Articolo metodologico

Valutare Specificità di farmaci antitumorali

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DOI:

10.3791/53752

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23 marzo 2016

1Department of Maxillofacial Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2Department of Neurology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 3Laboratory for Tumor Biology and Regenerative Medicine, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è quello di valutare la specificità dei farmaci antitumorali in vitro utilizzando colture miste contenenti cellule sia tumorali e non tumorali.

Abstract

È dimostrata una procedura di valutazione specificità dei farmaci antitumorali in vitro utilizzando colture contenenti cellule sia tumorali e non tumorali. L'elemento chiave è la determinazione quantitativa di un'alterazione genetica tumore-specifica in relazione ad una sequenza universale usando un test PCR digitale dual-sonda e il successivo calcolo della percentuale di cellule tumorali. Il test viene eseguito su una coltura contenente cellule tumorali di una linea consolidata e spillo in cellule non tumorali. La coltura mista è trattato con un farmaco di prova a varie concentrazioni. Dopo il trattamento, il DNA viene preparato direttamente dalle cellule adesive sopravvissute in pozzetti di piastre da 96 pozzetti utilizzando un metodo semplice e poco costoso, e sottoposto ad un test PCR digitale dual-sonda per la rilevazione di una alterazione genetica tumore-specifica e una sequenza universale di riferimento . Nella presente dimostrazione, una delezione eterozigote del gene NF1 è usato come l'alterazione genetica tumore-specifica eun gene RPP30 come gene di riferimento. Utilizzando il rapporto NF1 / RPP30, è stata calcolata la percentuale di cellule tumorali. Poiché il cambiamento dose-dipendente della percentuale di cellule tumorali fornisce un'indicazione in vitro per la specificità del farmaco, questo test genetici e basato su cellule in vitro probabilmente avrà potenziali applicazioni per la scoperta di farmaci. Inoltre, per il cancro personalizzato-cura, questo strumento genetico-e a base di cellule può contribuire ad ottimizzare la chemioterapia adiuvante per mezzo di efficacia sperimentazione e la specificità dei farmaci candidati che utilizzano colture primarie di singoli tumori.

Introduzione

Gli effetti terapeutici dei farmaci antitumorali sulle cellule tumorali sono associati a vari effetti tossici indesiderati sulle cellule non tumorali. Gli effetti tossici sono difficili da valutare in laboratorio, in gran parte a causa della mancanza di strumenti adeguati1. Le colture cellulari contenenti sia cellule tumorali che non tumorali fornirebbero una potenziale risorsa in vitro per valutare la specificità o la selettività di un farmaco che potrebbe far luce sulla tossicità clinica. Tuttavia, i test in vitro convenzionali come i test di proliferazione o vitalità misurano l'effetto di un farmaco sulle cellule totali, ma non possono dividere l'effetto in una parte sulle cellule tumorali e una parte su cellule non tumorali. Ad esempio, una riduzione del 50% del numero totale di cellule in una coltura composta per il 50% da cellule tumorali e per il 50% da cellule non tumorali può implicare la morte di tutte le cellule tumorali, la morte di tutte le cellule non tumorali o, più probabilmente, la morte di parti di entrambe a vari rapporti.

Anche a causa di questo problema tecnico, le colture primarie che contengono cellule stromali tumorali e non tumorali sono spesso inadatte per testare i farmaci. D'altra parte, a causa di questa eterogeneità cellulare, le colture primarie assomigliano molto meglio ai loro tumori originali rispetto alle cellule clonali in linee cellulari consolidate2. Ancora più importante, le colture primarie sono specifiche per il paziente e possono consentire test antidroga individualizzati2-4.

Una questione essenziale è quindi lo sviluppo di un metodo per determinare la proporzione di cellule tumorali in colture miste, comprese le colture primarie. Per affrontare questa sfida, è stata concepita una soluzione genetica basata sulla determinazione del rapporto quantitativo tra una caratteristica genetica specifica del tumore e una sequenza di riferimento universale. Da questo rapporto è possibile calcolare la proporzione di cellule tumorali in una coltura mista.

Questo studio illustra la procedura dello strumento genetico e cellulare per valutare la specificità dei farmaci antitumorali, tra cui (1) preparazione di una coltura mista da cellule tumorali di una linea consolidata e fibroblasti non tumorali, (2) trattamento della coltura mista con un farmaco di prova, (3) preparazione del DNA per la PCR digitale, (4) determinazione del rapporto tra una delezione eterozigote specifica del tumore e una sequenza di riferimento utilizzando un test PCR digitale a goccia a doppia sonda, (5) calcolare le proporzioni delle cellule tumorali a ciascuna concentrazione di farmaco e (6) elaborare la variazione dose-dipendente della proporzione di cellule tumorali.

Protocollo

1. Preparazione Culture Mix contenenti sia le cellule tumorali e cellule non tumorali

  1. Utilizzare le cellule tumorali da una linea di cellule stabilito MPNST S462 5. Utilizzare fibroblasti come le cellule non tumorali 6,7
  2. cellule Culture sia tumorali e fibroblasti in terreno standard DMEM con siero 10% fetale bovino (BSA), 3 mM glutammina, 0,1 mM 2-mercaptoetanolo, 500 U / ml di penicillina, 500 g / ml streptomicina e 1 mM sodio piruvato a 37 ° C e 5% CO 2 5-7. Al sub-confluenza, raccogliere le cellule con 0,05% tripsina e contarli con un emocitometro.
  3. Miscelare 400 cellule tumorali e 1.600 cellule non tumorali insieme in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti in 0,2 ml di mezzo. Considerando crescita più rapida delle cellule tumorali nel periodo di trattamento di 5 giorni, la percentuale iniziale di cellule tumorali è stato fissato al 25%. Impostare 4 repliche per ogni concentrazione di farmaco. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 O / N.

2. DruTrattamento g

  1. Utilizzare nilotinib come la droga test. Preparare soluzioni di 0, 2, 4 e 20 mm nilotinib in DMSO. Diluire ciascuno di loro di 200 volte in 5 ml DMEM media, dando 2-fold concentrate droga-soluzioni di 0, 10, 20 e 100 pM 6.7.
  2. Rimuovere 0,1 ml di mezzo di ogni bene e aggiungere 0,1 ml di terreno contenente il farmaco. Le concentrazioni finali sono 0, 5, 10 e 50 pM. Continuare incubando le cellule in terreno contenente il farmaco per 5 giorni.
  3. Alla fine del trattamento, ispezionare le cellule attaccate usando un microscopio a contrasto di fase e fotografare. Aspirare il mezzo di distanza, lavare le cellule sopravvissute adesivo una volta con 0,2 ml di PBS.

3. Preparazione del DNA per Digital PCR

  1. Lisare le cellule utilizzano HotShot 8.
    1. Aggiungere 50 ml soluzione alcalina lisi (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) in ciascun pozzetto. Sigillare i pozzetti con un foglio. Incubare la piastra a 95 ° C in un forno o su una piastra riscaldante per 30 min. Controllare sotto un MICRoscope per assicurarsi che non più cellule intatte rimaste sulla superficie dei pozzetti. Nel caso in cui le cellule non Lyse completamente, aumentano il tempo di riscaldamento o aggiungere detersivo. Congelare una volta a -20 ° C migliora anche la rottura delle cellule.
    2. Aggiungere 50 ml soluzione neutralizzante (40 mM Tris-HC, pH 4,0) in ciascun pozzetto. Trasferire tutte lisati in U-forma pozzetti di una piastra PCR e secco in un cycler PCR a 95 ° C per 10 a 30 min. Ricostituire i lisati con 20 ml di acqua distillata.
  2. Desalt usando Drop-Dialisi 9
    1. utilizzare filtri a membrana con media dimensione dei pori 0,025 micron.
    2. Float il filtro acqua distillata con lato lucido in pozzetti di una piastra 12 pozzetti. Bagnare il filtro per 5 min. Prestare attenzione per evitare bolle d'aria tra il filtro e l'acqua.
    3. Pipettare lisati ricostituiti di ciascun campione dal punto 3.1.4 delicatezza sulla su ciascuna delle 4 aree del filtro. Coprire la piastra e dializzare per 30 a 60 min.
    4. Succhiare via l'acqua sotto il filtro senza lanciare sopra il filtro né disturbare le gocce.
    5. Trasferire il lisato-gocce in pozzetti di una nuova PCR-plate. Essiccare i DNA-gocce di riscaldamento a 95 ° C per 10 a 30 minuti in un ciclatore PCR. Ricostituire i lisati in 10 microlitri di acqua.

4. Digital PCR

  1. componenti congelati Scongelare quali DNA, tampone e la miscela test a RT, centrifugare per 10 secondi alla massima forza di qualsiasi centrifuga disponibili (ad esempio, VWR minicentrifuga) e poi tenerli in ghiaccio.
  2. Preparare la miscela master contenente tutti i componenti ad eccezione del DNA (Tabella 1). Considerare volume morto e calcolare miscela maestro circa il 10% in più rispetto l'importo richiesto.
    Nota: utilizzare il primer e sonde utilizzate nel kit commerciale.
  3. Vortex la miscela maestro, centrifugare per 10 secondi alla massima forza di qualsiasi centrifuga disponibili (ad esempio, VWR minicentrifuga) ed erogare 15 microlitri di ciascunpozzetto di una piastra a 96-PCR. Aggiungere tutto lisato (che contiene DNA) di ciascun campione ai pozzetti contenenti la miscela master. Trasferire 20 ml di ciascuna miscela di reazione in un pozzo sul lato campione di una cartuccia a RT.
  4. Pipettare 70 ml di olio di generatore gocciolina in ogni pozzetto sul lato olio di una cartuccia. Chiudere la cartuccia con la guarnizione e posizionare l'intera impostazione in un generatore di goccioline. Avviare la generazione delle gocce.
  5. Trasferimento 40 ml di gocce-soluzione in pozzetti di una 96-pozzetti PCR. Sigillare la piastra con un foglio e mettere il piatto in un cycler PCR. Impostare il coperchio temperatura a 105 ° C e rampa velocità a 2 ° C / sec. Effettuare PCR utilizzando le impostazioni nella tabella 2. Dopo la PCR, trasferire la piastra in un lettore di gocce e iniziare a leggere. In alternativa, conservare la piastra a 4 ° C per 24 ore.

5. Calcolo percentuale di cellule tumorali

  1. Caricare il dati digitali PCR ed eseguire analys automaticiè.
  2. Controllare i risultati di ogni test manualmente controllando la distribuzione unidimensionale e 2-dimensionale delle goccioline positivi e negativi, e assicurarsi che siano ben separati e le linee di soglia erano nelle giuste posizioni. Escludere i risultati che non soddisfano i criteri, per esempio, non netta separazione di goccioline positivi e negativi, da ulteriori analisi. Copiare il rapporto NF1 / RPP30 risultante in un foglio excel.
  3. Calcolare la percentuale di cellule tumorali come: 2 x (1- NF1 / RPP30).

6. dose-dipendente Cambio di percentuale di cellule tumorali

  1. Per ogni farmaco-concentrazione, calcolare la media e la deviazione standard dei 4 repliche. Tracciare i mezzi e le deviazioni standard contro droga concentrazioni.

Risultati

Qualità di DNA preparato utilizzando il HotShot combinato / Drop-dialisi è sufficiente per soddisfacente PCR digitale (Figura 1B). Per 2.000 fibroblasti, circa 3000 ± 500 goccioline positivi sono stati ottenuti, corrispondenti al 75% delle attese 4.000 copie (due copie di una cella). In questo studio, le cellule tumorali provenivano da una linea stabilita MPNST S462 che sono noti per avere una delezione eterozigote del gene NF1 5. Questa riduzione dosaggio genico 50% è stato chiaramente rilevato dal dual PCR digitale (Figura 1B). Per contro, due copie di questo gene sono state misurate in fibroblasti. Questa differenza genetica tra cellule tumorali e non tumorali consente di calcolare la proporzione di cellule tumorali in coltura mista (Figura 2). Misurando il relativo gene dosaggio di NF1 al RPP30, percentuale di cellule tumorali in una coltura mista può essere determinatoa ciascun farmaco-concentrazione (Figura 3).

figure-results-1
Figura 1. Digital PCR. (A) illustrazione del principio. (B) un test a doppia sonda rivela quantità ridotta di un gene bersaglio (NF1) in cellule tumorali MPNST S462 in relazione ad un gene di riferimento (RPP30). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2. Percentuale calcolata delle cellule tumorali. Le cellule tumorali e non tumorali cellule sono state mescolate a vari rapporti e seminate in ciascun pozzetto di una 96-piatto. Dopo l'attaccamento O / N ingegno, le cellule sono state lisateh HotShot / Drop-dialisi e lisati dissalate sono stati sottoposti a PCR digitale che ha dato il rapporto di NF1 / RPP30. Base su questo rapporto, è stato calcolato proporzione di cellule tumorali in ciascun pozzetto. Media e deviazione standard della percentuale di cellule tumorali sono stati calcolati da 4 repliche con ogni proporzione di set-up. Le proporzioni calcolati di cellule tumorali (asse Y) sono stati riportati in funzione delle proporzioni di set-up (asse X). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3. dose-dipendente Cambio di percentuale di cellule tumorali. (A) dose-dipendente riduzione delle cellule vitali visibili. (B) percentuale di cellule tumorali (media e deviazione standard di 4 repliche) calcolata dalla Rapporto di NF1: RPP30, diminuito nel range di 0-10 micron. Alla dose massima di 50 micron, poche cellule vitali sono stati lasciati, probabilmente a causa dell'effetto tossico per tutte le cellule. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
. Figura 4. Separazione risposta delle cellule tumorali da quella di cellule non tumorali (A) la vitalità o / e la proliferazione delle cellule totali può essere misurata con test convenzionali; Percentuale di cellule tumorali può essere determinata utilizzando la procedura ha dimostrato in questo studio. (B) utilizzando i due parametri, la risposta delle cellule totali in una coltura mista di un farmaco può essere diviso in risposta delle cellule tumorali e risposta delle cellule non tumorali..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1 Reazione
2 x ddPCR supermix 12
mix Assay per NF1 1.2
mix Assay per RPP30 1.2
HaeIII 0.6
totale parziale 15 miscela master
DNA 9
Totale 24 Finale Miscela PCR

Tabella 1 Installazione dual ddPCR Reazione

Passo Azione Temperatura Tempo cicli
1 Polymcancellare attivazione 95 ° C 10 minuti 1
2 denaturazione del DNA 94 ° C 30 sec 40
3 Ricottura / exetension 60 ° C 1 minuto
4 polimerasi disattivazione 98 ° C 10 minuti 1
5 Hold (opzionale) 4 ° C

Tabella 2 Impostazioni Cycler PCR

Discussione

Il passo fondamentale in questo strumento genetico-e a base di cellule per valutare la specificità dei farmaci in vitro è la determinazione della percentuale di cellule tumorali che utilizzano una o più caratteristiche genetiche tumore-specifici. In contrasto con le caratteristiche fenotipiche convenzionali 7, le caratteristiche genetiche sono specifiche, stabile e facile da quantificare. Ad esempio, una mutazione o variazione del numero di copie tumore-specifico è presente esclusivamente nelle cellule tumorali, ma non nelle cellule non tumorali. Tale stigma genetico può essere affidabile e preciso quantificato, per esempio, utilizzando PCR digitale come dimostrato in questo studio.

Per PCR digitale, ad alta purezza del DNA non è essenziale. Tuttavia, la demineralizzazione e rimozione molecole inibitrici sono necessarie che può essere raggiunto da un drop-dialisi utilizzando un filtro adatto. La lisi e drop-dialisi combinato è semplice e veloce, non richiede strumenti speciali e quindi può essere effettuata in qualsiasi laboratorio standard. Se le cellule non break bene, trattamento aggiuntivo può essere considerato come il congelamento delle cellule a -20 ° C, aggiungendo detergenti o / e con proteasi.

Nel presente studio, la delezione eterozigote del gene NF1 è stato usato come la caratteristica tumore-specifico per la quantificazione. Analogamente, delezioni di altri geni o loci possono anche essere usati. Inoltre, le mutazioni possono essere utilizzati anche per quantificare le cellule tumorali. In tal caso, PCR digitali per il mutante e gli alleli normali devono essere ampiamente validato per garantire la loro specificità per ciascuna di esse.

proporzione dose-dipendente delle cellule tumorali fornisce un'indicazione per droga specificità o selettività. Inoltre, permette anche l'estrazione di risposta delle cellule tumorali la risposta delle cellule totali di una coltura mista a un farmaco (Figura 4). Questa strategia di estrazione fornisce una soluzione al problema tecnico utilizzando colture primarie (che contiene sia tumore e noncellule n-tumorale) per la droga-test.

La genetico-e a base di cellule in vitro strumento dimostrato in questo studio può quindi avere un potenziale di applicazione (1) in farmaco-discovery, dove fornisce una piattaforma per valutare la specificità di droga o di selettività in vitro e (2) nella cura del cancro personalizzato dove consente farmaci di prova in colture primarie e di conseguenza possono contribuire alla droga selezione in chemioterapia adiuvante 4. Inoltre, il meccanismo farmacologico di un farmaco può essere studiata utilizzando questo strumento, dal momento che alcune alterazione genetica o più alterazioni genetiche possono essere seguiti durante la droga-trattamento.

Una difficoltà nel usando colture primarie individualizzati è la mancanza di una funzione genetica universale per la quantificazione delle cellule tumorali. Tuttavia, con l'avanzata di oggi in tutto il sequenziamento del genoma, i geni e le regioni più frequentemente alterata sono noti per i tumori più comuni. Ad esempio, tra testa e collotumori, 71%, 23% e 22% hanno mutazioni nel TP53, FAT1 e geni CDKN2A, e il 60%, 34% e il 26% hanno delezioni in regioni geniche di CDKN2A, STK11 e PTEN, rispettivamente, 10. Screening 5 a 10 tali geni regioni e / o mediante sequenziamento mirato e / o PCR digitale pertanto probabile identificare uno o più alterazioni genetiche che possono essere utilizzati per la quantificazione delle cellule tumorali in coltura principale derivata. Un'altra limitazione è la quantità spesso insufficiente di tumori resecati per la creazione di colture primarie.

Nonostante le caratteristiche vantaggiose e promettente potenziale applicazione della genetico-e a base di cellule in vitro strumento, i suoi limiti devono essere tenuti in mente e la sua natura in vitro deve essere sottolineato. Per esempio, gli effetti differenziali o citotossicità di un farmaco sulle cellule tumorali può piuttosto per differenza di tipi di cellule (fibroblasti contro cellule di Schwann) o loroorigini diverse (da individui diversi). L'effetto più forte di un farmaco sulle cellule tumorali rispetto a cellule non tumorali può essere spiegata dal fatto che il primo crescere più velocemente rispetto al secondo. Ancora più importante, le cellule in vitro comportamento è diverso rispetto alle cellule nel corpo umano e, di conseguenza, i risultati della valutazione in vitro spesso fanno non o solo in parte riflettere la reale situazione clinica. Pertanto, l'efficacia, la citotossicità e la specificità dei farmaci ottenuti per cellule in coltura sono piuttosto dei biomarker natura, ma non hanno l'affidabilità di efficacia preclinically misurata di antibiotici. Tuttavia, passando da linee cellulari di colture miste e / o in colture primarie è un passo avanti nella valutazione della droga-effetto e la specificità / selettività in vitro. Con grandi sforzi, in condizioni in vitro possono essere trovati che consente ragionevole correlazione dei dati in vitro con risposte reali di pazienti, almeno per alcuni farmaci.

Dichiarazioni

La procedura è protetta da brevetto (10 2013 221 452, Germania)

Ringraziamenti

La signora Alster, il signor Honrath e il dottor Jiang sono apprezzati per la loro eccezionale assistenza tecnica. Anche apprezzato è il Dott Volz e il gruppo di ricerca del Dr. Dandri per fornire l'accesso al dispositivo di PCR digitale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtro a membrana di 25 mmdi diametro Merk-MilliporeVSWP 02500Per dialisi a goccia
Saggio ddPCR per NF1BioRaddHsaCP1000177marcato FAM
per RPP30BioRaddHsaCP2500350
QX200BioRad186-4001Nello studio è stata utilizzata la versione precedente QX, che non è più disponibile. Il sostituto è
l'olio per gocciolineBioRad186-3005
Cartriges BioRad186-3004
GuarnizioniBioRad186-3009
Supporto per cartucciaBioRad186-3051
Lamina perforabileBioRad181-4040
Saggio ddPCR Marcato con esagono integrale QX200

Riferimenti

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  9. Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation. Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).
  10. Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets. Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).

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