sezionare il palato lontano dalla cavità nasale.
7. Sezionare aree utilizzando una lama di 10 e comprendono aree molari mascellari e mandibolari con circostante gengiva (Figura 1). Fare incisioni verticali appena anteriore al primo molare e posteriore per il terzo molare e una incisione orizzontaleil bordo della gengiva (colletto bianco del tessuto denti circostanti).
8. Posizionare il mascellare e mandibolare blocchi in un tubo da 50 ml con 5 ml Collagenasi / DNasi (tenere in ghiaccio).
9. Incubare in un incubatore shaker a 37 ° C per 1 ora e durante gli ultimi 5 min di incubazione aggiungere 50 ml di 0,5 M EDTA.
10. Aggiungere 5 ml di media DNasi freddo per il tubo da 50 ml con i tessuti e mescolare delicatamente per mescolare.
11. Trasferire i 4 blocchi di tessuto in una capsula di Petri e coprire con 500 ml di DNasi media. Rimuovere gengiva da ciascun blocco di tessuto, utilizzando un bisturi e indicando la lama nelle aree gengivali e interdentali.
12. Trasferire i tessuti e il supporto dalla capsula di Petri, nonché i mezzi di DNasi precedenti utilizzate durante la dissezione, in un tubo da 50 ml attraverso il filtro cella (70 micron dimensioni). Lavare con supporti DNasi (3-5 ml) tutti gli strumenti utilizzati e filtro.
13. Utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da 3 ml, schiacciare il tessuto contro il filtro,filtraggio con i media DNasi fredda (da 30 a 35 ml).
14. Lavare il filtro cella con i media DNasi freddo.
15. Centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 6 min.
16. Eliminare il surnatante, risospendere in 1 ml di completo media.
17. Contare le cellule (la quantità prevista dovrebbe variare tra 8 x ¹⁰ 5 1,2 x 10 ⁶ cellule con una vitalità> 80%) usando un contatore automatico di cellule.

3. Stimolazione e FACS colorazione delle cellule gengivali

1. Stimolare la sospensione cellulare singola con PMA (50 ng / ml) e Ionomicina (2,5 mcg / ml) in presenza di 1 microlitri / ml di brefeldin A.
2. Incubare per 3,5 ore a 37 ° C e 5% CO _2.
3. Spin giù e lavare con PBS e centrifugare a 4 ° C; 314 xg per 6 min.
4. Macchiare le cellule utilizzando una macchia vitalità seguendo le istruzioni del produttore.
5. Stain di marcatori extracellulari (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ o formicaibodies di scelta) a seguito le istruzioni del produttore.
6. Lavare le cellule con tampone a freddo FACS e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min.
7. Delicatamente vortice di disturbare il pellet.
8. Fissare le cellule con paraformaldeide al 2% per 20 min a temperatura ambiente.
9. Lavare le cellule con tampone freddo FACS, centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min e colorare per citochine intracellulari.
   1. Riempire i tubi FACS con una soluzione di fredda saponina 0,5% diluito in tampone FACS e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min.
   2. Aggiungere 300 pl di soluzione di saponina 0,5% ai tubi FACS, incubare per 15 minuti al buio a 4 ° C e quindi si centrifuga a 4 ° C, 314 xg per 5 min.
   3. Colorare le cellule per markers intracellulari (IL-17A e IFNγ o citochine di scelta) seguito le istruzioni del produttore. Lavare le cellule con soluzione di saponina 0,5% e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min.
   4. Lavare nuovamente con FACSbuffer e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min.
   5. Risospendere le cellule in 300 ml di tampone FACS.
10. Analizzare i risultati su un citometro di flusso.

4. Flusso Analisi Citometria

1. Visualizzare le cellule da analizzare in avanti (FSC) e side scatter (SCC) e porta ad escludere detriti.
2. Selezionare le celle singole con zona forward scatter (FSC-A) vs. altezza parametri (FSC-H).
3. Cellule gate che sono in diretta (come indicato dalla redditività colorazione) e positiva per il marcatore ematopoietiche CD45 ⁺ per ulteriori analisi (Figura 2A e 2C).
4. Continuare analisi di marcatori specifici come mostrato in Figura 2 e Figura 3.

Results

Per illustrare l'applicazione del protocollo, si mostra risultati rappresentativi esaminando la rete delle cellule immunitarie nella gengiva di topi con e senza parodontite (WT vs LFA ^{- / -,} Figura 2a - C). FACS Rappresentante grafici mostrano le cellule CD45 ⁺ ematopoietiche dal vivo nella gengiva (Figura 2A, 2C). L'isolamento e la trasformazione delle cellule immunitarie con questo protocollo rend...

Discussion

L'attuale tecnica produce con successo un gran numero di cellule immunitarie (da un singolo mouse) adatto, non solo per la caratterizzazione fenotipica, ma anche per studi funzionali ex vivo. Un altro gruppo aveva già pubblicato un protocollo per isolare e caratterizzare le cellule immunitarie murino gengivali e ha introdotto il valore di usare multicolore citometria a flusso nello studio di parodontite in modelli animali ^9. A seguito di una notevole risoluzione dei problemi della modifica chiave...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forbici fini	Strumenti per la scienza fine	14058-11
Manico per bisturi #3	Strumenti per la scienza fine	10003-12
Lame per bisturi #10	Strumenti per la scienza fine	10010-00	Pinze sterili
per schegge	Integra Miltex	6-304
Aghi con smusso regolare	BD Medical	305109	27 G, lunghezza 12,7 mm
Siringhe monogetto	Covidien	8881513934	punta Luer-lock, 3 ml
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Senza calcio e magnesio
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Senza L-glutammina
DNasi I da pancreas bovino	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Collagenasi di tipo IV	Gibco (di Life technologies)	17104-019
Fetale Siero Bovino	Gemini Bio-prodotti	100-106
Gentamicina 50 mg/ml	Biologico di qualità	120-098-661EA
Pen Strep	Gibco (di Life technologies)	15140-122
L-Glutammina	Gibco (di Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Qualità biologica	351-027-721EA
Provette da 50 ml	Corning	352070	Polipropilene, sterile
70 μ Filtri cellulari M	Corning	352350
Piastre di Petri	Corning	351029
Provette FACS sterili da 5 ml	Corning	352052
Sterile BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Contiene brefeldina A soluzione
Phorbol 12-Myristate 13-Acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Ionomicina Calcio Sale	Sigma-Aldrich	13909
Saponina dalla corteccia di quillaja	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Kit di macchie di cellule morte Aqua riparabile	Life Technologies	L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-Topo gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-Topo IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-Topo IFN-γ PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-Topo NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-Topo CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-Topo CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-Topo CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-Topo CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-topo CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-topo TCR beta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-topo Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-topo Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104