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Articolo metodologico

Diretto Evolution Metodo

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⸱

DOI:

10.3791/53761

⸱

1 aprile 2016

 ,  , 
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo dettagliato per costruire e selezionare librerie mutanti per campagne di evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae offre molti vantaggi interessanti nella progettazione di enzimi per applicazioni biotecnologiche, un processo che prevede la realizzazione, la clonazione e l'espressione di biblioteche mutante, accoppiato ad alta frequenza omologa ricombinazione del DNA in vivo. Qui, vi presentiamo un protocollo per creare e biblioteche schermo mutanti di lievito in base l'esempio di un fungina aril-alcol ossidasi (AAO) per migliorare la sua attività totale. Due segmenti proteici sono stati sottoposti ad evoluzione focalizzata diretto mediante mutagenesi casuale e in vivo ricombinazione DNA. Le sporgenze di ~ 50 bp fiancheggianti ogni segmento ammessi corretto rimontaggio del gene AAO-fusione in un vettore linearizzato dando luogo ad una completa plasmide autonomamente replicare. Librerie Mutant arricchiti con varianti funzionali AAO sono stati proiettati in S. surnatanti cerevisiae con un saggio ad alta sensibilità basato sulla reazione di Fenton. Il processo generale dicostruzione della libreria a S. cerevisiae qui descritto può essere facilmente applicato ad evolversi molti altri geni eucarioti, evitando reazioni PCR in più, in vitro di ricombinazione del DNA e legatura passi.

Introduzione

Evoluzione molecolare diretto è un metodo affidabile, veloce e affidabile per progettare enzimi 1, 2., Attraverso cicli iterativi di casuali mutazioni, ricombinazione e lo screening, le versioni migliorate di enzimi possono essere generati che agiscono sui nuovi substrati, nelle reazioni romanzo, a non naturale ambienti, o anche per assistere alla cella di raggiungere nuovi obiettivi metabolici 3-5. Tra i padroni di casa utilizzate in evoluzione diretta, di birra lievito Saccharomyces cerevisiae offre un repertorio di soluzioni per l'espressione funzionale di proteine ​​eucariotiche complesse che non sono altrimenti disponibili in controparti procarioti 6,7.

Utilizzato esaustivamente in studi di biologia cellulare, questo piccolo modello eucariote ha molti vantaggi in termini di modificazioni post-traduzionali, la facilità di manipolazione e trasformazione di efficienza, che sono tutti tratti importanti per progettare enzimi dalla evoluzione diretta 8. Inoltre, l'alta frequenzadi omologa ricombinazione del DNA a S. cerevisiae accoppiato al suo apparato a prova di lettura efficiente apre una vasta gamma di possibilità per la creazione di una biblioteca e di assemblaggio genica in vivo, favorendo l'evoluzione dei sistemi diversi da singoli enzimi per vie artificiali complessi 9-12. Il nostro laboratorio ha trascorso gli ultimi dieci anni la progettazione di strumenti e strategie per l'evoluzione molecolare di diverse ligninases nel lievito (ossidoriduttasi coinvolti nella degradazione della lignina durante il decadimento legno naturale) 13-14. In questa comunicazione, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione e le librerie schermo mutanti in S. cerevisiae per un modello flavooxidase, arile-alcol ossidasi (AAO 15) -, che può essere facilmente tradotto a molti altri enzimi. Il protocollo prevede un metodo di evoluzione mirata-diretto (MORPHING: mutageni organizzata ricombinazione omologa processo da in vivo raggruppamento) assistito dall'apparato cellula di lievito 16, unda test di screening molto sensibile basato sulla reazione di Fenton per rilevare l'attività all'AAO secreta nel brodo di coltura 17.

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Protocollo

1. Mutant Biblioteca Edilizia

  1. Visita le regioni da sottoporre a MORPHING con l'aiuto di algoritmi di calcolo basati sui modelli di struttura di cristallo o di omologia disponibili 18.
    1. Qui, indirizzare due regioni di AAO da Pleurotus eryngii per mutagenesi casuale e ricombinazione (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mentre amplificando il resto del gene (844 bp) di alta fedeltà PCR (Figura 1).
      Nota: Diversi segmenti possono essere studiati morphing in modo indipendente o combinata 16.
  2. Amplificare le zone interessate dal mutageno PCR. Creare zone tra i segmenti (~ 50 bp ciascuno) si sovrappongono sovrapponendo reazioni PCR delle regioni definite.
    1. Preparare mutageno PCR di segmenti target in un volume finale di 50 ml contenenti DNA stampo (0,92 ng / mL), 90 nM oligo senso (RMLN per segmento MI e AAO-BP per il segmento M-II), 90 nM di unntisense Primer (AAO-92C per il segmento MI e RMLC per il segmento M-II), 0,3 mM dNTP (0,075 mM ciascuno), 3% (v / v) dimetilsolfossido (DMSO), 1,5 mM MgCl 2, 0,05 mM MnCl 2 e 0,05 U / ml Taq DNA polimerasi. Primer sequenze sono descritti in Figura 1.
    2. Utilizzare il seguente programma PCR: 95 ° C per 2 min (1 ciclo); 95 ° C per 45 sec, 50 ° C per 45 sec, 74 ° C per 45 sec (28 cicli); e 74 ° C per 10 min (1 ciclo).
  3. Amplificare le regioni non mutageni con ultra-alto polimerasi fedeltà e comprende anche le zone di sovrapposizione corrispondenti segmenti mutageni e / o sbalzi vettore linearizzati.
    1. Preparare miscele di reazione in un volume finale di 50 ml contenente: template DNA (0,2 ng / ml), 250 nM oligo senso HFF, 250 nM oligo antisenso HFR, 0,8 mM dNTP (0,2 mM ciascuno), 3% (v / v) dimetilsolfossido (DMSO) e 0,02 U / ml iProof DNA polimerasi. Primer sequenze sono descritti in Figura 1.
    2. Utilizzare il seguente programma PCR: 98 ° C per 30 sec (1 ciclo); 98 ° C per 10 sec, 55 ° C per 25 sec, 72 ° C per 45 sec (28 cicli); e 72 ° C per 10 min (1 ciclo).
      Nota: Con le condizioni descritte in 1.2 e 1.3 sovrapposizioni di 43 bp (regione plasmide-M1); 46 bp (M1 regione regione-HF); 47 bp (HF regione-M2 regione) e 61 bp (M2 plasmide regione-) sono progettate (Figura 1) per favorire in vivo splicing nel lievito.
    3. Purificare tutti i frammenti di PCR (mutageni e non mutageni) con un kit di estrazione gel commerciale secondo il protocollo del produttore.
  4. Linearizzare il vettore tale che regioni fiancheggianti di circa 50 bp sono creati che sono omologhi ai 5'- e 3'-estremità del gene bersaglio.
    1. Preparare una miscela di reazione linearizzazione contenente 2 mg di DNA, 7.5 U Bam HI, 7.5 U Xho I, 20 mg BSA e 2 ml di tampone Bam HI 10x in un volume finale di 20 ul.
    2. Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 2 ore e 40 min. Successivamente, procedere con inattivazione a 80 ° C per 20 min.
  5. Purificare il vettore linearizzato mediante estrazione gel di agarosio per evitare la contaminazione con il plasmide circolare residua (Figura 2).
    1. Caricare la miscela di reazione di digestione nel mega-well di un basso punto di fusione gel semi-preparativa (0,75%, w: v) e un'aliquota (5 ml) della miscela di reazione nella adiacente e reporter.
    2. Run DNA elettroforesi (5 V / cm tra gli elettrodi, 4 ᵒC) e separare il gel corrispondente al mega-bene e conservarlo a 4 ᵒC in 1x TAE.
    3. Macchia la corsia con la scala peso molecolare e il giornalista. Visualizzare le bande sotto la luce UV. Nick la posizione in cui i luoghi linearizzate vettore.
      Nota: Poiché la qualità del vettore linearizzato purificato è un critiFattore cal per ricombinazione di successo e di assemblaggio nel lievito, evitare di macchiare il gel per semi-preparativa elettroforesi del DNA. L'uso di coloranti e raggi UV per l'estrazione gel può influenzare la stabilità del vettore di DNA, compromettere l'efficienza vivo ricombinazione in. In alternativa ai coloranti EtBr tossici, Gel Rosso e coloranti SYBR sono comunemente usati per il gel di colorazione.
    4. In assenza di luce UV, di individuare il vettore linearizzato nel frammento mega-pozzetto utilizzando la guida dei nick nella corsia giornalista macchiato in modo che possa essere isolato.
    5. Estrarre il vettore linearizzato da agarosio e purificarla con un kit di estrazione gel commerciale secondo il protocollo del produttore.
      Nota: utilizzare ad alta copia vettori navetta episomiale con marcatori di antibiotici e auxotrofia: In questo esempio abbiamo impiegato il uracile indipendente e ampicillina resistenza pJRoC30 vettore, sotto il controllo del promotore di lievito GAL1.
  6. Preparare un mi equimolarexture dei frammenti PCR e mescolare con il vettore linearizzato in un rapporto 2: 1, con non meno di 100 ng di plasmide linearizzato (prova differenti rapporti di biblioteca equimolare / vettore aperta per ottenere buone rese di trasformazione).
    1. Misurare l'assorbanza dei frammenti di PCR e vettore linearizzato a 260 nm e 280 nm per determinare la loro concentrazione e purezza.
  7. Trasformare cellule competenti di lievito con la miscela di DNA utilizzando un kit di lievito di trasformazione commerciale (vedi tabella per le forniture) in base alle istruzioni del produttore.
    1. Qui, usare una proteasi carente e URA3 - dipendente S. ceppo cerevisiae, BJ5465. Trasformare le cellule con il vettore circolarizzato parentale come standard interno durante lo screening (vedi sotto). Inoltre, controllare il fondo trasformando il vettore linearizzato in assenza di frammenti di PCR.
      Nota: In caso di rilevamento di livelli iniziali di secrezione bassi, usare S.cerevisiae proteasi ceppi carenti come BJ5465 per favorire l'accumulo di proteina attiva in sovranatanti. Se l'enzima bersaglio subisce hyperglycosylation, l'uso di ceppi glicosilazione-deficienti (ad esempio, Δ kre2 che è solo in grado di associare piccoli oligomeri mannosio) potrebbe essere una scelta adatta.
  8. Piastra le cellule trasformate su SC piastre di abbandono e incubare a 30 ° C per tre giorni. Piastra (su SC piastre di abbandono integrato con uracile) URA3 - S. cellule cerevisiae prive plasmide come controllo negativo per lo screening (vedi sotto).

2. Alta-Throughput Screening Assay (Figura 3)

  1. Riempire un numero appropriato di sterili piastre da 96 pozzetti (23 piastre per analizzare una libreria di cloni 2.000) con 50 microlitri terreno minimo per pozzetto con l'aiuto di un robot pipettamento.
  2. Scegli singole colonie dalla SC-drop out piatti e trasferirli alle piastre a 96 pozzetti.
    1. In ogni piatto, inoculare numero di colonna 6 con il tipo parentale come standard interno e ben H1 con URA3 - S. cellule cerevisiae (in media SC supplementato con uracile) senza plasmide come controllo negativo.
      Nota: Beh H1 è riempito in particolare con i media di abbandono integrati con uracile. Un supporto vuoto pozzetto contenente senza cellule può essere preparata anche come controllo di sterilità aggiuntivo.
  3. Coprire le piastre con i loro coperchi e avvolgerli in Parafilm. Incubare le piastre per 48 ore a 30 ° C, 225 rpm e 80% di umidità relativa in un agitatore umido.
  4. Rimuovere il Parafilm, aggiungere 160 ml di mezzo di espressione ad ogni pozzetto con l'aiuto del robot pipettaggio, sigillare le piastre e incubare per altre 24 ore.
    Nota: terreno minimo e medio espressione sono preparati come riportato altrove 19. livelli di secrezione possono variare a seconda del gene in esame e, di conseguenza, tha incubazione devono essere ottimizzati in ogni caso a sincronizzare la crescita cellulare in tutti i pozzetti.
  5. Centrifuga i piatti (master) a 2.800 x g per 10 minuti a 4 ° C.
  6. Trasferire 20 ml di surnatante dai pozzetti della piastra master piastra replica utilizzando una movimentazione multistazione robotico liquido.
    Nota: Per favorire la secrezione di enzimi si consiglia di sostituire il segnale peptide nativo della proteina bersaglio da peptidi segnali comunemente utilizzati per l'espressione eterologa in lievito (ad esempio, il fattore α prepro-leader, il leader del K 1 Killer tossina da S. cerevisiae, o anche versioni chimeriche di entrambi i peptidi 13). In alternativa, il peptide segnale nativo può essere evoluto esclusivamente per la secrezione nel lievito.
  7. Aggiungere 20 ml di 2 mM p -methoxybenzylalcohol a 100 mM sodio fosfato tampone pH 6.0 con l'aiuto del robot pipettamento. Mescolare le piastre brevemente con un 96-noill mixer piastra e incubare per 30 minuti a RT.
  8. Con il robot pipettaggio, aggiungere 160 ml di reagente FOX per ciascuna piastra replica e mescolare brevemente con il mixer (concentrazione finale di miscela FOX nel pozzo: 100 mM xilenolo arancio, 250 mM Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 e 25 mM H 2 SO 4).
    1. Aggiungere più additivi al reagente per migliorare la sensibilità, come co-solventi organici (DMSO, etanolo, metanolo) o sorbitolo 17. Qui, amplificare la risposta con l'aggiunta di sorbitolo ad una concentrazione finale di 100 mM (Figura 4).
  9. Leggere le piastre (modalità end-point, t 0) a 560 nm su un lettore di piastre.
  10. Incubare le piastre a temperatura ambiente fino a quando il colore si sviluppa e misurare nuovamente l'assorbimento (t 1).
    1. Calcolare l'attività relativa dalla differenza tra il valore Abs dopo incubazione e quella della misurazione iniziale normalizzati al pareTipo ntale per ogni piastra (Dt 1 - t 0).
  11. Sottoporre i migliori successi mutanti a due ri-proiezioni consecutive per escludere falsi positivi.
    Nota: Tipicamente, ri-proiezioni includono isolamento plasmidico dal lievito, amplificazione e purificazione in Escherichia coli, seguita da trasformazione di cellule di lievito fresco con il plasmide 19. Ogni clone selezionato è ri-proiettato in pentaplicate.

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Risultati

AAO da P. eryngii è un flavooxidase extracellulare che fornisce perossidasi fungine con H 2 O 2 per iniziare attaccare lignina. Due segmenti di AAO stati sottoposti a evoluzione focalizzata-diretto da MORPHING al fine di migliorare la sua attività e la sua espressione in S. cerevisiae 19. Indipendentemente dalle enzimi stranieri nutriti da S. cerevisiae, la questione più critica quando la costruzione di librerie di mutanti nel l...

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Discussione

In questo articolo, abbiamo riassunto la maggior parte dei suggerimenti e trucchi impiegati nel nostro laboratorio per progettare enzimi dalla evoluzione diretta a S. cerevisiae (utilizzando AAO come esempio) in modo che possano essere adattati per l'uso con molti altri sistemi enzimatici eucariotica semplicemente seguendo l'approccio comune descritti qui.

In termini di creazione di biblioteca, Morphing è un metodo rapido one-pot di introdurre e ricombinare le mutazioni casu...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal progetto della Commissione Europea Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; da un Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; e dai Progetti Nazionali Dewry [BIO201343407-R] e Cambios [RTC-2014-1777-3].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1. Terreni di coltura
Ampicillina sale sodicoSigma-AldrichA0166CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto AgarDifco214010
CloramfenicoloSigma-AldrichC0378CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-GalattosioSigma-AldrichG0750CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG5767CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinosio pentaidratoSigma-Aldrich83400CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
PeptoneDifco211677
Fosfato di potassio monobasicoSigma-AldrichP0662CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
UracilSigma AldrichU1128
Estratto di lievitoDifco212750
Lievito base azotata senza aminoacidiDifco291940
Lievito sintetico drop-out Medium Integratori senza uracileSigma-AldrichY1501
NameCompanyNumero di catalogoComments
2. Reazioni PCR
dNTP MixAgilent genomics200415-5125 mM ciascuno
iProof High-Fidelity DNA polimerasiBio-rad172-5301
Cloruro di manganese(II) tetraidratoSigma-AldrichM8054CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA polimerasiSigma-AldrichD4545Per errore prono PCR
NameCompanyNumero di catalogo>Comments
3. Linearizzazione plasmidica
BamHI enzima di restrizioneNew England BiolabsR0136S
Albumina sierica bovinaNew England BiolabsB9001S
Enzima di restrizione XhoINew England BiolabsR0146S
Enzima di restrizione Non IEngland BiolabsR0189S
Gel RossoBiotium41003Per la colorazione del DNA
strong>NomeAziendaNumero di catalogoComments
4. Saggi FOX
Solfato di ferro (II) ammonio esaidratoSigma-AldrichF3754CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Alcool AnysilSigma AldrichW209902CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-SorbitoloSigma-AldrichS1876CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Perossido di idrogeno 30%Merck Millipore1072090250FOX curva standard
Xilenolo Arancio sale disodicoSigma-Aldrich52097CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
NameCompanyNumero di catalogoComments
5. Agarosio gel stuff
AgaroseNorgen28035CAS Nº 9012-36-6
Gel RedBiotium41003Colorante per l'analisi del DNA
GeneRuler 1kb LadderThermo ScientificSM0311DNA M.W. standard
Loading Dye 6xThermo ScientificR0611
Agarosio a bassa temperatura di fusioneBio-rad161-3112CAS Nº 39346-81-1
NomeAziendaNumero di catalogoComments
6. Kit e cellule
S. cerevisiae ceppo BJ5465LGC PromochemATTC 208289Ceppo carente di proteasi con genotipo: MAT&alfa; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue cellule competentiAgilent genomics200150Per la purificazione e l'amplificazione dei plasmidi
NucleoSpin Gel e PCR Clean-up KitMacherey-Nagel740,609,250Estrazione del gel di DNA
Kit plasmidico NucleoSpinMacherey-Nagel740,588,250Kit miniprep a colonna
Kit di trasformazione del lievitoSigma-AldrichYEAST1-1KTIncluso vettore di DNA (testicoli di salmone)
Zymoprep lievito plasmide plasmide miniprep IZymo researchD2001Estrazione plasmidico da lievito
NomeAziendaNumero di catalogoComments
7. Piastre
piastre a 96 pozzettiGreiner Bio-One655101Polistirene trasparente, non sterile, (per misure di attività)
Piastre a 96 pozzettiGreiner Bio-One655161Polistirene trasparente, sterile, (per microfermentazioni)
Coperchio per piastre a 96 pozzettiGreiner Bio-One656171Polistirene trasparente, sterile, (per microfermentazioni)
New <

Riferimenti

  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
  4. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  5. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
  6. Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012(2012).
  7. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
  8. Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
  9. Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
  10. Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
  11. Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16(2009).
  13. Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
  14. Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).
  15. Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
  16. Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919(2014).
  17. Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
  18. Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
  19. Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
  20. Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
  21. Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  22. Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.
  23. Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).

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