Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Sommario

Per studiare le velocità di flusso e la direzionalità dell'actina filamentosa nella sinapsi immunologica delle cellule T, l'imaging a super-risoluzione su cellule vive è combinato con la fluorescenza a riflessione interna totale e quantificato con la spettroscopia di correlazione delle immagini spazio-temporali.

Abstract

Filamentosa-actina gioca un ruolo cruciale nella maggioranza dei processi cellulari tra cui motilità e, in cellule immunitarie, la formazione di una interazione cellula-cellula chiave noto come sinapsi immunologica. F-actina è anche ipotizzato a svolgere un ruolo nella regolazione distribuzioni molecolari alla membrana delle cellule tra cui dinamiche vescicole sub-membranoso e proteine ​​clustering. Mentre le tecniche microscopio ottico standard, consentono osservazioni generalizzate e diffrazione limitata da apportare, molti eventi cellulari e molecolari, tra cui il clustering e il flusso molecolare si verificano in popolazioni a lunghezza scale molto al di sotto del potere risolutivo di microscopia ottica standard. Combinando riflessione interna totale fluorescenza con la super Resolution Imaging metodo strutturato illuminazione microscopia, il flusso molecolare bidimensionale di F-actina alla sinapsi immune delle cellule T è stato registrato. Spettroscopia spazio-temporale dell'immagine correlazione (STIC) è stato poi applicato, che genera Resul quantificabilits in forma di istogrammi di velocità e mappe vettoriali rappresentanti direzionalità del flusso e la grandezza. Questo protocollo descrive la combinazione di tecniche di imaging e racchette super-risoluzione per generare vettori di flusso a livello sub-diffrazione di dettaglio. Questa tecnica è stata utilizzata per confermare un flusso actina che è simmetricamente retrogrado e centripeta tutta la periferia delle cellule T sulla formazione di sinapsi.

Introduzione

L'obiettivo di questo esperimento è all'immagine e caratterizzare il flusso molecolare di filamentous- (F-) actina in cellule viventi T, oltre il limite di diffrazione per stabilire la direzione del flusso e della portata durante sinapsi immunologica (IS) formazione. Questa tecnica sarà effettuata utilizzando un microscopio illuminazione strutturata (SIM) in modalità riflessione totale fluorescenza interna (TIRF), l'imaging Jurkat cellule T costituiscono sinapsi artificiale sull'attivazione vetrini rivestiti di anti-CD3- ed anticorpi anti-CD28. Le forme si trova tra una cellula T e il suo obiettivo; una cellula che presenta l'antigene (APC) sul recettore delle cellule T (TCR) di attivazione ^1,2. Poiché questo è il primo passo per determinare se il sistema immunitario adattativo genera una risposta immunitaria ad una infezione, le conseguenze di risposta agli stimoli non corretto può causare una serie di malattie. L'importanza dell'interazione cellule T-APC è ben documentata, tuttavia, il ruolo (s) del maturo è dopo TCR si inizialeinternalizzazione de segnal devono ancora essere pienamente compreso.

Poiché il citoscheletro è pensato per aiutare due processi legati all'attivazione TCR (il movimento delle molecole sulla membrana plasmatica ed il controllo di molecole di segnalazione dipendenti dal citoscheletro actina ^3,4), comprendere come il citoscheletro riorganizza spazialmente e temporalmente delucideranno gradini di riorganizzazione molecolare durante la formazione delle sinapsi. Il flusso retrogrado di F-actina è pensato per corral cluster TCR verso il centro della sinapsi immunologica, questa traslocazione si crede di essere di vitale importanza per la cessazione del segnale e il riciclaggio; favorendo il delicato equilibrio di attivazione delle cellule T ^5.

Mentre un microscopio a fluorescenza è uno strumento flessibile che continua a fornire indicazioni su molti eventi biologici comprese le interazioni cellula-cellula, è limitata dalla capacità del sistema di risolvere con precisione più fluorofori che risiedono vicino di quanto il diffrLimite di azione (≈200 nm) l'uno dall'altro. Come molti eventi molecolari all'interno delle cellule coinvolgono popolazioni dense di molecole e mostrano riassetto dinamico sia in quiescenza o in seguito a stimolazione specifica, microscopia ottica convenzionale non fornisce il quadro completo.

L'uso di super risoluzione delle immagini ha permesso ai ricercatori di aggirare il limite di diffrazione usando una varietà di tecniche. Microscopia localizzazione molecola singola (SMLM) come Palm e STORM ^6,7 ha la capacità di risolvere la posizione di molecole fino a una precisione di circa 20 nm, tuttavia, queste tecniche contare su lunghi tempi di acquisizione, costruire un'immagine di numerose cornici . In genere questo richiede campioni da fisso o per le strutture di esporre scarsa mobilità in modo singole fluorofori non sono male interpretato come più punti. Mentre esaurimento emissione stimolata (STED) di imaging consente super-risoluzione attraverso molto selettivo confocale eccitazione ^8, la scansione richiestaapproccio può essere lento su campi di cellule intere di vista. STED dimostra anche fototossicità significativo per risoluzioni più elevate a causa dell'aumento della potenza del fascio esaurimento.

Structured microscopia illuminazione (SIM ⁹⁾ fornisce un'alternativa a questi metodi, in grado di raddoppiare la risoluzione di un microscopio a fluorescenza standard ed è più compatibile con cellule vive rispetto alle tecniche attuali SMLM. Esso utilizza potenze laser inferiori, in un sistema a grande campo per i campi di cellule intere di vista; fornire una maggiore velocità di acquisizione, ed è compatibile con l'etichettatura fluoroforo standard. La natura a grande campo di SIM permette anche l'utilizzo di totale fluorescenza riflessione interna (TIRF) per l'eccitazione altamente selettiva, con profondità di penetrazione nella dimensione assiale di <100 nm.

Spettroscopia di correlazione immagine (ICS) è un metodo di correlare fluttuazioni di intensità di fluorescenza. Un'evoluzione di ICS; Im spazio-temporalespettroscopia di correlazione età (STIC ¹⁰⁾ correla segnali fluorescenti intracellulari nel tempo e nello spazio. Correlando intensità dei pixel con pixel circostanti in cornici in ritardo di sviluppo tramite una funzione di correlazione, le informazioni si ottiene quanto concerne la velocità di flusso e direzionalità. Per assicurare oggetti statici non interferiscono con l'analisi STICS, un filtro oggetto immobile viene implementato, che funziona sottraendo una media mobile delle intensità dei pixel.

La tecnica qui presentata si crede di essere la prima dimostrazione della spettroscopia di correlazione immagine che viene applicata ai dati microscopia super-risoluzione per quantificare il flusso molecolare in cellule vive ^11. Questo metodo migliora sull'imaging diffrazione limitata di flusso F-actina tramite STICS analisi ¹² e sarebbe adatto ricercatori che desiderano per determinare il flusso molecolare bidimensionale in cellule vive, dai dati acquisiti a risoluzioni spaziali oltre il limite di diffrazione della luce.

Protocollo

Nota: Tappe 1 e 2 avvengono prima del giorno delle immagini; garantire tutti i media e gli integratori da utilizzare prima o il giorno delle immagini sono equilibrate. Equilibration è ottenuta attraverso il riscaldamento dei media e integratori a 37 ° C in un incubatore impostato a 5% di CO _2. Tutte le fasi di placcatura lavoro coltura cellulare e coprioggetto avvengono in condizioni sterili sotto una cappa a flusso laminare.

Trasfezione 1. cella

1. Trasfezione le cellule T per essere ripreso 24 ore prima che l'esperimento con un plasmide codificante una fusione fluorescente costrutto per l'etichettatura GFP-F actina e di imaging. Nota: Le cellule devono essere suddivisi 24 ore prima della trasfezione (48 ore prima di imaging) per assicurare cellule sono in salute ottimale e nella loro fase di crescita logaritmica.
   1. Mettere 5 ml di RPMI supplemento (RPMI 1640 più il 10% FBS e 1% Pen-Strep (opzionale)) in un unico pozzo di un 6-pozzetti nell'incubatore per equilibrare.
   2. Pellet 2 x 10 ⁷ cellule T cultorato a 37 ° C + 5% di CO ₂ in RPMI integratore utilizzando un tubo centrifugare a 327 xg per 5 minuti e lavare in un volume uguale di supporti elettroporazione pre-riscaldato. Nota: elettroporazione media è un mezzo di siero ridotto contenente tamponi e supplementi (vedi materiali di consumo).
   3. Dopo ri-pellet a 327 xg per 5 minuti, risospendere le cellule in 500 ml di mezzi di elettroporazione e lentamente aggiungere ad una cuvetta, aggiungere 5 mg di plasmide in grado PCR _dH 2 O per l'etichettatura di F-actina.
   4. Battere delicatamente la cuvetta sull'area di lavoro cofano per garantire la rimozione di eventuali bolle d'aria nei media, che possono causare la formazione di archi di energia elettrica e per distribuire le cellule in modo uniforme nei media.
   5. Accendere l'apparecchio elettroporazione e la tensione impostata a 300 V e la capacità a 290 Ω. Campione elettroporazione utilizzando un decadimento esponenziale per 20 msec. Nota: L'ottimizzazione può essere richiesto per le cellule diverse e diversi costrutti plasmide.
   6. Una volta che il protocollo è transfezionecompleti, celle negozio in ghiaccio per 1 min prima di continuare.
   7. Trasferire accuratamente le cellule dalla provetta al 6 pozzetti contenenti 5 ml di equilibrata supplemento RPMI dal punto 1.1.1.
   8. Incubare le cellule O / N a 37 ° C + 5% di CO _2.

2. Coprioggetto Coat e Supplemento Imaging pre-caldo

1. Coprioggetto Coat con anticorpi per indurre stimolazione delle cellule T.
   1. Cappotto ciascuna camera di un vetrino da 8 pozzetti con 1 mg / ml αCD3 e αCD28 in 200 l di PBS.
   2. Conservare a 4 ° CO / N. In alternativa, coprioggetto cappotto 2 ore prima di imaging e mantenere in un incubatore a 37 ° C per ridurre la dispersione durante il processo di imaging riducendo al minimo le variazioni di temperatura al vetrino.
2. Creare un campione di prova vetrino con microsfere fluorescenti 0,1 micron sub-diffrazione.
   1. Soluzione madre vortice di perline per evitare grumi.
   2. In una nuova, coprioggetto pulito di the stesso tipo di quelli utilizzati in fase 2.1.1, pipetta 5 ml soluzione madre microsfere fluorescenti sulla superficie (come da istruzioni del produttore).
   3. Distribuire soluzione microsfere sopra il vetrino con la punta della pipetta.
   4. Lasciare asciugare, quindi applicare 200 ul medio di montaggio come PBS.
      Nota: il mezzo di montaggio deve corrispondere a quello utilizzato per i campioni di cellule di imaging.
3. Equilibrare HBSS (+ HEPES 20 mM, di seguito denominato 'HBSS integratore') in una provetta da centrifuga mettendo in un incubatore a caldo pre-O / N a 37 ° C + 5% CO _2.
   Nota: l'aggiunta di HEPES è di buffer di CO _2, se si utilizza una camera di incubazione con CO _{2 ingressi} saltare questa integrazione.

3. Microscopio Set-up

1. Accendere incubatore fase-top del microscopio e posto acqua distillata sufficiente TIRF-SIM nel serbatoio del microscopio a coprire completamente la base dell'elemento riscaldante. Permettere all'acqua di all'equilibrate a 37 ° C. Aggiungere il collare di riscaldamento per la lente dell'obiettivo, anche impostato a 37 ° C.
   Nota: A causa della sensibilità del set-up, questi passaggi sono fatto la notte prima quindi i componenti ottici sono ad una temperatura stabile prima di imaging.
2. Posizionare il TIRF 488 blocco reticolo compatibile nel percorso della luce del microscopio e fissarlo in posizione.
   1. Cambiare la modalità di canale e il cavo in fibra nella posizione 'Single' sul palco base del laser e microscopio, rispettivamente, di coinvolgere il percorso ottico corretto per la modalità TIRF-SIM. Nota: Saltare questo passaggio porterà ad un errore (Figura 1A) all'interno della finestra del software.
3. Accendere tutti i componenti del microscopio e computer e aprire il software di controllo di acquisizione.
   1. Aprire il pannello OC, Ti Pad, N-SIM Pad e ND Acquisition finestre (Figura 1B). Nel 'Pannello OC' selezionare l'opzione 'TIRF 488' (Figura 2B, freccia gialla).
   2. Nella finestra N-SIM Pad, selezionare il 'TIRF-SIM' e impostazioni 'Moving' (Figura 2C, frecce gialle). Selezionare il pulsante Impostazioni (Figura 1C, scatola gialla) e selezionare 'TIRF 488 (per 100x TIRF 488 nm)' dal menu a discesa, ha colpito 'Apply' e 'OK'.
   3. Impostare le impostazioni della fotocamera in 'Impostazioni DU897' a: Frame Rate 50 msec, modalità di lettura, EM guadagno 3 MHz a 14 bit, e EM guadagno moltiplicatore 300 con un guadagno di conversione di 1 (figura 1C, scatola verde).
      Nota: vedi Rappresentante dei risultati in base a considerazioni di frame rate.
   4. Calibrare illuminazione del microscopio per TIRF-SIM selezionando l'obiettivo 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF, sulla 'N-SIM Pad' accendere la potenza del laser 488 nm a 10%.
      Nota: le dimensioni dei pixel delle immagini prime è di 60 nm, con un campo di 512 x 512 pixel di vista.
   5. Pulire la lente dell'obiettivo con panno per lenti per rimuovere la polvere e l'olio.
4. Trovare il piano focale TIRF-SIM.
   1. Iniziare con l'obiettivo nell'eventuale piano z più basso. Mettere una goccia di olio lente sull'obiettivo e aggiungere il campione microsfere fluorescenti dal punto 2.2 al palco microscopio.
   2. Selezionare la funzione perfetta Focus System (PFS) situata sul corpo del microscopio.
   3. Spostare lentamente l'obiettivo attraverso il piano z finché il pulsante PFS smette di lampeggiare per confermare il piano focale è stato raggiunto.
   4. Passare alla visualizzazione 'Live' sul software di controllo e l'immagine le microsfere di regolazioni finali effettuate utilizzando la rotella micromanipolatore PFS.
5. Osservare l'illuminazione uniforme senza emissione out-of-focus fluorescenza sopra l'onda evanescente 75 nm.
   Nota: Conferma illuminazione strutturato si realizza osservando un pattern di illuminazione fluttuante dal campione microsfere fluorescenti.
6. Misurare campione microsfere fluorescenti e quantificare il miglioramento resolut immaginiion osservando la larghezza a metà massimo (FWHM) del profilo di intensità.
   1. Aprire il software Analyze (v4.20.01), con il modulo di NIS-N-SIM Analisi installato e selezionare "Applicazioni" -> 'Mostra finestra N-SIM'.
   2. Con il contrasto di modulazione illuminazione (IMC) e la soppressione del rumore ad alta risoluzione (HRNS) impostato a 1 per dataset TIRF-SIM (Figura 2), ricostruire l'immagine del campione microsfere di generare una immagine ricostruita di 1.024 x 1.024 pixel con una dimensione dei pixel di 30 nm.
   3. Con lo strumento linea di profilo con una larghezza di 1 pixel (Figura 3A, scatola gialla), tracciare una linea attraverso il centro di un unico microsfere.
   4. Selezionare il pulsante FWHM (figura 3B, scatola gialla) e fare clic in corrispondenza del massimo di intensità della distribuzione gaussiana, seguito dalla sua intensità minimi.
   5. Conferma la FWHM della microsfera è nell'intervallo di 100 nm (Figura 3C). Nota: la risoluzione achquando di imaging campioni biologici ieved variano a seconda del rapporto segnale-rumore di efficienza di etichettatura e fluorescenza di fondo.

4. Preparazione del campione per l'imaging

1. Preparazione Coverslip.
   1. Recupera coprioggetto αCD rivestite dal punto 2.1 da frigo o in un incubatore e rimuovere PBS contenente αCD3 e αCD28 da ogni pozzetto.
   2. Aggiungere 200 ml di pre-riscaldato supplemento HBSS dal punto 2.3 a ciascun pozzetto del vetrino. Lavare e togliere per garantire il minimo αCD3 e αCD28 viene lasciato in soluzione. Aggiungere altri 200 ml di supplemento HBSS ai pozzetti coprioggetto.
   3. Pulire la parte inferiore del vetrino con il tessuto dell'obiettivo per rimuovere l'olio e particolato.
2. Posizione vetrino sul palco microscopio e trovare il piano focale TIRF del vetrino utilizzando il piano z PFS come si trova al punto 3.4.
3. Preparazione cellulare.
   1. Dispensare 200 microlitri della con supporticontenenti cellule trasfettate dal punto 1.1.8 in un tubo di micro-centrifuga.
   2. Cellule pellet in un micro-centrifugare a 268 xg per 20 secondi e rimuovere i supporti cellulari.
   3. Risospendere le cellule in 200 ml preriscaldata HBSS supplemento dal punto 2.3.

5. Le cellule Imaging

1. Prendere cella contenente HBSS supplemento al microscopio e delicatamente pipetta 200 microlitri in uno dei pozzi.
2. Pur rimanendo nel piano focale TIRF al vetrino (in modalità PFS), utilizzare l'oculare microscopio e illuminazione epifluorescenza per monitorare le cellule fluorescenti avvicina il vetrino.
3. Una volta che le cellule atterrano sul vetrino, passare alla modalità 'Live' nel N-SIM Pad per portare l'immagine sul monitor e controllare le celle sono a fuoco sullo schermo del computer.
4. Per registrare il tempo-corsi, aprire la finestra ND Acquisizione e selezionare la scheda 'Time', fare clic su 'Aggiungi' e impostare 'Intervallo' a Nessun ritardo, 'Durata'a 10 minuti, 'Loop' è impostato a 1.
   Nota: durata può essere cambiato a seconda del processo di interesse; il software STICS può estrarre risultati quantitativi, con pile di immagini di ≈10 fotogrammi quando catturato con 'Nessun ritardo'.
5. Con le impostazioni di acquisizione identici al campione tallone, avviare la registrazione dati selezionando 'Esegui ora' nella finestra di acquisizione ND.

6. Ricostruire SIM Immagini

1. Dopo l'imaging, aprire il software Analyze (v4.20.01), con il modulo di NIS-N-SIM Analisi installato e selezionare "Applicazioni" -> 'Mostra finestra N-SIM'.
2. Con il contrasto di modulazione illuminazione (IMC) e la soppressione del rumore ad alta risoluzione (HRNS) impostato a 1 per dataset TIRF-SIM (figura 2), ricostruire uno (o più utilizzando lo strumento di batch) File SIM prima per produrre una immagine ricostruita SIM.
3. Confermare il file ricostruita ha una dimensione dei pixel di 30 nm, indicato nellaimmagine barra di stato.
   Nota: Dimensione pixel non influisce analisi STICS ma dovrebbe essere almeno 2 più piccolo nella dimensione della risoluzione spaziale PSF per garantire la correlazione spaziale tra pixel.
4. Esportare i dati come file TIFF, pronti per l'analisi STICS.

7. STICS Analisi

1. Scaricare ed estrarre il STIC (C) S pacchetto Matlab software (Wiseman laboratorio, disponibili come informazioni supplementari). Il stics_vectormapping.m script è il cuore di una singola analisi STICS canale e le prime 30 righe di codice vengono utilizzati per definire i parametri di input, come definito nella sezione 2.1 del manuale. Aprire questo script e definire i parametri di input per TIRF-SIM analisi dei dati. Si suggerisce di aggiungere anche la cartella STIC (C) S con sottocartelle alla macchina percorso Matlab locale, come descritto nell'appendice del manuale.
   1. Definire i parametri di input per l'analisi dei dati modificando le linee corrispondenti del codice
   2. Per eseguire analisi dei dati TIRF-SIM per generare 1 mappa vettoriale, impostare i parametri temporali per sottoregione temporale in linea 31 per il numero massimo di fotogrammi e lo spostamento temporale in linea 32 a 1. Per ottenere una serie temporale di mappe vettoriali variare questi parametri .
   3. Per il filtro di rimozione Immobile, impostare il parametro 'filtraggio' (linea 23) per 'Moving media' e impostare il parametro 'MoveAverage' (linea 24) a 21.
      Nota: Questa impostazione ha dimostrato di funzionare per movimento lento e grandi segnali di fluorescenza, in quanto si basa su sottraendo trame seriali dal telaio analizzato.
   4. Modificare le linee 33-38 per impostare il nome del file di output e titoli delle mappe vettoriali in uscita, così come il percorso della directory di output e definire in quale formato devono essere salvate le immagini di mappe vettoriali.

Dimensione del pixel (micron)	0.03 micron	Linea 19
Frame rate (sec)	1 secondo	Linea 20
Tempo massimo di ritardo (frames)	20 fotogrammi	Linea 21
Dimensioni subregione (pixel)	8 pixel	Linea 29
Spaziatura subregione (pixel)	1 pixel	Linea 30

2. Aprire le run1ChannelSTICS di script nella finestra Matlab Editor. Caricare la serie di immagini eseguendo linee 1-23 di questo script.
   Nota: Questo script può essere utilizzato per caricare e pre-processo serie di immagini, tracciare le mappe vettoriali e istogrammi di velocità ed eseguire una elaborazione batch per molti file. Se necessario, ritagliare l'immagine di una regione di interesse utilizzando la linea 24-26 di questo script.
   1. Linee Run 29-35 di run1ChannelSTICS per iniziare l'analisi STICS. Quando richiesto, selezionare un poligono per indicare una specifica regione di interesse (ROI), se lo si desidera. Assicurarsi che il ROI non si sovrapponga con il bordo delle cellule, come si verificano artefatti contorno quando STICS analizza questi reregioni.
   2. Linee Run 38-52 per visualizzare le mappe di vettore. Per tracciare l'istogramma velocità di grandezza, le linee 53-72 eseguire.

Risultati

Impostazioni del microscopio

Dopo aver raggiunto con successo tutte le fasi del ricercatore avrà illuminazione strutturata compiuto (SIM) di imaging del flusso F-actina in una sinapsi delle cellule T (Video 1), e quantificato questo flusso molecolare mediante spettroscopia immagine correlazione spazio-temporale (Figura 4 ^11). Prima di registrare immagini, garantire l'illuminazione del campione è uni...

Discussione

Questa tecnica permetterà ai ricercatori di immagine e quantificare precedentemente dettagli irrisolvibili in cellule che esprimono fluorescenza. Nei nostri risultati ci mostrano che F-actina scorre in modo simmetrico dalla periferia verso il centro cella di cella nella cella di T IS. Questi risultati sono in linea con le precedenti risultati di linea 1D dati del profilo chimografo ¹³ ed estendere la capacità di analisi dei dati super-risoluzione 2D e.

La tecnica presentata è una ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali di consumo:
Jurkat E6.1 celle	APCC	ATTC TIB-152
RPMI	Life Technologies	21875-091
FBS	Sigma	F7524-500ML
Penicillina-Strepromicina	Tecnologie di vita	15140-122
HBSS	Life Technologies	14025-050
HEPES	Life Technologies	15630-056
#1.5 Vetrini coprioggetti Labtek a 8 pozzetti	NUNC, Labtek	155409
LifeAct GFP construct	Ibidi	60101
OptiMem	Life Technologies	51985-042
anti-CD3	Cambridge Bioscience	317315
anti-CD28	BD Bioscience / Insight Biotechnology	555725
PBS	Life Technologies	20012-019
Olio
per lentiName	Company	Numero di catalogo	Comments
Attrezzatura:
Gene Pulsar Xcell System	BioRad	165-2660
Cuvetta (0,4 cm)	BioRad	165-2088
Centrifuga (5810R)	Eppendorf	5805 000.327
Centrifuga (Heraeus)	Biofuga pico	75003235
piastra a 6 pozzetti	Corning	3516
Incubatore da palco	Tokai Hit	INUH-TIZSH
Nikon Microscopio N-SIM Nikon	Contatta l'azienda		Nikon
Software di analisi	Nikon	Contatta l'azienda
Incubatore ( 190D)	LEEC	Contatta l'azienda