Questo protocollo descrive una tecnica di isolamento per ottenere cellule mesenchimali stromali residenti polmonare primaria da ratti, attraverso l'uso di digestione enzimatica, la separazione gradiente di densità, aderenza plastica e CD146 + selezione perlina magnetica.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Mesenchimali cellule stromali (MSC) sono sempre più riconosciuti per il loro potenziale terapeutico in una vasta gamma di malattie, comprese le malattie polmonari. Oltre l'uso di midollo osseo e cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale per la terapia cellulare esogena, vi è anche un crescente interesse per la riparazione e la potenziale rigenerativo delle cellule staminali mesenchimali del tessuto residenti. Inoltre, essi hanno probabilmente un ruolo nello sviluppo normale dell'organo, e sono stati attribuiti ruoli nella malattia, in particolare quelli di natura fibrotica. L'ostacolo principale per lo studio di queste MSC tissutali residenti è la mancanza di un chiaro indicatore per l'isolamento e l'identificazione di queste cellule. La tecnica di isolamento qui descritta si applica molteplici caratteristiche di MSC residenti del polmone (L-MSC). Al sacrificio dei ratti, polmoni vengono rimossi e risciacquati più volte per rimuovere il sangue. Dopo la dissociazione meccanica bisturi, i polmoni sono digeriti per 2-3 ore utilizzando un mix di tipo collagenasi I, proteasi neutra e il tipo di DNasi I. Il richiederlod singola sospensione cellulare viene successivamente lavato e stratificato su gradiente di densità media (densità 1,073 g / ml). Dopo centrifugazione, le cellule dal interfase vengono lavati e piastrate in fiasche di coltura trattato. Le cellule sono coltivate per 4-7 giorni in fisiologico 5% O 2, 5% di CO 2 condizioni. Per esaurire fibroblasti (CD146 -) e di garantire una popolazione di soli L-MSC (CD146 +), selezione positiva per le cellule CD146 + avviene attraverso la selezione perla magnetica. In sintesi, questa procedura produce affidabile una popolazione di primaria L-MSC per ulteriori studi e la manipolazione in vitro. A causa della natura del protocollo, può facilmente essere tradotto ad altri modelli animali sperimentali.
Introduzione
Mesenchimali cellule stromali (MSC) sono sempre più riconosciuti per il loro potenziale terapeutico in una vasta gamma di malattie, comprese le malattie polmonari. Oltre l'uso di midollo osseo e cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale per la terapia cellulare esogena, vi è anche un crescente interesse per la riparazione e la potenziale rigenerativo delle cellule staminali mesenchimali del tessuto residenti. Durante lo sviluppo, anche nel polmone, mesenchima è una fonte importante di spunti di sviluppo, e MSC residenti sono un probabile candidato per essere al centro di questo. Inoltre, la prova sta emergendo che le MSC residenti siano disturbati in ....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Animal Care dell'Università di Ottawa (animale protocollo etica í-1696). Cura degli animali è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali.
1. Isolamento di cellule polmonari mesenchimali stromali
- Preparare la miscela di enzimi in un tubo da 50 ml: pesare 30 U proteasi neutra, 2.500 U Collagenasi I e 500 U DNAsi I. Tali importi sono sufficienti per i polmoni di un topo adulto o dei ratti. Preparare il giorno di isolamento e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
- cuccioli di ratto a Sacrifice giorno 13 di un'iniezione intraperitoneale di....
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Risultati
Due delle caratteristiche fisiche più affidabili di MSC, densità e aderenza plastica, sono utilizzati nella prima parte di questo protocollo per ottenere la frazione di cellule mesenchimali del polmone che contiene L-MSC. Sebbene l'interfase gradiente di densità comprenderà monociti e macrofagi, oltre alle cellule mesenchimali del polmone, l'aderenza plastica seguita da 3-5 giorni di coltura garantisce che solo le cellule mesenchimali del polmone rimangono. In effetti questa popo.......
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Discussione
L'isolamento e la coltura di primaria L-MSC offre l'opportunità di comprendere meglio la loro funzione e la loro interazione con le altre popolazioni cellulari a livello cellulare, e il loro ruolo nello sviluppo del polmone, della salute e della malattia. Ciò è particolarmente importante in quanto la mancanza di uno specifico singolo marcatore di queste cellule rende quasi impossibile studiare queste cellule in situ. Come per tutte le popolazioni cellulari primarie, si dovrebbe tenere a mente che queste.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
JJPC è supportato da una borsa di studio post-dottorato del Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Il MAM riceve una borsa di studio per merito dalla Fondazione Accademica Nazionale Tedesca - Studienstiftung des Deutschen Volkes ed è sostenuto da una borsa di studio dell'EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). La BT è supportata dal CIHR, dalla Canadian Lung Association, dalla Stem Cell Network e dal Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Proteasi neutra | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Preparare il giorno dell'isolamento e conservare a 4 gradi C fino all'uso |
| di Collagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Preparare il giorno dell'isolamento e conservare a 4 ° deg; C fino all'uso |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Preparare il giorno dell'isolamento e conservare a 4 gradi C fino all'uso |
| Pentobarbital sodico (Eutanil) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublino, | Irlanda-Utilizzare | 0,2 ml per cuccioli di ratto tra 20-30 g; gli animali più grandi potrebbero aver bisogno di più. |
| Dulbecco' s PBS + Sodio-piruvato + Glucosio | Life Technologies | 14287-072 | Molto importante per l'uso di questo tipo di D-PBS, poiché il calcio e il magnesio presenti in questo D-PBS facilitano la digestione enzimatica |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Mezzi a gradiente di densità. Per ottenere una buona interfase, è fondamentale che la stratificazione della sospensione a singola cellula avvenga ad una >45°; angolo a velocità molto bassa, e che la successiva centrifugazione sia effettuata a 19 °C. |
| &alfa; MEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| 200 mM L-Glutammina | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x Antibiotico-Antimicotico | Life Technologies | 15240-062 | Penicillina/Streptomicina/Fungizone |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Perle magnetiche |
| coniglio policlonale biotinilato anti-topo IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Anticorpo secondario biotinilato che corrisponde all'anticorpo CD146 anti-ratto descritto di seguito |
| DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | Magnet che è raccomandato per l'uso con Dynabeads. NOTA: il magnete deve essere scelto in base al produttore s istruzioni delle perline magnetiche di scelta. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Alternativa delicata senza tripsina, utilizzare 1 ml di TrypLE express/25 cm2 superficie. Dopo il distacco, 10 ml di terreno di coltura L-MSC sono sufficienti per inattivare 3 ml di |
| anticorpo TrypLE anti-ratto CD146 | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12,5 μ l per 0,5 x 106 cellule |
| Pentaspan (soluzione di pentaamido) | Bristol-Myers Squibb | Canada-Può | essere ottenuto attraverso i servizi locali di donazione del sangue o i dipartimenti di ematologia. In alternativa, si potrebbe utilizzare la soluzione di pentastarch PSI 20% (Preservation Solutions, PST001) diluita 1:1 con NaCl allo 0,9%. |
| Contenitore di congelamento Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Migliora la vitalità durante il congelamento di L-MSC durante la notte a -80 ° E |
Riferimenti
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5....
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Ristampe e permessi
