Articolo metodologico

Immunocolorazione fosfo-epitopi in Ciliated Organi di monte intero embrioni di zebrafish

DOI:

10.3791/53747

⸱

19 febbraio 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Le tecniche sono descritte a immunostain fosfo-epitopi in interi embrioni di zebrafish e quindi condurre a due colori confocale a fluorescenza localizzazione in strutture cellulari piccoli come ciglia primarie. Le tecniche di fissaggio e di imaging possono definire la posizione e cinetica di comparsa o l'attivazione di specifiche proteine.

Abstract

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La rapida proliferazione delle cellule, l'espressione tessuto-specifica di geni e la nascita di reti di segnalazione caratterizzano sviluppo embrionale precoce di tutti i vertebrati. La cinetica e la posizione dei segnali - anche all'interno di singole cellule - negli embrioni integra l'identificazione di importanti geni dello sviluppo. tecniche di immunoistochimica sono descritte che hanno dimostrato di definire la cinetica di segnali intracellulari animali e intere in strutture piccole come cilia primaria. Le tecniche per il fissaggio, di imaging e di elaborazione delle immagini utilizzando un microscopio a scansione laser confocale composto può essere completato in soli 36 hr.

Zebrafish (Danio rerio) è un organismo desiderabile per gli investigatori che cercano di condurre studi in una specie di vertebrati che è conveniente e rilevanti per le malattie umane. ko genetica o abbattimenti devono essere confermati dalla perdita del prodotto proteico reale. Tale conferma della perdita di proteinepuò essere realizzato utilizzando le tecniche descritte qui. Gli indizi in vie di segnalazione possono essere decifrati utilizzando anticorpi che sono reattivi con le proteine ​​che sono stati post-traduzionali modificati dalla fosforilazione. Preservare e ottimizzare lo stato fosforilato di un epitopo è quindi fondamentale per questa determinazione e si realizza con questo protocollo.

Questo studio descrive tecniche per risolvere embrioni durante il primo 72 hr di sviluppo e co-localizzare una varietà di epitopi rilevanti con cilia nella zona di Kupffer Vesicle (KV), il rene e l'orecchio interno. Queste tecniche sono semplici, non richiedono la dissezione e può essere completato in un periodo relativamente breve di tempo. Proiezione pile di immagini confocale in una singola immagine è un mezzo utile per la presentazione di questi dati.

Introduzione

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Le tecniche qui descritte sono il risultato di studi che hanno cercato di definire bersagli a valle dei segnali del Ca2+ durante eventi che si verificano durante lo sviluppo precoce, tra cui fecondazione, gastrulazione, somitogenesi e formazione del tronco, dell'occhio, del cervello e degli organi. 1-3 Le scoperte originali della segnalazione embrionale del Ca2+ dipendevano dall'uso di indicatori naturali e ingegnerizzati del Ca2+, come l'equorina4 e la fura-2. 5 Anche con la tecnologia attuale, il rilevamento di elevazioni transitorie di Ca2+ richiede strumenti analitici ingombranti e non rivela i bersagli di tali segnali di Ca2+.

Questo laboratorio studia i segnali Ca2+ che agiscono attraverso la proteina chinasi Ca2+/calmodulina-dipendente (multifunzionale) nota come CaMK-II, un enzima arricchito nel sistema nervoso centrale e originariamente identificato come regolatore del potenziamento a lungo termine. 6 CaMK-II non è cervello-specifico, è ampiamente espresso e altamente conservato durante l'intera durata della vita e corpi di specie in tutto il regno animale, compresi gli invertebrati. Il 7,8 CaMK-II ha la capacità unica di sostenere la propria attività anche dopo che i livelli di Ca2+ sono diminuiti grazie alla sua capacità di autofosforilare a Thr287. In questo stato autofosforilato, il CaMK-II rimane attivo in modo indipendente dal Ca2+/CaM, fino alla defosforilazione. 6 Pertanto, la localizzazione di CaMK-II fosforilato (Thr287) può identificare le cellule in cui si sono verificati aumenti naturali e rilevanti di Ca2+.

Un anticorpo contro il CaMK-II autofosforilato (P-Thr287) è stato ben caratterizzato ed è stato inizialmente utilizzato per localizzare il CaMK-II attivato nel tessuto cerebrale. 9 Il pesce zebra (Danio rerio) ha sette geni CaMK-II10,11 i cui prodotti proteici contengono una sequenza di MHRQE[pT287]VECLK in questa regione. 10,11 Questa sequenza è molto simile all'antigene fosfopeptidico utilizzato per creare questo anticorpo policlonale di coniglio (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) e quindi non è stata una sorpresa completa che questo anticorpo abbia reagito in modo incrociato con il pesce zebra CaMK-II. Questo laboratorio ha dimostrato che questo anticorpo reagisce con il CaMK-II del pesce zebra in proporzione all'autofosforilazione e all'attività indipendente dal Ca2+/CaM. È stato inoltre dimostrato che 12 ulteriori anticorpi CaMK-II pan-specifici reagiscono in modo crociato con il CaMK-II del pesce zebra. 13

Questo anticorpo è stato utilizzato per dimostrare che il CaMK-II del pesce zebra è attivato preferenzialmente nelle cellule su un lato della vescicola di Kuppffer (KV), l'organo ciliato necessario per stabilire l'asimmetria sinistra/destra. 12 Questo anticorpo è stato utilizzato per dimostrare che CaMK-II è attivato transitoriamente in quattro cellule adiacenti sul lato sinistro del KV durante la stessa identica fase di sviluppo in cui viene determinato il posizionamento dell'organo. 12 Oltre alla vescicola di Kuppffer (KV), l'autofosforilazione (P-T287) era localizzata anche in specifici siti intracellulari in altri tessuti ciliati, tra cui il rene, i neuromasi e l'orecchio interno. 12,13 Nel rene di zebrafish, P-T287-CaMK-II è arricchito lungo il bordo apicale delle cellule duttali ciliate e all'interno delle ciglia cloacali dove influenza il loro assemblaggio. 13 Infine, nell'orecchio interno in via di sviluppo, P-T287-CaMK-II è intensamente concentrato alla base delle ciglia e influenza la differenziazione cellulare attraverso la via del segnale Delta-Notch. 14 In sintesi, la rilevazione di CaMK-II attivato ha individuato i siti di rilascio intracellulare di Ca2+ e ha illuminato potenziali nuove vie di segnalazione.

Queste scoperte sono state completamente dipendenti dallo sviluppo di un metodo sensibile e accurato per localizzare il CaMK-II attivato (P-T 287-autofosforilato). Vengono descritti i metodi per fissare e immunocolorare il KV, il rene e l'orecchio interno del pesce zebra. Vengono inoltre descritti i limiti di questa tecnica. Queste tecniche dovrebbero essere utili a qualsiasi ricercatore che cerchi di ottenere immagini ad alta risoluzione in due canali fluorescenti non solo di fosfo-epitopi, ma di qualsiasi epitopo, durante lo sviluppo precoce dei vertebrati.

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Protocollo

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Le procedure di zebrafish in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) alla Virginia Commonwealth University.

1. Preparazione dei reagenti

  1. 4% PFA / PBS. Pesare 8 g di paraformaldeide (PFA) nella cappa. Sempre nella cappa, sciogliere il asciutta PFA in ~ 80 ml ​​di H 2 O distillata sotto agitazione e riscaldamento a 50 ° C. Mentre mescolando, aggiungere 3 - 10 gocce di fresca 1N NaOH fino PFA è completamente sciolto e la soluzione chiarisce. Togliere dal fuoco e aggiungere 100 ml di 2x tampone fosfato salino (PBS). Portare il volume a 200 ml con acqua distillata H 2 O. Raffreddare a RT e confermare pH di 7,4 prima dell'uso. Conservare al buio a 4 ° C ma utilizzare entro una settimana.
  2. Utilizzare 100% di metanolo senza supplementi. Utilizzare il 95% di etanolo senza supplementi.
  3. Preparare fosfato-tamponata Tween (PBT). Supplemento PBS (PBS) con 0,1% di Tween-20. Aggiungi 0.5 ml di Tween-20 soluzione madre 20% a 100 ml 1x PBS. Conservare a temperatura ambiente.
  4. Preparare fosfato-tamponata Triton-X (PBTx). Supplemento PBS con 0,1% Triton X-100. Aggiungere 0,5 ml di 20% Triton X-100 magazzino a 100 ml di PBS. Conservare a temperatura ambiente.
  5. Preparare 10% NGS / PBTx. blocchi normali siero di capra (NGS) non specifici siti di legame. NGS Conservare in aliquote a -20 ° C. Per utilizzare, aggiungere 1 ml a 9 ml PBTx.
  6. Preparare 50% glicerolo / PBS. Mescolare parti uguali di fondo 2x PBS e 100% glicerolo. Conservare a temperatura ambiente.

2. Embryo Fixation

  1. . (Es., Β-actina: CAAX-GFP) Allevamento ottenere wild type (AB e WIK) o transgenici embrioni attraverso accoppiamenti naturali. Se lo si desidera, iniettare embrioni con costrutti o morpholinos, come descritto. 15,16
  2. Sollevare embrioni. Raccogliere embrioni e incubare a 28,5 ° C in presenza di 0,003% 1-fenil-2-tiourea (PTU) per bloccare la pigmentazione come descritto. 17 p>
  3. Fissare. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato, 18,   anestetizzare gli embrioni utilizzando MESAB, rimuovere l'acqua sistema quanto più possibile e aggiungere fresca 4% PFA / PBS per 3 - 4 ore a RT. NOTA: A volte meno di 20 ore dopo la fecondazione (HPF), fissare prima dechorionation. A volte dopo 20 HPF, dechorionate prima della fissazione con due coppie di pinze punta fine sotto un microscopio da dissezione.
  4. Cambiare soluzioni. Trasferire gli embrioni utilizzando una vasta pipetta foro, come descritto. 17 Variazione soluzioni in 1,5 ml con tappo provette da microcentrifuga, semplicemente permettendo embrioni di stabilirsi per gravità senza centrifugazione.
  5. Post-fissativo Dopo 3 -. 4 ore, rimuovere PFA / PBS, sostituire con il 100% di metanolo e conservare a -20 ° C per almeno 48 ore. NOTA: per la massima immunoreattività P-CaMK-II, limitare il tempo totale di memorizzazione metanolo per una settimana.
"> 3. Immunocolorazione intero embrioni

  1. Posizionare un minimo di 10 embrioni per ogni condizione sperimentale in innevate provetta da 1,5 ml microcentrifuga, ed etichettarli.
  2. Lasciare gli embrioni di stabilirsi. Rimuovere e scartare metanolo e reidratare con lavaggi progressive contenenti 0,5 ml di concentrazioni decrescenti di etanolo, come indicato nel passaggio successivo. Ogni passo è a 5 minuti di lavaggio con dondolo.
  3. Progressivamente reidratare con questi 5 soluzioni: 66% etanolo / 33% PBTx, 33% etanolo / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (questa è la prima ripetizione di PBTx), 100% PBTx (questa è la seconda ripetizione PBTx).
  4. Rimuovere ultimo lavaggio PBTx. Aggiungere 0,5 ml di 10% NGS / PBTx. Incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente con dolce dondolio e poi rimuovere ed eliminare soluzione.
  5. Preparare la soluzione anticorpo primario diluendo nel 10% NGS / PBTx. Se la co-immunostaining, usare degli anticorpi più alta affinità per primo. Per questo studio, incubare con il mouse anti-acetilata anticorpo monoclonale tubulina diluito 1: 500. per example, se ci sono 10 campioni, combinare 6 ml di soluzione madre di anticorpi con 3 ml di 10% NGS / PBTx quindi distribuire 0,3 ml di questa in ogni provetta.
  6. Aggiungere 0,2 - 0,5 ml di anticorpo primario diluito in ogni provetta per immergere tutti gli embrioni. Incubare con dolce dondolio O / N a temperatura ambiente.
  7. Al mattino, rimuovere ed eliminare soluzione di anticorpi. Aggiungere 0,5 ml 2% NGS / PBTx per lavare via anticorpo primario in eccesso. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte.
  8. Dim plafoniere e diluire l'anticorpo secondario fluorescente coniugato adeguato nel 10% NGS / PBTx in modo che ogni condizione contiene almeno 0,5 ml. Con il topo anti-acetilata anticorpo primario tubulina, utilizzare il verde-colorante fluorescente capra anti-IgG di topo ad una diluizione 1: 500.
  9. Incubare anticorpo secondario per 4 ore con leggera oscillazione a RT al buio. D'ora in poi, il processo di campioni sotto luci soffuse e incubare in un contenitore scuro o avvolgendo in un foglio di alluminio.
  10. Al termine dell'incubazione, rimuovere e scartare la soluzione di anticorpo secondario. Aggiungere 0,5 ml 2% NGS / PBTx per lavare. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte.
  11. Se la co-immunostaining, ottenere il secondo anticorpo primario da una specie diversa rispetto al primo anticorpo primario. In questi studi, seguire l'anticorpo CaMK-II di coniglio anti-fosfo dal colorante coniugato capra anti-coniglio anticorpo secondario rosso fluorescente IgG.
  12. Diluire coniglio anti-fosfo-CaMK II anticorpi 1:20. Per ogni tubo di embrioni, la sospensione in 0,3 ml di 10% NGS / PBTx, quindi aggiungere 15 ml di soluzione madre di anticorpi.
  13. Assicurarsi che gli embrioni sono immersi e le luci si abbassano. Incubare con dolce O dondolo / N a RT al buio.
  14. La mattina sotto le luci soffuse, rimuovere ed eliminare soluzione di anticorpi. Aggiungere 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte.
  15. Mantenere plafoniere fioca e abbastanza del appropriata fluorescenza conju diluiregated anticorpo secondario in modo che ogni condizione contiene almeno 0,5 ml. In questo studio, diluire il colorante coniugato capra anti-IgG di coniglio anticorpi rosso fluorescente secondaria (canale rosso) 1: 500 nel 10% NGS / PBTx.
  16. Incubare secondo anticorpo secondario per 4 ore con leggera oscillazione a RT al buio.
  17. Alla fine di questa incubazione e sotto le luci soffuse, rimuovere ed eliminare la soluzione di anticorpo secondario. Aggiungere 0,5 ml PBTx. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte. Conservare in entrambi PBTx o il 50% glicerolo / PBS a seconda della procedura di imaging.

4. confocale Imaging and Processing

  1. Monte embrioni per l'imaging. Posizionare 1 - 5 embrioni su un vetrino. Creare una camera tra il vetrino principale e la diapositiva utilizzando frammenti coprioggetto su ciascun lato della camera. Tipicamente, quattro # 1 coprioggetto sono usati per fare queste pile distanziatori senza incollarsi.
    NOTA: Nessun mezzo di montaggio è necessario.
  2. Utilizzare una immersione in olio 100Xobiettivo di portare singolo embrione a fuoco con luce trasmessa. Spegnere la luce. Accendere microscopio confocale. Garantire che i laser appropriate (verde e / o rosso) sono accesi e accessary messa a fuoco remota è impegnata.
  3. Attivare il programma confocale. Nella "barra Acquisisci", selezionare l'obiettivo corretto. Nella barra "XY di base", impostare le dimensioni dell'immagine a 1.024 facendo clic sul pulsante 1.024.
  4. Nella "Laser e Detector" bar, clicca con il 488 box rosso e il verde 568 casella per attivare il laser e rivelatore per ciascun canale. Impostare pinhole a medio e regolare il guadagno nella barra "Gain" di ciascun canale da visualizzare.
  5. Nella barra "Acquisire Impostazioni", cliccare su "Live" per iniziare l'acquisizione di immagini. Nella barra "View Settings", deselezionare la casella "Forza integrale Zoom" al centro nella finestra "Live".
  6. Nella barra "Acquisisci impostazioni", nella scheda "Z", scorrere i livelli dell'immagine. Dopo aver selezionato il number di sezioni ottiche incorporare nella immagine, passare a un certo punto nel "centro" del piano z.
  7. Nella scheda "Z", fare clic sulla piccola scatola rossa "di riferimento". Questo azzererà la RFA nel punto prescelto come "centro". Nella casella "Step Size", selezionare lo spessore degli strati (tra 0,25 micron e 2,0 micron è l'ideale). Prestare attenzione alla casella "Formato File" e cercare di limitare a 1 GB.
    NOTA: in genere, fino a 40 sezioni ottiche di 0,5 - 1,0 micron si ottengono, ma il numero di sezioni può essere determinato empiricamente.
  8. Per trovare l'estremo superiore dell'immagine, fare clic sul cerchio accanto a "Top" e passare attraverso gli strati z. Ora clicca il cerchio accanto a "basso", il computer avrà l'immagine di nuovo al livello come il centro. Ancora spostarsi attraverso gli strati di trovare l'estremo inferiore dell'immagine.
  9. Clicca su "vivere" ancora una volta nei "Acquisisci Impostazioni" di dialogo per fermare il laseracquisizione. In questo pannello, selezionare le caselle rosse etichettati media e Z-stack. Queste scatole diventa verde.
  10. Nella casella "Acquisire Impostazioni", fai clic su "Single" per acquisire l'intera serie di immagini. È possibile monitorare lo stato di avanzamento, come la scansione in entrambi i canali e attraverso l'intero z-stack.
  11. Per risparmiare, fare clic sulla finestra del volume e fare clic su "Salva con nome" e il nome del file. Salvare come file ".ids". Per volume di rendere il file mentre lo z-stack è ancora aperto, selezionare i dati menu a discesa e clicca su "il volume di rendering". Salvare il file reso come un file TIFF. Questa è l'immagine proiettata che sono presenti in questa pubblicazione.

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Risultati

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Condizioni ottimali per la visualizzazione di fosfo-epitopi

I metodi che descrivono la immunolocalizzazione di epitopi della proteina negli embrioni di zebrafish sono state relativamente scarse rispetto a quelle per la localizzazione mRNA tramite ibridazione in situ. Fissativi utilizzati nella localizzazione epitopi di proteine ​​nelle cellule ciliate di embrioni di zebrafish hanno incluso 4% PFA / PB...

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Discussione

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Il metodo / metanolo PFA è stato sviluppato in questo laboratorio con l'obiettivo primario di ottimizzare la immunolocalizzazione del fosfo-T 287 -CaMK-II epitopi durante lo sviluppo zebrafish. Questo metodo localizzato successo P-CaMK-II durante la formazione di diversi organi ciliati compreso il KV zebrafish, 12 orecchio interno 14 e reni. 13 In particolare nella fase KV, questa tecnica era necessario. Il successo di questo metodo è probabilmente dovuto ad una combinazio...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Science Foundation IOS-0.817.658.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-fenil-2-tiourea (PTU)SigmaP-76290,12%. Diluire 1:40 in acqua di sistema
Alexa488 anti-topo IgGLife TechnologiesA11001Policlonale di capra, utilizzare a 1:500
Alexa488 anti-coniglio IgGLife TechnologiesA11008Policlonale di capra, utilizzare a 1:500
Alexa488 falloidinaLife TechnologiesA12379Si lega preferenzialmente alla F-actina
Alexa568 anti-topo IgGLife TechnologiesA11004Policlonale di capra, utilizzare in 1:500
Alexa568 anti-coniglio IgGLife TechnologiesA11011Policlonale di capra, utilizzare in 1:500
anti-acetilato α-tubulinaSigmaT7451Monoclonale di topo, utilizzare in 1:500
anti-fosfo-T287 CaMK-IIEMD Millipore06-881Policlonale di coniglio, utilizzare in 1:20
anti-totale CaMK-IIBD Biosciences611292Monoclonale di topo, da utilizzare in scala 1:20
EtanoloFisherS96857Grado da laboratorio, 95% denaturato
PincipeStrumenti per le scienze fini11252-20Dumont #5
Vetrini coprioggettiVWR16004-330#1  spessore
Vetrini per microscopioFisher12-550-15Vetrini standard
MetanoloFisherA411Conservare in congelatore
Provette per microcentrifugaVWR20170-038Provette tappate, non sterili
Siero di capra normaleLife Technologies16210-064Aliquotare provette da 1 ml, conservare in congelatore
ParaformaldeideSigmaP-6148Reagente di qualità, cristallino
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Qualità Biologico119-069-131Soluzione stock 10x o prodotta in laboratorio
Triton X-100SigmaBP-151Soluzione al 10% in acqua, conservare presso RT
Tween-20Life Technologies85113Soluzione al 10% in acqua, conservare al
microscopio compostoNikonE-600Montare su tavolo senza vibrazioni
C1 Plus confocale a scansione laser a dueNikonC1 PlusEseguito dal programma EZ-C1, ma gli aggiornamenti utilizzano " Elementi"
Soluzione madre di RT

Riferimenti

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Microscopia confocalefissazione con PFA e metanolotubulina acetilatafosfo CaMKIIvescicola di Kupfferimaging di campioni interiscansione laser

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