Diretto Evolution Metodo Saccharomyces cerevisiae: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Summary

Presentiamo un protocollo dettagliato per costruire e selezionare librerie mutanti per campagne di evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae offre molti vantaggi interessanti nella progettazione di enzimi per applicazioni biotecnologiche, un processo che prevede la realizzazione, la clonazione e l'espressione di biblioteche mutante, accoppiato ad alta frequenza omologa ricombinazione del DNA in vivo. Qui, vi presentiamo un protocollo per creare e biblioteche schermo mutanti di lievito in base l'esempio di un fungina aril-alcol ossidasi (AAO) per migliorare la sua attività totale. Due segmenti proteici sono stati sottoposti ad evoluzione focalizzata diretto mediante mutagenesi casuale e in vivo ricombinazione DNA. Le sporgenze di ~ 50 bp fiancheggianti ogni segmento ammessi corretto rimontaggio del gene AAO-fusione in un vettore linearizzato dando luogo ad una completa plasmide autonomamente replicare. Librerie Mutant arricchiti con varianti funzionali AAO sono stati proiettati in S. surnatanti cerevisiae con un saggio ad alta sensibilità basato sulla reazione di Fenton. Il processo generale dicostruzione della libreria a S. cerevisiae qui descritto può essere facilmente applicato ad evolversi molti altri geni eucarioti, evitando reazioni PCR in più, in vitro di ricombinazione del DNA e legatura passi.

Introduction

Evoluzione molecolare diretto è un metodo affidabile, veloce e affidabile per progettare enzimi ^{1, 2.,} Attraverso cicli iterativi di casuali mutazioni, ricombinazione e lo screening, le versioni migliorate di enzimi possono essere generati che agiscono sui nuovi substrati, nelle reazioni romanzo, a non naturale ambienti, o anche per assistere alla cella di raggiungere nuovi obiettivi metabolici ^3-5. Tra i padroni di casa utilizzate in evoluzione diretta, di birra lievito Saccharomyces cerevisiae offre un repertorio di soluzioni per l'espressione funzionale di proteine ​​eucariotiche complesse che non sono altrimenti disponibili in c....

Protocol

1. Mutant Biblioteca Edilizia

1. Visita le regioni da sottoporre a MORPHING con l'aiuto di algoritmi di calcolo basati sui modelli di struttura di cristallo o di omologia disponibili ^18.
   1. Qui, indirizzare due regioni di AAO da Pleurotus eryngii per mutagenesi casuale e ricombinazione (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mentre amplificando il resto del gene (844 bp) di alta fedeltà PCR (Figura 1).
      Nota: Diversi segmenti possono essere studiati morphing in modo indipendente o combinata ^16.
2. Amplificare le zone interessate dal mutageno PCR. Creare zone tra i seg....

Results

AAO da P. eryngii è un flavooxidase extracellulare che fornisce perossidasi fungine con H ₂ O ₂ per iniziare attaccare lignina. Due segmenti di AAO stati sottoposti a evoluzione focalizzata-diretto da MORPHING al fine di migliorare la sua attività e la sua espressione in S. cerevisiae ^19. Indipendentemente dalle enzimi stranieri nutriti da S. cerevisiae, la questione più critica quando la costruzione di librerie di mutanti nel l.......

Discussion

In questo articolo, abbiamo riassunto la maggior parte dei suggerimenti e trucchi impiegati nel nostro laboratorio per progettare enzimi dalla evoluzione diretta a S. cerevisiae (utilizzando AAO come esempio) in modo che possano essere adattati per l'uso con molti altri sistemi enzimatici eucariotica semplicemente seguendo l'approccio comune descritti qui.

In termini di creazione di biblioteca, Morphing è un metodo rapido one-pot di introdurre e ricombinare le mutazioni casu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Terreni di coltura
Ampicillina sale sodico	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramfenicolo	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galattosio	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinosio pentaidrato	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Estratto di lievito	Difco	212750
Lievito base azotata senza aminoacidi	Difco	291940
Lievito sintetico drop-out Medium Integratori senza uracile	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
2. Reazioni PCR
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM ciascuno
iProof High-Fidelity DNA polimerasi	Bio-rad	172-5301
Cloruro di manganese(II) tetraidrato	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA polimerasi	Sigma-Aldrich	D4545	Per errore prono PCR
Name	Company	Numero di catalogo	>Comments
3. Linearizzazione plasmidica
BamHI enzima di restrizione	New England Biolabs	R0136S
Albumina sierica bovina	New England Biolabs	B9001S
Enzima di restrizione XhoI	New England Biolabs	R0146S
Enzima di restrizione Non I	England Biolabs	R0189S
Gel Rosso	Biotium	41003	Per la colorazione del DNA
strong>Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
4. Saggi FOX
Solfato di ferro (II) ammonio esaidrato	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Alcool Anysil	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitolo	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Perossido di idrogeno 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX curva standard
Xilenolo Arancio sale disodico	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
5. Agarosio gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	Colorante per l'analisi del DNA
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Agarosio a bassa temperatura di fusione	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
6. Kit e cellule
S. cerevisiae ceppo BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Ceppo carente di proteasi con genotipo: MAT&alfa; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue cellule competenti	Agilent genomics	200150	Per la purificazione e l'amplificazione dei plasmidi
NucleoSpin Gel e PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	Estrazione del gel di DNA
Kit plasmidico NucleoSpin	Macherey-Nagel	740,588,250	Kit miniprep a colonna
Kit di trasformazione del lievito	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Incluso vettore di DNA (testicoli di salmone)
Zymoprep lievito plasmide plasmide miniprep I	Zymo research	D2001	Estrazione plasmidico da lievito
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
7. Piastre
piastre a 96 pozzetti	Greiner Bio-One	655101	Polistirene trasparente, non sterile, (per misure di attività)
Piastre a 96 pozzetti	Greiner Bio-One	655161	Polistirene trasparente, sterile, (per microfermentazioni)
Coperchio per piastre a 96 pozzetti	Greiner Bio-One	656171	Polistirene trasparente, sterile, (per microfermentazioni)