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Articolo metodologico

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

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DOI:

10.3791/53748

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24 marzo 2016

 ,  , 
1ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of BioSciences, University of Melbourne

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive le tecniche specifiche utilizzate per la caratterizzazione strutturale delle sequenze di glicosili dell'estremità riducente (RE) e della regione interna degli eterossilani etichettando il RE con 2 amminobenzammide prima dell'idrolisi enzimatica (endossilanasi) e quindi dell'analisi degli oligosaccaridi risultanti utilizzando la spettrometria di massa (MS) e la risonanza magnetica nucleare (NMR).

Abstract

Questo protocollo descrive le specifiche tecniche utilizzate per la caratterizzazione di riduzione finale (RE) e la regione interna sequenza glicosil (s) di heteroxylans. De-inamidate pareti cellulari grano endosperma sono stati isolati come un residuo di alcool-solubile (AIR) 1 e in sequenza estratta con acqua (W-sol Fr) e 1 M KOH contenente 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) come descritto da Ratnayake et al. (2014) 2. Due approcci diversi (vedi sintesi in figura 1) vengono adottati. Nel primo, intatti AX W-sol sono trattati con 2AB codificare il RE backbone residuo originale zucchero catena e poi trattati con un dell'endoxilanasi per generare una miscela di RE 2AB marcato e regione interna riducendo oligosaccaridi, rispettivamente. In un secondo approccio, il KOH-sol Fr viene idrolizzato con dell'endoxilanasi per generare prima una miscela di oligosaccaridi che vengono successivamente etichettati con 2AB. I enzimaticamente rilasciati ((ONU) con tag) oligosaccaridi da entrambiW- e Frs KOH-sol sono poi metilato e l'analisi strutturale dettagliata di entrambi gli oligosaccaridi nativi e denaturato viene eseguita utilizzando una combinazione di MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS e ESI-MS n. Dell'endoxilanasi digerito Koh-sol AX si caratterizzano anche per la risonanza magnetica nucleare (NMR) che fornisce anche informazioni sulla configurazione anomerico. Queste tecniche possono essere applicate ad altre classi di polisaccaridi utilizzando le appropriate endo-idrolasi.

Introduzione

Heteroxylans sono una famiglia di polisaccaridi che sono i polisaccaridi predominanti non cellulosici delle pareti primarie di erbe e pareti secondaria di tutti angiosperme 3-6. Le dorsali Xylan si differenziano per i loro tipi e modelli di sostituzione con glicosil (acido glucuronico (GlcA), arabinosio (Araf)) e residui seconda tipo di tessuto, stadio di sviluppo e le specie 7 non glicosil (O-acetil, acido ferulico).

Le pareti di grano (Triticum aestivum L.) endosperma sono composti principalmente da arabinoxilani (AXS) (70%) e (1 → 3) (1 → 4) -β glucani-D-(20%) con piccole quantità di cellulosa e heteromannans (2% ciascuno) 8. La dorsale xilano può essere variamente un-sostituito e prevalentemente mono-sostituito (principalmente O-2 posizioni e, in misura minore, O-3 posizioni) e (O-2 e O-3 posizioni) con α-L-Ara disostituito f residui 9. La fine di ridurre (RE) di eteroxilani da dicotiledoni (ad esempio, Arabidopsis thaliana) 10 e gimnosperme (ad esempio, abete rosso (Picea abies)) 11 contiene una caratteristica sequenza tetrasaccaride glycosyl; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl p. Per comprendere biosintesi e funzione (biologici ed industriali) heteroxylan, è importante sequenziare completamente backbone xilano di comprendere i tipi e modelli di sostituzione nonché la sequenza dell'estremità riducente (RE).

Tecniche specifiche utilizzate per la caratterizzazione strutturale di riduzione finale (RE) e la regione interna sequenza glicosil (s) di heteroxylans sono descritti in questo manoscritto. Le tecniche si basano su fluoroforo tagging (con 2 aminobenzamide (2AB)) all'estremità riducente (RE) della catena heteroxylan prima enzimatica (dell'endoxilanasi) idrolisi. Questo approccio, in particolare per il sequenziamento RE, siaprima riportato dal laboratorio York 10,12-13 ma viene esteso per includere la sequenza regione interna ed è una combinazione di tecniche consolidate che è ugualmente adattabile a tutti heteroxylans indipendenti della loro fonte di isolamento. Questo approccio può essere applicato anche ad altre classi di polisaccaridi utilizzando (dove disponibile) le opportune endo-idrolasi.

Nel presente studio, pareti cellulari frumento endosperma de-inamidata stati isolati come un residuo di alcool insolubili (AIR) e sequenzialmente estratta con acqua (W-sol Fr) e KOH 1M contenente 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) come descritto in Ratnayake et al. (2014) 2. Gli oligosaccaridi rilasciate sia da W- e Frs KOH-sol sono poi metilato e l'analisi strutturale dettagliata sia dei nativi oligosaccaridi e denaturato viene eseguita utilizzando una combinazione di MALDI-TOF-MS, ESI-MS-QTOF-accoppiato con HPLC con il separazione cromatografica online utilizzando un C-18 colonna RPe ESI-MS n. Dell'endoxilanasi digerito KOH-sol AX è stato caratterizzato anche da risonanza magnetica nucleare (NMR).

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Protocollo

1. L'etichettatura della Fine Riduzione (RE) Zucchero Residuo di W-sol AX con 2-aminobenzamide (2AB)

  1. Incubare W-sol AX con 2AB (0,2 M) in presenza di 1 M NaBH 3 CN (sodiocianoboroidruro) (pH 5,5) per 2 ore a 65 ° C per convertire le estremità riducenti delle catene polisaccaride backbone ai loro derivati ​​fluorescenti.
    ATTENZIONE: La seguente operazione deve essere eseguita nella cappa come NaBH 3 CN rilascia gas cianuro tossico quando è in contatto con l'acqua.
    1. Pesare NaBH 3 CN (62,8 mg) e sciogliere in acqua (1 ml) in una provetta da microcentrifuga (1,5 ml) per preparare una soluzione 1 M NaBH 3 CN. Sciogliere 2AB reagente (27,2 mg) in soluzione 1 M NaBH 3 CN (1 ml) mediante riscaldamento a 65   ° C e regolare il pH della miscela di reazione (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) fino a pH 5,5 con acido acetico 10%.
    2. Aggiungere 200 pl di miscela di reazione (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) per W-soL AX (1 mg) in un tubo di vetro con un tappo e miscelare con un vortex. Incubare per 2 ore a 65   ° C in una cappa aspirante. Raffreddare la sospensione di RT e aggiungere 4 voll. di etanolo assoluto.
    3. Posizionare la sospensione in una cella frigorifera (4 ° C) O / N a precipitare polisaccaridi.
    4. Centrifuga (1.500 xg, 10 min, RT) per rimuovere il surnatante. Lavare il pellet a lungo con etanolo assoluto (4x), acetone (1x) e metanolo (1x), centrifugazione tra ogni lavaggio. secca sotto vuoto a 40 ° CO / N.
      Nota: il lavaggio esteso rimuove anche 2AB residua.

2. Generazione di Xylo-oligosaccaridi da 2 AB Labelled W-sol AX

  1. Sciogliere 2AB etichettato W-sol AX (1 mg) in 500 ml di tampone di acetato di sodio (100 mM, pH 5) in una provetta da microcentrifuga (1,5 ml). Aggiungere 4 unità di dell'endoxilanasi (GH 11, [M1]) e incubare a 37   ° C per 16 ore.
  2. Distruggere l'attività enzimatica riscaldando i mixt reazioneure per 10 min in un bagno di acqua bollente. Raffreddare la sospensione di RT e trasferimento a tubo di vetro con un tappo. Aggiungere 4 voll. di etanolo assoluto e posizionare la sospensione in un magazzino frigorifero (4 ° C) O / N a precipitare qualsiasi polisaccaridi non digeriti.
  3. Centrifuga (1.500 xg, 10 min, RT) per separare polisaccaridi non digeriti (pellet) e dell'endoxilanasi generato Xylo-oligosaccaridi (surnatante). Decantare il surnatante in una provetta pulita e metterlo in un bagno di acqua calda (40 ° C).
  4. Evaporare l'etanolo in corrente di azoto per un volume punto finale (~ 500 microlitri). Congelamento del supernatante a -80 ° C per 4 ore e asciugare il surnatante congelato in un liofilizzatore per recuperare xylo-oligosaccaridi.

3. Generazione di Xylo-oligosaccaridi da Koh-sol AX e 2AB etichettatura

  1. Trattare KOH-sol AX con dell'endoxilanasi (GH 11, [M1]) per generare Xylo-oligosaccaridi come descritto in precedenza (sezioni 2.1-2.4).
  2. Trattare endoxylanase generato Xylo-oligosaccaridi da Koh-sol AX con miscela di reazione 2AB (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) come descritto sopra (sezioni 1.1.1-1.1.2).
  3. Decantare il surnatante in una provetta pulita e metterlo in un bagno di acqua calda (40 ° C). Evaporare l'etanolo in corrente di azoto per un volume punto finale (~ 500 microlitri). Congelamento del supernatante a -80 ° C per 4 ore e asciugare il surnatante congelato in un liofilizzatore per recuperare xylo-oligosaccaridi.

4. MALDI-TOF-MS

  1. Preparazione di MALDI-matrix Soluzione
    1. Aggiungere una piccola pallina di 2, acido 5-dihydroxbenzoic (DHB) al 50% acetonitrile (500 ml) contenente acido formico 0,1% in un tubo (soluzione MALDI-matrice). Mescolare con un vortice, se si dissolve rapidamente, aggiungere un altro piccolo scoop di DHB. Nota: la concentrazione ideale di soluzione MALDI-matrice è 10 mg / mL -1.
  2. Preparazione della piastra MALDI-bersaglio
    1. Depositare il aqueoci oligosaccaride campioni (nativo) (5-10 mcg) (W-sol e / o KOH-sol) su una piastra MALDI-bersaglio. Aggiungere 0,3 microlitri soluzione MALDI-matrice utilizzando una punta separato e miscelare pipettando su e giù. Lasciare il composto si asciughi a temperatura ambiente.
      Nota: i campioni correttamente essiccati dovrebbero consistere in cristalli lunghi aghiformi che puntano verso il centro dello spot. Se il deposito è appiccicoso e / o smeary il campione può essere sia troppo concentrata o sono costituiti da sali, tali depositi è improbabile che produrre un buon spettri e il campione devono essere purificati ulteriormente.
    2. Introdurre la piastra segnale nella fonte MS e operare in (+ ive) modalità ioni positivi. Regolare la tensione acceleratore a 19,0 kV alla fonte di ioni 1 e 16,3 kV alla fonte di ioni 2. Regolare la potenza del laser a più di 70%. Selezionare il punto di campionamento sulla piastra MALDI-target e fare clic su Start per iniziare colpi laser.
      Nota: Tutte le aree della destinazione non produrrà segnali. Un posto particolare sarà solo dare un segnale per un paio di colpi laser dovute a unesaurimento della miscela campione / matrice o le caratteristiche del cristallo.
      1. Spostare il laser a diverse aree del bersaglio durante l'acquisizione e media di circa 200 spettri casuale per ottenere una soddisfacente segnale-rumore.

5. ESI-MS-QTOF

  1. Analizzare oligosaccaridi dell'endoxilanasi generati (nativo) utilizzando nano-HPLC accoppiato con un Elettrospray (ESI) tempo quadrupolo di volo strumentale (QTOF) MS con separazione cromatografica on-line utilizzando un RP C-18 colonne (75 micron x 150 mm; 3,5 micron tallone dimensione).
    1. Trasferire il composto oligosaccaridi acquose dell'endoxilanasi generati in un flaconcino e mettere in auto campionatore HPLC. Programmare il gradiente di eluizione del 5-80% con le fasi mobili 0,1% (v / v) di acido formico in acqua e 0,1% (v / v) di acido formico in acetonitrile, rispettivamente oltre 60 min.
    2. Regolare la portata di 0,2 ml / min. Regolare il modo positivo di litio nel range di scansionedi 300-1,600 m / z ed una scansione tasso di 0,5 scansioni / secondo con le condizioni della sorgente ESI come segue: cortina di gas 10, GS1 4, temperatura sorgente 100 ° C, ione tensione spruzzo 2.300 V, e de-clustering di potenziale 50 V. Eseguire il programma LC cromatografica e oligosaccaridi eluire. Il cromatogramma ionico totale risultante (TIC) viene salvato automaticamente dal software.
    3. Aprire il TIC salvato e selezionare estratto cromatogramma. Digitare le masse attesi (ad esempio, 271, 403, 535, 667, 799 e 931 m / z) nella riga di comando. cromatogramma scansione cliccando Enter. Elaborare le scansioni di ioni selezionati dei dati cromatogramma ESI-MS QTOF utilizzando il software secondo le istruzioni 14 del produttore.

6. ESI-MS n

  1. Inserire da 1 a 2 ml di per-O-metilato oligosaccaride (metilato come descritto da Pettolino et al. 1) del campione nel 50% acetonitrile in una punta nanospray con una siringa. tagliarela punta nano-spruzzo con una taglierina di vetro per adattarsi nel supporto nano-spruzzo discreta attaccato alla SM.
  2. Impostare la massa secondo il range previsto di massa (200-1,500 m / z) e gas tenda 10, tensione ionspray a 1.900 V e polarità positiva.
  3. Premere il pulsante di acquisire per aprire la finestra corrispondente, inserire il nome del file di dati per ottenere una scansione ionica totale (ESI-MS 1). Quindi premere il tasto STOP.
  4. Cambiare il tipo di scansione da ioni prodotto di frammentare un picco di interesse. Indicare la massa di interesse (ad esempio, 885 m / z) di frammentare e regolare il range di massa (200-900 m / z). Premere il pulsante di acquisire e regolare l'energia di collisione (alto e / o verso il basso nella scheda composto) per ottenere tutta la frammentazione dello ione genitore (885 m / z) e acquisire una scansione frammento di ioni (ESI-MS 2).
  5. Indicare la massa di frammenti di ioni di interesse (ad esempio, 711 m / z) e regolare la gamma di massa (200-720 m / z). Premere il pulsante di acquisire unad regolare l'energia di collisione per ottenere tutta frammentazione di ione precursore (711 m / z) e acquisire una scansione frammento di ioni (ESI-MS 3).

7. H 1 spettroscopia NMR

  1. Sciogliere dell'endoxilanasi generato miscela di oligosaccaridi (KOH-sol, forma nativa) (~ 500 mg) in D 2 O (1,0 ml, 99,9%) in una provetta di plastica (15 ml). Congelare la sospensione a -80 ° C per 4 ore e asciugare la sospensione congelata in un liofilizzatore per recuperare xylo-oligosaccaridi.
  2. Ripetere 7.1 due volte per scambiare pienamente la H 2 O con D 2 O.
  3. Sciogliere oligosaccaridi essiccate in D 2 O (0,6 ml, 99,9%) e aggiungere 0,5 ml di acetone (5% in D 2 O) come standard interno. Trasferire i oligosaccaridi deuterati nella provetta del campione NMR.
  4. Tenere il NMR provetta contenente campione all'inizio e inserire il tubo campione in un filatore di plastica. Posizionare il filatore del calibro di profondità del campione. Push o tirare il tubo campione per regolare la profondità del campione per garantire che la linea centrale del piano campione e calibri di profondità inferiore sono uguali.
  5. Rimuovere il calibro di profondità e inserire il campione nel campionatore automatico collegato a uno spettrometro NMR 600 MHz dotato di crio-sonda.
  6. Login e software di controllo dello spettrometro aperto. Inserire il nome del file di esempio. Aprire un set di dati esistente e quindi utilizzare il comando "EDC" per salvarlo con un nuovo nome. Digitare il numero di posizione del campione nel campionatore automatico e premere "ENTER".
    Nota: Premendo il tasto "ENTER" si cadere il tubo campione delicatamente per il foro del magnete dove sarà posizionato nella parte superiore della sonda.
  7. Impostare la temperatura del campione desiderato digitando "edte" nella riga di comando. Attendere che la temperatura del campione per raggiungere il valore desiderato prima di procedere alla fase successiva. Inserire "lock" nella riga di comando e selezionare solvente appropriato (D 2 O). Attendere il & #34; bloccare il messaggio finito "apparire nella parte inferiore della finestra.
  8. Tipo "atmm" nella riga di comando e fare clic su "Ottimizza" nella parte superiore della barra dei menu atmm. Scegliere Start per la sintonizzazione e la corrispondenza della sonda per il canale selezionato (1 H in questo caso).
  9. Tipo "topshim" nella riga di comando per il processo di spessoramento in cui sono fatti piccoli aggiustamenti al campo magnetico fino a campo magnetico uniforme si ottiene tutto il sample.Acquire il segnale digitando "ZG" nella riga di comando e digitare.
  10. Analizzare spettri che utilizzano il software 15 secondo le istruzioni del produttore con 1 H chemical shift fa riferimento ad uno standard interno di acetone a 2.225 ppm.

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Risultati

La digestione dell'endoxilanasi di 2AB-etichettato W-sol AX genera una miscela di oligosaccaridi RE 2AB marcato e una serie di oligosaccaridi non-marcato (senza etichetta 2AB) derivate dalle regioni interne della catena xilano (Figura 1; da Ratnayake et al. 2). Una serie di approcci cromatografici viene quindi impiegato per frazionare il complesso miscela di isomeri. Infine, tecniche di MS sono utilizzate per identificare le strutture isomeriche c...

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Discussione

La maggior parte dei polisaccaridi della parete cellulare Phase Matrix hanno dorsali apparentemente sostituito in modo casuale (sia con glycosyl e residui non glicosil) che sono molto variabili a seconda delle specie di piante, stadio di sviluppo e tipo di tessuto 3. Poiché polisaccaridi sono prodotti genici secondari loro sequenza non è modello derivato e pertanto non vi è un unico approccio analitico, come esiste per acidi nucleici e proteine, per la loro sequenza. La disponibilità di purificati enzimi idro...

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Dichiarazioni

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo progetto è stato supportato dai fondi del Commonwealth Scientific and Research Organisation Flagship Collaborative Research Program, forniti al cluster High Fibre Grains tramite la Food Futures Flagship. AB riconosce anche il sostegno di una sovvenzione dell'Australia Research Council (ARC) all'ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls (CE110001007).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2 amminobenzamide (2AB)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)A89804
boroidruro di sodio (NaBH4)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)247677Pericoloso, maneggiare con cura
cianoboroidruro di sodio (NaBH3CN)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)156159Pericoloso, maneggiare con cura
endo-1,4-β-xilanasi M1 (da Trichoderma viride) (120101a)Megazima (www.megazyme.com)E-XYTR1
Ossido di deuterio (D2O)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)151882
Liofilizzatore (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus colonna Agilent (2,1 volte; 100 millimetri; 1.8 µ m dimensione delle perline) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Modello - MicroFlex LR)(Bruker Daltonics, Germania)
(ESI) -(QTOF) MS    (Modello # 6520)(Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - trappola ionica  (Modello # 1100 HCT)(Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMRBruker Daltonics, Germania
Topspin (versione 3.0)-Biospin- software Bruker 
GC-MS (Modello # 7890B)Agilent 

Riferimenti

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  15. Topspin User Manual. , Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
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  18. Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
  19. Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).

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