Le tecniche sono descritte a immunostain fosfo-epitopi in interi embrioni di zebrafish e quindi condurre a due colori confocale a fluorescenza localizzazione in strutture cellulari piccoli come ciglia primarie. Le tecniche di fissaggio e di imaging possono definire la posizione e cinetica di comparsa o l'attivazione di specifiche proteine.
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Articolo metodologico
Immunocolorazione fosfo-epitopi in Ciliated Organi di monte intero embrioni di zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
La rapida proliferazione delle cellule, l'espressione tessuto-specifica di geni e la nascita di reti di segnalazione caratterizzano sviluppo embrionale precoce di tutti i vertebrati. La cinetica e la posizione dei segnali - anche all'interno di singole cellule - negli embrioni integra l'identificazione di importanti geni dello sviluppo. tecniche di immunoistochimica sono descritte che hanno dimostrato di definire la cinetica di segnali intracellulari animali e intere in strutture piccole come cilia primaria. Le tecniche per il fissaggio, di imaging e di elaborazione delle immagini utilizzando un microscopio a scansione laser confocale composto può essere completato in soli 36 hr.
Zebrafish (Danio rerio) è un organismo desiderabile per gli investigatori che cercano di condurre studi in una specie di vertebrati che è conveniente e rilevanti per le malattie umane. ko genetica o abbattimenti devono essere confermati dalla perdita del prodotto proteico reale. Tale conferma della perdita di proteinepuò essere realizzato utilizzando le tecniche descritte qui. Gli indizi in vie di segnalazione possono essere decifrati utilizzando anticorpi che sono reattivi con le proteine che sono stati post-traduzionali modificati dalla fosforilazione. Preservare e ottimizzare lo stato fosforilato di un epitopo è quindi fondamentale per questa determinazione e si realizza con questo protocollo.
Questo studio descrive tecniche per risolvere embrioni durante il primo 72 hr di sviluppo e co-localizzare una varietà di epitopi rilevanti con cilia nella zona di Kupffer Vesicle (KV), il rene e l'orecchio interno. Queste tecniche sono semplici, non richiedono la dissezione e può essere completato in un periodo relativamente breve di tempo. Proiezione pile di immagini confocale in una singola immagine è un mezzo utile per la presentazione di questi dati.
Introduzione
Le tecniche qui descritte sono il risultato di studi che hanno cercato di definire bersagli a valle dei segnali del Ca2+ durante eventi che si verificano durante lo sviluppo precoce, tra cui fecondazione, gastrulazione, somitogenesi e formazione del tronco, dell'occhio, del cervello e degli organi. 1-3 Le scoperte originali della segnalazione embrionale del Ca2+ dipendevano dall'uso di indicatori naturali e ingegnerizzati del Ca2+, come l'equorina4 e la fura-2. 5 Anche con la tecnologia attuale, il rilevamento di elevazioni transitorie di Ca2+ richiede strumenti analitici ingombranti e non ri....
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Protocollo
Le procedure di zebrafish in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) alla Virginia Commonwealth University.
1. Preparazione dei reagenti
- 4% PFA / PBS. Pesare 8 g di paraformaldeide (PFA) nella cappa. Sempre nella cappa, sciogliere il asciutta PFA in ~ 80 ml di H 2 O distillata sotto agitazione e riscaldamento a 50 ° C. Mentre mescolando, aggiungere 3 - 10 gocce di fresca 1N NaOH fino PFA è completamente sciolto e la soluzione chiarisce. Togliere dal fuoco e aggiungere 100 ml di 2x tampone fosfato salino (PBS). Portare il volume a 200 ml con acqua distillata H
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Risultati
Condizioni ottimali per la visualizzazione di fosfo-epitopi
I metodi che descrivono la immunolocalizzazione di epitopi della proteina negli embrioni di zebrafish sono state relativamente scarse rispetto a quelle per la localizzazione mRNA tramite ibridazione in situ. Fissativi utilizzati nella localizzazione epitopi di proteine nelle cellule ciliate di embrioni di zebrafish hanno incluso 4% PFA / PB.......
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Discussione
Il metodo / metanolo PFA è stato sviluppato in questo laboratorio con l'obiettivo primario di ottimizzare la immunolocalizzazione del fosfo-T 287 -CaMK-II epitopi durante lo sviluppo zebrafish. Questo metodo localizzato successo P-CaMK-II durante la formazione di diversi organi ciliati compreso il KV zebrafish, 12 orecchio interno 14 e reni. 13 In particolare nella fase KV, questa tecnica era necessario. Il successo di questo metodo è probabilmente dovuto ad una combinazio.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Science Foundation IOS-0.817.658.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-fenil-2-tiourea (PTU) | Sigma | P-7629 | 0,12%. Diluire 1:40 in acqua di sistema |
| Alexa488 anti-topo IgG | Life Technologies | A11001 | Policlonale di capra, utilizzare a 1:500 |
| Alexa488 anti-coniglio IgG | Life Technologies | A11008 | Policlonale di capra, utilizzare a 1:500 |
| Alexa488 falloidina | Life Technologies | A12379 | Si lega preferenzialmente alla F-actina |
| Alexa568 anti-topo IgG | Life Technologies | A11004 | Policlonale di capra, utilizzare in 1:500 |
| Alexa568 anti-coniglio IgG | Life Technologies | A11011 | Policlonale di capra, utilizzare in 1:500 |
| anti-acetilato α-tubulina | Sigma | T7451 | Monoclonale di topo, utilizzare in 1:500 |
| anti-fosfo-T287 CaMK-II | EMD Millipore | 06-881 | Policlonale di coniglio, utilizzare in 1:20 |
| anti-totale CaMK-II | BD Biosciences | 611292 | Monoclonale di topo, da utilizzare in scala 1:20 |
| Etanolo | Fisher | S96857 | Grado da laboratorio, 95% denaturato |
| Pincipe | Strumenti per le scienze fini | 11252-20 | Dumont #5 |
| Vetrini coprioggetti | VWR | 16004-330 | #1 spessore |
| Vetrini per microscopio | Fisher | 12-550-15 | Vetrini standard |
| Metanolo | Fisher | A411 | Conservare in congelatore |
| Provette per microcentrifuga | VWR | 20170-038 | Provette tappate, non sterili |
| Siero di capra normale | Life Technologies | 16210-064 | Aliquotare provette da 1 ml, conservare in congelatore |
| Paraformaldeide | Sigma | P-6148 | Reagente di qualità, cristallino |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Qualità Biologico | 119-069-131 | Soluzione stock 10x o prodotta in laboratorio |
| Triton X-100 | Sigma | BP-151 | Soluzione al 10% in acqua, conservare presso RT |
| Tween-20 | Life Technologies | 85113 | Soluzione al 10% in acqua, conservare al |
| microscopio composto | Nikon | E-600 | Montare su tavolo senza vibrazioni |
| C1 Plus confocale a scansione laser a due | Nikon | C1 Plus | Eseguito dal programma EZ-C1, ma gli aggiornamenti utilizzano " Elementi" |
Riferimenti
- Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
- Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol.
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Ristampe e permessi
