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Articolo metodologico

Ex vivo dal vivo Imaging di polmone metastasi e il loro micro

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⸱

DOI:

10.3791/53741

⸱

3 febbraio 2016

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, University of California, 2Hubrecht Institute-Royal Dutch Academy of Science and University Medical Center Utrecht, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un metodo relativamente semplice per ex vivo l'imaging dal vivo del tumore interazioni cellula-stroma all'interno di metastasi polmonari, utilizzando i reporter fluorescenti nei topi. Utilizzando la microscopia confocale spinning-disk, questa tecnica consente la visualizzazione di cellule vive per almeno 4 ore e potrebbe essere adattato per studiare altre malattie polmonari infiammatorie.

Abstract

Metastasi è una delle principali cause di morbilità e mortalità per cancro. Metastasi è un processo a più fasi e causa della sua complessità, le esatte processi cellulari e molecolari che regolano la diffusione e la crescita metastatica sono ancora sfuggente. Immagini dal vivo permette la visualizzazione delle interazioni dinamiche e spaziali delle cellule e il loro microambiente. I tumori solidi comunemente metastasi ai polmoni. Tuttavia, la posizione anatomica dei polmoni rappresenta una sfida per l'imaging intravitale. Questo protocollo fornisce un metodo relativamente semplice e veloce per ex vivo l'imaging dal vivo delle interazioni dinamiche tra le cellule tumorali e la loro stroma circostante all'interno di metastasi polmonari. Utilizzando questo metodo, la motilità delle cellule tumorali, nonché le interazioni tra cellule tumorali e cellule stromali nel loro microambiente possono essere visualizzati in tempo reale per diverse ore. Utilizzando topi transgenici reporter fluorescente, una linea cellulare a fluorescenza, iniettabili fluorescentemolecole e / o anticorpi, componenti multipli del microambiente polmonare possono essere visualizzati, come i vasi sanguigni e cellule immunitarie. Per immagine diversi tipi cellulari, è stato usato un disco rotante microscopio confocale che permette a lungo termine di imaging continuo con acquisizione delle immagini rapida, a quattro colori. filmati time-lapse compilati da immagini raccolte su più posizioni e piani focali mostrano le interazioni tra metastatico dal vivo e le cellule immunitarie per almeno 4 ore. Questa tecnica può essere ulteriormente utilizzato per testare chemioterapia o terapia mirata. Inoltre, questo metodo potrebbe essere adattato per lo studio di altre patologie polmonari correlati che possono influenzare il microambiente polmonare.

Introduzione

L'aspetto più letale del cancro sono le metastasi, che rappresentano oltre il 90% della morbilità e della mortalità correlate al cancro1. La metastasi è un processo a più fasi e, a causa della sua complessità, gli esatti meccanismi cellulari e molecolari che governano la disseminazione e la crescita metastatica sono ancora sfuggenti. Per metastatizzare, le cellule tumorali nel tumore primario devono staccarsi dalle cellule vicine e dalla membrana basale, attraversare la matrice extracellulare, intravasare, viaggiare attraverso vasi sanguigni o linfatici, stravasare nel sito secondario e, infine, sopravvivere e stabilire tumori secondari. Oltre alle proprietà delle cellule tumorali, il contributo del microambiente, che include lo stroma adiacente insieme alle controparti normali delle cellule tumorali, è cruciale per la semina e l'instaurazione delle lesioni metastatiche2.

I metodi tradizionali per studiare la semina metastatica e la crescita esaminano gli stati statici, poiché i tessuti vengono asportati e sezionati per l'istologia. Questi dati generano solo un'istantanea di questo processo altamente dinamico. Sebbene da questi studi si possano ottenere alcune informazioni utili, il complicato processo attraverso il quale le cellule tumorali e stromali interagiscono durante la formazione metastatica non può essere adeguatamente valutato con questi metodi. Inoltre, non è possibile ottenere informazioni sui modelli di migrazione del tumore o delle cellule stromali, che sono importanti per stabilire una colonia nel sito distante. Per studiare efficacemente il processo metastatico, è essenziale visualizzare le varie interazioni tra le cellule tumorali e il loro microambiente in modo continuo e in tempo reale.

Il polmone è un sito comune per metastasi da tumori solidi come cancro al seno, al colon-retto, al pancreas, al melanoma e al sarcoma3. L'imaging intravitale è stato precedentemente utilizzato per studiare l'interazione cellula-cellula in vari modelli tumorali primari e metastatici4,5. I metodi di imaging polmonare nei topi, tra cui l'imaging intravitale, l'imaging della sezione polmonare e un test di metastasi polmonare ex vivo sono stati pubblicati6-9. L'imaging intravitale dei polmoni di topo utilizza una finestra di aspirazione toracica per stabilizzare i polmoni6. Questo metodo viene utilizzato per l'imaging time-lapse della microcircolazione polmonare e degli spazi alveolari. La posizione anatomica dei polmoni rappresenta una sfida per l'imaging intravitale. Per accedere ai polmoni, la cavità toracica deve essere aperta, il che porta alla perdita di pressione negativa e al collasso dei polmoni. Questo metodo consente la visualizzazione solo di una piccola parte dei polmoni ed è tecnicamente impegnativo; Una complicanza inutile negli studi che esaminano i processi indipendenti dal flusso sanguigno. Inoltre, questo metodo richiede anche l'eliminazione del movimento causato dalla respirazione. Questo viene fatto raccogliendo immagini tra i respiri o durante le analisi successive all'acquisizione delle immagini10. L'imaging alternativo ex vivo della sezione polmonare fornisce stabilità e profondità e prepara anche il parenchima polmonare per l'immunocolorazione7. Tuttavia, il lungo processo di sezionamento porta a un notevole ritardo tra il momento del sacrificio animale e l'inizio della sessione di imaging. Inoltre, il processo di sezionamento di un polmone di topo provoca una notevole quantità di morte cellulare8, interferendo così con la qualità e la quantità dei campioni di imaging e forse alterando inutilmente le interazioni tumore-stroma. Al fine di creare un ponte tecnico tra i metodi di imaging intravitale e l'imaging della sezione polmonare, sfruttando al contempo i vantaggi delle due tecniche, è stato sviluppato un metodo relativamente veloce e semplice per l'imaging polmonare ex vivo. Questo metodo è stato ottenuto mediante imaging di lobi polmonari interi non sezionati. Utilizzando questo metodo, la motilità delle cellule tumorali e le interazioni tra le cellule tumorali e le cellule stromali nel loro microambiente possono essere visualizzate in tempo reale per diverse ore.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte devono essere eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui l'approvazione preventiva della Istituzionale Cura locali animali e del Comitato Usa (IACUC).

1. Generazione di polmone metastasi per ex vivo l'imaging dal vivo (transgenico o la coda Vein Injection)

NOTA: metastasi polmonari possono essere generati utilizzando modelli murini geneticamente o per via endovenosa (ev) delle cellule tumorali.

  1. Generare metastasi polmonari per l'imaging attraversando un modello murino di tumore geneticamente modificato in un topo giornalista transgenico, ad esempio, si attraversa il cancro al seno modello di topo, mouse virus tumore mammario lunga terminal repeat-polyoma mezzo T antigene (MMTV-PyMT) 11 in ACTB-ECFP modello di topo 12.
    NOTA: Il modello ACTB-ECFP esprime migliorato proteina fluorescente ciano (ECFP) sotto il β-actnel promotore in modo tale che tutte le cellule fluorescenti nel blu, il canale PCP. Tuttavia, le cellule tumorali sono di gran lunga i più importanti e appaiono come una massa di cellule ECFP-positive al microscopio. Il modello di topo MMTV-PyMT sviluppa una malattia progressiva, in cui la crescita del tumore mammario è associata con la diffusione delle cellule tumorali alla periferia, soprattutto ai polmoni. Nei topi MMTV-PyMT sul FVB / n sfondo, micrometastasi possono osservare intorno 10-11 settimane di età. In generale, questi progressi macrometastasi a circa 14 settimane di 13 anni.
    O
  2. Generare metastasi sperimentali utilizzando cellule primarie o linee cellulari singenici. Utilizzare nelle cellule tumorali in vitro primaria manipolato o linee cellulari (ad es., Trasduzione) seguito da iniezione endovenosa 14.
    1. In breve, in questo protocollo, iniettare una proteina fluorescente verde (GFP) esprimente (+) linea cellulare MMTV-PyMT in topi fluorescenti Reporter (ACTB-ECFP) o di tipo selvatico mice. Poi,visualizzare queste cellule denominate cellule VO-PyMT 15 utilizzando il verde, il canale GFP.
      NOTA: La linea cellulare originale VO-PyMT è stato derivato al Vanderbilt Ortopedia a Nashville, TN. VO acronimo di Vanderbilt Ortopedia.
    2. Dopo l'iniezione di 10 6 cellule (in 200 microlitri), osservare stravaso cellula tumorale immediatamente e fino a poche ore dopo l'iniezione; osservare micrometastasi tra 1-3 settimane dopo l'iniezione e rilevare macrometastasi 3 settimane dopo l'iniezione 15.
      NOTA: minor numero di cellule possono essere iniettati per prolungare il tempo di iniezione per la crescita metastatica.

2. L'etichettatura dei componenti di interesse per il metastatico Microenvironment (transgenici e / o iniettabili)

NOTA: etichettatura può essere ottenuto topi transgenici e / o vari iniettabili. Assicurarsi di utilizzare i colori fluorescenti diversi per l'etichettatura dei vari tipi di cellule.

  1. componenti Label del microambiente metastatico utilizzando topi transgenici. Attraversate il modello di tumore del mouse precedentemente menzionato (ad es., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) in un modello di topo transgenico in cui le cellule stromali di interesse sono etichettati da una proteina fluorescente che non è ECFP, ad es., C-fms-EGFP 4,16.
    NOTA: Oltre alla visualizzazione delle cellule tumorali nel canale PCP, questo permette la visualizzazione di cellule mieloidi nel canale GFP 4.
    E / O
  2. Etichettare i vari componenti del microambiente metastatico utilizzando iniettabili in topi transgenici reporter fluorescente o topi di tipo selvatico (non fluorescenti).
    NOTA: Diversi composti può essere iniettato per etichettare vari componenti del microambiente metastatico, ad esempio, un AF647-coniugato Gr-1 anticorpo viene qui utilizzato per etichettare neutrofili e sono utilizzati alcuni monociti 13 e diversi destrani peso molecolareper etichettare capillari polmonari. Per la preparazione di questi iniettabili vedere il punto 4.

3. Preparazione dei Materiali prima della dissezione

  1. 2% agarosio
    1. Pesare 0,2 g di agarosio ed aggiungere a 10 ml 1 x PBS. Riscaldare la soluzione per sciogliere l'agarosio. Agarose solidificherà a RT, quindi mantenerlo a bagnomaria C 37 ° fino utilizzato per il riempimento.
  2. CO 2 e regolatore di temperatura
    1. Controllare DDH 2 O nella camera di umidificazione. Riempire quando necessario. Inserire piastra di configurazione nel portatarga fase temperatura (camera climatica). Accendere il controller di CO 2 e impostare CO 2 al 5%. Assicurarsi che la portata d'aria è fissato a 0,4 Nl / min.
    2. Aprire l'aria e CO 2 valvole. Accendere il regolatore di temperatura. Assicurarsi che la temperatura della camera climatica e il coperchio sono fissati a 37 ° C.
    3. Scaricare la pressione dell'aria sul CO 2 metri. Controllare CO 2 in aumento, equilibration può richiedere fino a 30 min.
  3. Spinning disco microscopio confocale
    NOTA: I dettagli del microscopio set-up sono stati precedentemente descritti 4,17.
    1. Attivare i laser (laser argon 488 nm di eccitazione e lo stato solido 405 nm, 561 nm e 640 nm laser). Accendere il microscopio, la telecamera, l'unità di controllo disco rotante, la AOTF, l'unità di controllo laser e il controllore fotocamera.
    2. Aprire l'otturatore microscopio, accendere il computer che esegue il microscopio e aprire il software.
  4. Preparazione degli strumenti e la piattaforma dissezione.
    1. Accendere lo sterilizzatore a caldo tallone e lasciarlo raggiungere i 250 ° C. Pulire le 2 paia di forbici chirurgiche e pinze con acqua e sapone. Sterilizzare gli strumenti per almeno 30 sec. Lasciate che gli strumenti raffreddare. Utilizzare un coperchio di polistirolo come piattaforma di dissezione. Coprire con un pezzo di laboratorio soaker.

4. Preparazione di iniezioni

NOTA: A seconda del tempo di dimezzamento e la risposta preferita, iniettare fluorescente anticorpi e / o molecole fluorescenti o immediatamente prima del sacrificio animale o un paio di ore o giorni prima.

  1. Per neutrofili immagine Gr1-positive e monociti, prepara una siringa con 7 ml di brodo Gr-1 anticorpi AF647-coniugato (1 mg / ml) in 100 ml di PBS sterile sotto il cofano. Posizionare un 27 G ½ ago sulla siringa.
  2. Per capillari polmonari immagine, preparare una seconda e terza siringa con 100 ml di o 70 kD rodamina-destrano coniugato (4 mg / ml) o destrano 10 kD AF647-coniugato (4 mg / ml). Posizionare un 27 G ½ ago sulle siringhe.
  3. Iniettare l'AF647 coniugato soluzione di anticorpi iv 5 ore prima di escissione polmoni.
  4. Iniettare una o entrambe le soluzioni di destrano iv immediatamente precedenti l'escissione polmoni '.

5. Preparazione dei polmoni per ex vivo l'imaging dal vivo

NOTA: Prova a lavorare come sterile e accurato possibile per evitare inutili sfide delle cellule immunitarie nei polmoni.

  1. Iniettare il intraperitoneale mouse (ip) con un sovradosaggio letale di anestetico consentita dal protocollo animale approvato da IACUC, ad es., 1 ml di 2,5% Avertin. Attendere il mouse per smettere di respirare e di essere completamente non-responsivi agli stimoli nocivi (zampa posteriore pinch).
    NOTA: dislocazione cervicale e biossido di carbonio l'eutanasia dovrebbe essere evitato in quanto può influenzare negativamente la vitalità delle cellule del polmone.
  2. Immobilizzare il mouse su una tavola di dissezione e sterilizzare il mouse con il 70% di etanolo.
  3. Utilizzare forbici chirurgiche prima fare una incisione epigastrica trasversale attraverso la pelle, seguita da un'incisione simile attraverso il peritoneo. Tenere la tavola di dissezione in posizione verticale e tagliare l'aorta discendente, in modo che le piscine sangue giù nell'addome e non nella cavità toracica.
  4. Snip una piccola apertura nel diaframma per rilasciare il vuoto. Tagliare lungo la nervatura 10 e 12 di asportare il diaframma e ottenere accesso visivo ai polmoni.
  5. Usare le forbici chirurgiche per tagliare la pelle fino alla trachea sopra la gabbia toracica, ma lascia intatta la gabbia toracica. Separare la pelle dalla cassa toracica. Esporre la trachea rimuovendo il tessuto connettivo circostante, facendo attenzione a non danneggiare la trachea stessa (Figura 1A).
  6. Snip una piccola apertura di circa 1 mm di diametro nella trachea esposto parallelamente agli anelli cartilaginei, più vicino alla laringe possibile (Figura 1B). Fare attenzione a non tagliare completamente attraverso la trachea.
  7. Prendere un ago G 20 e inserire delicatamente l'ago mm 4-5 nella trachea, senza alcuna forza contatore (Figura 1D). L'estremità dell'ago deve essere visibile attraverso la trachea (Figura 1C). Utilizzare pinze per stabilizzare l'ago nella trachea. In alternativa, una sutura può essere legato aroUnd la trachea per tenere l'ago in posizione.
    NOTA: Inserendo troppo profonda, la carena può essere traumatizzato o solo un lato dei polmoni potrebbe essere gonfiato.
  8. Riempire una siringa con 400 ml di 37 ° C 2% agarosio a bassa temperatura di fusione (presa direttamente da un bagno a temperatura costante). Assicurarsi che la scheda di dissezione è in piedi e infondere lentamente l'agarosio caldo attraverso l'ago nei polmoni, usare ~ 400 microlitri per gonfiare i polmoni.
    NOTA: Guarda i polmoni gonfiano all'interno della cassa toracica. Non gonfiare eccessivamente il polmone come sarà rottura.
  9. Una volta che i polmoni sono gonfiati, riempiendo ~ ⅔ della gabbia toracica, staccare la siringa e l'ago mantenere all'interno della trachea per evitare la fuoriuscita di agarosio.
  10. Versare circa 50 ml di 20 ° C PBS oltre i polmoni gonfiati per consentire l'agarosio all'interno dei polmoni per impostare e solidificare. Lentamente rimuovere l'ago e chiudere la trachea con una pinza per evitare non solidificato agarosio da perdite.
  11. Esporre i polmoni eseguendo una sternotomia e successivamente asportare i polmoni. Per escissione dei polmoni, trattenere la trachea durante il taglio attraverso la trachea completamente. Tirare delicatamente la trachea up, tagliare il tessuto connettivo e dell'esofago tirando i polmoni dalla cavità toracica fino polmoni è separato dal mouse (Figura 1E).
  12. Immergere i polmoni a caldo RPMI-1640 per lavare via il sangue eccessivo e separare delicatamente i lobi utilizzando forbici e pinze per tagliare fusto principale bronco lobi 'in ilo (Figura 1F).
  13. Posizionare i lobi, con la superficie piatta giù per massimizzare la superficie di imaging, in un pozzetto di una piastra di imaging 24 pozzetti (Figura 1G). Aggiungere 100 pl di 37 ° C RPMI-1640 in cima dei lobi. Posizionare diversi 15 mm vetrini di copertura microscopio circolare sulla parte superiore dei lobi per evitare che galleggianti.
  14. Versare caldo PBS nei pozzetti circostanti per evitare che i media RPMI-1640 da evaporante. Inserire la piastra 24 pozzetti nella camera climatica equilibrato e mantenere i lobi polmonari a 37 ° C con aria e 5% CO 2. Inserire la camera climatica sul palco del microscopio confocale.
    NOTA: Altre miscele di gas (ad esempio, 5% O 2, 5% CO 2 in N 2 per esaminare il comportamento delle cellule in condizioni di ipossia / ossigeno inferiore) potrebbe anche essere considerato.

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Figura 1. Protocollo per la preparazione dei polmoni per l'imaging in tempo reale. (A) esposizione della trachea dopo la preparazione del mouse. (B) Piccola snip fatto nella trachea esposto parallelamente agli anelli cartilaginei. (C) 20 ago G inserita 4-5 mm nella trachea. (D) instillazione di 400 microlitri 2% a bassa temperatura di fusione agarosio nei polmoni. (E) Inflpolmoni ATED separati dal mouse. (F) lobi separati dopo l'inflazione. (G) Lobi posto in un pozzo di una piastra di imaging 24-bene. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

6. Acquisizione e analisi di immagini

NOTA: Le immagini possono essere acquisite con una varietà di filatura del disco microscopio confocale supportati da vari programmi software. In questo protocollo, sia μManager con una filatura disco microscopio confocale misura o Zen con un disco di filatura microscopio confocale disponibile in commercio viene utilizzato per l'acquisizione dell'immagine, mentre Imaris viene utilizzato per l'editing di film e di analisi.

  1. Acquisire le immagini utilizzando μManager. Un passo dettagliata da protocollo passo per l'acquisizione di immagini utilizzando il software μManager è descritto in precedenza 18.
    O
  2. acquisire le immaginiutilizzando il software di analisi delle immagini, come Zen (vedi Figura S1).
    1. Fare clic sulla scheda 'Locate' e scegliere obiettivo (10x o 20x) nello strumento di 'Light Path' (Figura S1A, scatola rossa). Successivamente, clicca su 'Occhi - DAPI' a guardare il canale PCP attraverso l'oculare (Figura S1A, scatola blu). Localizzare il campione manualmente utilizzando il microscopio. Fare clic su 'All Off'after il tessuto è centro del campo visivo.
    2. Fare clic sulla scheda 'Acquisizione' per impostare tutti i parametri per l'acquisizione delle immagini.
    3. Nello strumento di 'canali', fare clic sul pulsante '+' (Figura S1B, scatola rossa). Appare un menu pop-up e cercare il colorante (s) presente nel campione nel 'Dye Database' (Figura S1B). Selezionare il colorante e fare clic su 'Aggiungi'.
      NOTA: Il programma impostato tutti i filtri di ottimizzare. Un colorante può essere cancellatoselezionandolo seguito facendo clic sul pulsante del cestino (Figura S1B, scatola gialla).
    4. Nel menu 'Acquisition Mode', impostare 'Binning' a 5x5. Fare doppio clic sul ECFP nel menu canali per selezionarla. Abbassare la potenza del laser al 20% in modo che il campione non verrà sbiancato durante l'impostazione dei parametri di acquisizione delle immagini.
    5. Selezionare la casella 'piastrelle' nella sezione 'Experiment Manager' e lo strumento piastrelle compare nel gruppo di strumenti 'multidimensionale Acquisition' (Figura S1C). Fare clic sul pulsante 'Impostazioni avanzate' per visualizzare l'immagine dal vivo dalla telecamera. Fare clic sul pulsante 'Aggiungi' nella sezione 'posizioni' aggiungere da 4 a 6 posizioni per l'esperimento. Per cancellare una posizione, selezionare quella posizione e fare clic sul pulsante del cestino.
    6. Nel gruppo strumento 'acquisizione dei parametri', aprire lo strumento 'Strategia Focus', e selezionare 'Absolute fissa Z-position 'dal menu a discesa.
    7. Selezionare la casella Z-Stack nella sezione 'Experiment Manager' e lo strumento Z-Stack appare nel gruppo di strumenti del 'multidimensionale Acquisition' (Figura S1D). Fare doppio clic su una delle posizioni nella sezione 'posizioni' e premere 'Live'. Impostare manualmente prima e impostare ultima posizione del campo dell'imaging. Impostare l'intervallo di 4 micron.
      NOTA: Il programma determina il numero di fette per l'intervallo e l'intervallo selezionato. Idealmente, 5-7 fette sono convenienti per permettere la visualizzazione sufficiente e rapida acquisizione delle immagini.
    8. Controllare la casella 'Time Series' nella sezione 'Experiment Manager'. Set desiderato 'Durata' e tempi 'intervallo' in funzione 'Time Series' che è apparso nel gruppo di strumenti 'multidimensionale Acquisition' (Figura S1E).
    9. Nel 'acquisiModalità ne 'di menu, impostare' Binning 'a 2x2. Doppio click su un fluoroforo nel menu canali per selezionare e aumentare la potenza del laser al 100%. Premere 'Live' e regolare il 'tempo di esposizione'. Ripetere questa operazione per ogni fluoroforo.
    10. Selezionare la casella 'Enable Auto Save'. Selezionare una cartella e digitare il nome del file. Tutte le immagini acquisite verranno salvate automaticamente in questa cartella.
    11. Fare clic su 'Start Experiment' nella sezione 'Experiment Manager' per avviare l'acquisizione delle immagini.
  3. Dopo l'acquisizione delle immagini, compilare i dati grezzi nel software Imaris. Convertire immagini in .ims i file e le regolazioni possono essere effettuate. Un passo dettagliata da protocollo passo per la conversione di file, le regolazioni e film risparmio utilizzando Imaris è descritto in precedenza 18.
  4. Quando si salva il film, impostare la 'Frame Rate' a 5 fotogrammi al secondo (fps).

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Risultati

Utilizzando la microscopia confocale spinning-disk, i vari sistemi modello mouse e iniettabili, il microambiente metastatico possono essere visualizzati e monitorati nel tempo. L'utilizzo di un MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP tripla modello di topo transgenico, diversi componenti cellulari sono fluorescente (Figura 2A, Film 1). La struttura tipica del parenchima polmonare può essere visualizzato nel canale PCP poiché tutte le cellule esprimono ECFP sotto i...

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Discussione

Questo manoscritto descrive un metodo dettagliato per ex vivo l'imaging dal vivo di metastasi polmonare in modelli murini di metastasi. Questo protocollo di imaging fornisce una visualizzazione diretta delle interazioni tumore a cellule-stroma dinamici e spaziali all'interno del microambiente polmonare. Si tratta di un metodo relativamente semplice e veloce che permette l'imaging affidabile di metastasi polmonari per almeno 4 ore. Film acquisiti da questi esperimenti possono essere utilizzati per mo...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dall'IACUC, UCSF.

Ringraziamenti

Ringraziamo Nguyen H. Nguyen per il suo aiuto tecnico e Audrey O'Neill per il supporto con il microscopio confocale a disco rotante Zeiss Cell Observer. Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato del Dipartimento della Difesa (W81XWH-11-01-0139) e dal Weizmann Institute of Science-National Postdoctoral Award Program for Advancing Women in Science (to V.P.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MMTV-PyMT/FVB topiJackson Laboratory2374Topi femmina
Topi ACTB-ECFP/FVBUCSF Werb labTopi femmina
c-fms-EGFP/FVB topiUCSF Werb labTopi femmina
Topi FVBJackson Laboratory1800Topi femmina
GFP+ VO-PyMT celluleUCSF Werb lab
70.000 kDa Destronano, coniugato con rodaminaInvitrogenD1818Diluire a  4 mg/ml in 1 x PBS e conservare a -20  °C. Utilizzare 0,4 mg per animale.
10.000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 coniugatoInvitrogenD22914Diluire a  4mg/ml in 1 x PBS e conservare a -20  °C. Utilizzare 0,4 mg per animale. 
Anticorpo Gr-1 anti-topo Alexa Fluor 647UCSF Nucleo di anticorpi monoclonaliStock 1mg/ml. Utilizzare 7 ug per animale.
Anestesiaapprovata da IACUC, utilizzata per anestesia e/o eutanasia
1X PBSUCSF impianto
PBS, USP sterile Amresco INCK813-500MLGrado ultra puro per iniezione endovenosa
di polistiroloVerrà utilizzato come pannello di dissezione
Forbici fini affilate Fine Science Tools14060-11
PinzeRoboz Surgical StoreRS-5135
Sterilizzatore a perline caldeFine Science Tools18000-45Accendere 30 minuti prima dell'uso
AriaUCSF
OssigenoUCSF
Anidride carbonicaUCSF
1 mL siringa senza ago BD309659
27 G x 1/2 ago   BD305109per iniezione endovenosa
20 G x 1 ago, smusso corto  BD305178
Agarosio a bassa temperatura di fusione Lonza50111Per preparare 10 ml di soluzione, pesare 0,2 g di agarosio, aggiungere a 10 ml 1 x PBS e scaldare per sciogliere. L'agarosio si solidifica a temperatura ambiente, quindi mantiene in una temperatura di 37 ° C bagnomaria fino al momento dell'utilizzo per il gonfiaggio.
Terreno RPMI-1640 senza rosso fenoloLife Technologies11835-030
Piastra di imaging a 24 pozzetti E& K scientificEK-42892
Vetrini di copertura, 15 mm Fisher Scientific22-031-144
Regolatore digitale di CO2 e temperaturaOkolabDGTCO2BXhttp://www.oko-lab.com
Camera climaticaOkolabhttp://www.oko-lab.com
Cell Observer Microscopio confocale a disco rotanteZen Zeiss
MicroscopioinvertitoCarl Zeiss IncZeiss Axiovert 200M
fotocamera ICCDStanford PhotonicsXR-Mega-10EX S-30
Testa di scansione confocale a disco rotanteYokogawa CorporationCSU-10b
ImarisBitplane
mManagerVale lab, UCSFSoftware open source
anestetica di coltura cellularePiattaforma Software

Riferimenti

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