Estrazione metriche per sistemi di radici tridimensionali: volume e superficie di analisi da In-terreno a raggi X Tomografia Computerizzata dati

Summary

Una metodologia per l'ottenimento di informazioni visive e quantitative struttura radice da computerizzata a raggi X dei dati acquisiti tomografia a-terreno è presentato.

Abstract

Le radici delle piante hanno un ruolo fondamentale nelle interazioni pianta-suolo-microbo che si verificano nella rizosfera, così come i processi con importanti implicazioni per il cambiamento climatico e la gestione delle colture. Le informazioni quantitative formato sulle radici nel loro ambiente nativo è prezioso per studiare la crescita delle radici e processi ambientali che coinvolgono le piante. X-ray tomografia computerizzata (XCT) ha dimostrato di essere uno strumento efficace per la scansione in situ della radice e l'analisi. Abbiamo puntato a sviluppare uno strumento costless ed efficiente che approssima la superficie e il volume della radice indipendentemente dalla forma dai dati tridimensionali (3D) tomografia. La struttura principale di un Dropseed Prairie (heterolepis Sporobolus) esemplare è stato ripreso con XCT. La radice è stata ricostruita, e la struttura della radice primaria è stato estratto dai dati utilizzando una combinazione di software concesso in licenza e open-source. Una maglia poligonale isosuperficie è stato poi creato per facilità di analisi. Abbiamo sviluppato tegli applicazione indipendente imeshJ, generato in MATLAB ^1, per calcolare il volume di root e la superficie dalla mesh. Le uscite di imeshJ sono superficie (in mm ²⁾ e il volume (in mm ^3). Il processo, utilizzando una combinazione di strumenti da imaging per analisi quantitativa radice, è descritto. Una combinazione di XCT e software open-source ha dimostrato di essere una potente combinazione per non invasivo campioni di radici di piante di immagini, dati radice del segmento, ed estrarre informazioni quantitative dai dati 3D. Questa metodologia di elaborazione di dati 3D dovrebbe essere applicabile ad altri sistemi materiale / campione in cui vi è la connettività tra i componenti di simile attenuazione dei raggi X e le difficoltà sorgono con la segmentazione.

Introduction

Roots, come parte della rizosfera ^2-5, rappresentano una parte "invisibile" della biologia vegetale in quanto terreno rende difficile alle radici di immagini non invasivo ^{6, 7.} Tuttavia, studiando la crescita delle radici e l'interazione all'interno dell'ambiente del suolo è fondamentale per la comprensione root / crescita delle piante e il ciclo dei nutrienti, che a loro volta influenzano la forestazione, la sicurezza alimentare, e del clima. X-ray tomografia computerizzata (XCT) ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per l'imaging non invasivo di campioni radice vegetale nei loro ambienti locali ^8. Al fine di misurare lo sviluppo delle radici e variazioni dimensionali in condizioni diverse, ed essere in grado di confrontare i dati provenienti da diversi set di dati / campioni, si ha la necessità di estrarre informazioni quantitative dai dati tomografia. Segmentazione dei dati radice da quello del terreno circostante, cioè l'isolamento dell'immagine radice da tutto il resto intorno (tra cui, ad esempio, un impianto adiacente) è un passaggio critico prima accuanalisi della dimensione delle rate può essere fatto. Tuttavia, un approccio semplice soglia è spesso impossibile per i dati di radice. Le sfide connesse con le radici delle piante di imaging nel suolo includono variazioni nelle proprietà di attenuazione dei raggi X del materiale radice, e la sovrapposizione di valori di attenuazione tra la radice e suolo causati da acqua e materia organica. Questi problemi sono stati affrontati superbamente recentemente da Mairhofer et al. nella loro strumento di monitoraggio visivo RooTrak ^{7, 9.} Il passo successivo dopo una segmentazione di successo è la determinazione accurata del volume di root e di superficie. Il volume può essere stimata contando il numero di voxel e moltiplicando per dimensione al cubo voxel 'come mostrato prima del ^7. Per una determinazione più accurata della superficie della radice e volume, la isosurface del sistema radicale segmentato può essere rappresentato da una maglia di triangoli, utilizzando un algoritmo noto come Marching Cubes ^10. La open-source ImageJ ¹¹ può essere utilizzato per approssimare °volume di root e in base all'algoritmo Marching Cubes. Per quanto a nostra conoscenza, solo un numero limitato di software open-source dedicato al calcolo dei dati del volume / superficie tomografia-based per i campioni di root nel campo di centimetri e, soprattutto, è attualmente disponibile ^12. Un software open-source abbiamo guardato ¹³ si concentra sulla crescita delle radici e si rivolge a funzioni cellulari che permettono l'analisi quantitativa volume a risoluzione di una singola cellula. Alcuni software open-source dedicato a sistemi di radici intere ¹⁴ è eccellente per i sistemi di root tubolari di piccolo diametro in base al ravvicinamento che la loro forma è in realtà tubolare. Tuttavia, alcuni lavori con immagini 2D e non sono in grado di gestire in 3D stack ^14. Inoltre, la forma tubolare approssimazione può non essere valido quando apparati radicali con superfici ruvide e forme non uniformi, come quelle di alberi, sono studiati. Un altro approccio ¹⁵ utilizza due-dimensionali (2D) sequenze di immagini di rotazione innovativo eludere °e la necessità di uno scanner CT costosa. Misura, record, e visualizza radice lunghezze di sistema. Il software che abbiamo testato tra quelli disponibili in commercio solo ^16-18; uno non sembra essere in grado di gestire immagini 3D pile ^16, il secondo è un utensile superficie fogliare e misurazione della lunghezza della radice ^17, mentre la terza è basata sull'analisi colore ^18. Sulla base di questa indagine, vi suggeriamo di un'opzione a costo zero che approssima la superficie e il volume della radice indipendentemente dalla sua forma a partire dai dati tomografia 3D è desiderabile.

Basandosi sul RooTrak liberamente disponibile e ImageJ, abbiamo sviluppato un programma, chiamato imeshJ (vedi file di codice supplementare), che elabora una maglia isosuperficie (file stereolitografia superficie) generato dai dati radice segmentati, e calcola il volume e la superficie della radice da facendo semplici calcoli geometrici sui dati di maglia indice triangolo. Qui riportiamo un metodo che combina l'uso dell'imaging XCT,ricostruzione e visualizzazione dei dati (software TC Pro 3D e VG Studio), la segmentazione della radice del campione dal terreno nei dati 3D (software open-source ImageJ e RooTrak), e l'estrazione dei dati di superficie e il volume da una maglia triangolare (ImageJ e il codice imeshJ computer).

Protocol

Attenzione: L'operazione di uno scanner a raggi X tomografia richiede sia la formazione di radiazione in generale, e la formazione sulla sicurezza radiazioni specifico dello strumento. Tutte le procedure corrispondenti relativi al laboratorio del sperimentatore devono essere seguite.

1. Root Imaging

Nota: Questo passaggio descrive l'imaging del un'erba esemplare detenute nel suo terreno originale in un vaso di plastica tubolare (un tubo di plastica con un diametro di 40 mm, altezza 210 mm, e spessore di circa 2 mm).

1. Pianta posto in vaso sul manipolatore campione dello strumento ad una distanza desiderata per l'ingrandimento di destinazione. Per un impianto in un supporto del diametro di 2 pollici, il campione distanza di sorgente deve essere di circa 3 pollici (7 cm).
2. Regolare le impostazioni di scansione a raggi X per ottenere il colore ottimale (livello di grigio) contrasto dell'immagine rilevatore in. Nota: Queste impostazioni sono disponibili nel software di controllo dello strumento utilizzato.
   1. Impostare le impostazioni di potenza a raggi X; 85 kV e 190 μA sono stati utilizzati in questo esamepio.
   2. Impostare il tempo di esposizione. Qui, un tempo relativamente lunga esposizione di 1 sec è stato usato per un migliore rapporto segnale-rumore.
   3. Impostare il numero di proiezioni e fotogrammi al di proiezione; 4 fotogrammi al di proiezione per un totale di 3.142 proiezioni è consigliato per buone statistiche di dati.
   4. Eseguire una correzione ombreggiatura utilizzando le condizioni di misurazione stabiliti sopra selezionando la scheda "Correzione di shading", e facendo clic su "Crea".
      Nota: La correzione ombreggiatura compensa la variazione nella risposta di pixel del dispositivo di imaging quando viene illuminato con una serie costante di flusso di raggi X. Il processo richiede immagini in bianco (con il campione rimosso dal percorso ottico) con il fascio di raggi X acceso, e con il fascio spento. Questa correzione viene applicata a tutte le immagini raccolte.
   5. Selezionare l'opzione "Minimizza artefatti ad anello" (chiamato anche "modalità spola"); il campione viene ruotato in passi angolari, mentre le immagini di proiezione vengono acquisite. Questo porta a datuna acquisizione a un ritmo più lento, ma aiuta ad eliminare artefatti ad anello.
   6. Avviare la scansione facendo clic sul pulsante "Acquisisci" nella scheda di acquisizione (con le impostazioni di cui sopra, raccolta di immagini richiede circa 4 ore).

2. I dati Ricostruzione

Nota: Questa sezione descrive la ricostruzione dei dati del volume 3D da immagini crude (radiografie dalla TAC).

1. Caricare i dati grezzi in programma.
2. Confronto prima e l'ultima immagine (che dovrebbero essere quasi identici come l'ultima immagine è presa dopo una rotazione di 360 ^o del campione) per assicurarsi che il campione non si mosse o le impostazioni di scansione non è cambiato durante l'acquisizione dei dati.
3. Calcolare il centro di rotazione (COR) selezionando la scheda "Centro di rotazione", e facendo clic su "Start"; utilizzare le opzioni "Automatico" COR trovando con "Alta Qualità" accuratezza, e "Dual" (superiore e inferiore) fetta di selezione per il calcolo COR.
4. Selezionare il volume del campione da ricostruire: selezionare la scheda "Volume", e modificare le finestre di selezione volume, con le miniature.
5. Eseguire la ricostruzione per creare il file di volume contenente dati 3D facendo clic su "Start".

3. Elaborazione dati / Segmentazione

Nota: Questa sezione descrive i passi da compiere per preparare i dati ricostruiti per l'ulteriore elaborazione nel RooTrak programma per rintracciare le radici come si diramano attraverso il suolo, e isolare le radici da qualsiasi materiale circostante per produrre una pila di immagini binarie di solo il radice stessa.

1. Il trattamento dei dati del volume in ImageJ per preparare una serie di immagini lavorabile RooTrak:
   1. Caricare il file di volume in ImageJ.
   2. Ottimizzare il contrasto delle immagini tra radice e suolo regolando le impostazioni di luminosità e contrasto (Clicca l'immagine / Regola / Luminosità / Contrasto). Quando la regione di interesse all'interno dell'immagine è visibile e clearly distinguibili, le impostazioni sono considerati ottimizzate.
   3. Salva come una serie di immagini in formato JPEG, BMP o PNG.
2. Elaborazione in RooTrak di segmentare la radice:
   1. Carica immagine Pila in RooTrak (vai alla scheda "Strumenti", e premere "Tracker").
   2. Impostare i punti di seme dentro radice: clicca diversi punti all'interno di ciascuna delle sezioni di radice pertinenti visibili nella vista dall'alto fetta dei dati del volume.
   3. Impostare i parametri tracker "scorrevolezza" e "somiglianza" per, rispettivamente, 0,3 e 0,8,.
   4. Eseguire la funzione di tracciamento. Questo seguirà la radice della porzione di immagine superiore fino alla porzione inferiore.
   5. Dopo aver visto i dati del volume, selezionare il numero di fette in base al volume di dati utilizzabile; in questo caso, il monitoraggio è stato fermato al 200 fette, equivalente ad una profondità di 6,2 mm, in cui i confini radice divennero mal definiti (l'immagine della radice cingolato iniziato a fondersi in quello del suolo).
      Nota: laimmagine Pila prodotta verrà salvata automaticamente, ovunque è stato creato la directory di output.

4. Volume e analisi di superficie

Nota: Questo passaggio descrive la generazione di mesh isosuperficie dalla serie di immagini creato da RooTrak.

1. Convertire immagine Pila da RooTrak in un formato di immagine binaria in ImageJ. Selezionare "Processo", poi "binario", poi "Make Binary".
2. Utilizzare il plugin ImageJ open-source, BoneJ, per creare la mesh triangolare; in ImageJ selezionare "Plugins", poi "BoneJ", poi "isosuperficie".
3. Impostare "ricampionamento" e "Threshold" per, rispettivamente, 6 e 120, (impostazioni di default). Controllare "Mostra di superficie", e premere il tasto "OK".
4. Sul "visualizzatore 3D" fare clic sulla scheda File, poi su "superfici di esportazione", quindi salvare come "STL (binary)".
5. Aperto imeshJ, selezionare il file STL e inserire le dimensioni voxel in micron. Fai clic su "Calculate Superficie "di acquisire superficie totale della radice del campione in mm ^2. Allo stesso modo, fare clic su" Calcola Volume "per ottenere volume totale di root del campione in mm ^3.

Results

Il campione costituito da due steli dell'erba nativa Prairie Dropseed (Sporobolus heterolepis) e il terreno originale attorno è stato preso da una zona residenziale e collocato in un piccolo supporto a forma di tubo visibile in figura 1. La dimensione dei dati voxel ricostruiti era circa 31 um x 31 um x 31 um. Il file di volume ricostruito è stato utilizzato per creare una pila di immagini da un orientamento selezionato (vista dall'alto) utilizzando l'open-sourc...

Discussion

Una combinazione di raggi X tomografia computerizzata e diversi programmi open-source ha dimostrato di essere una potente combinazione per non invasivo campioni di radici di piante di immagini, dati radice del segmento, ed estrarre informazioni quantitative (area di superficie e volume) dai dati 3D. La nostra capacità di visualizzare e misurare caratteristiche è sempre limitata dalla risoluzione di scansione, nonché da limitazioni del software RooTrak. Tuttavia, la risoluzione di scansione è stato sufficiente a catturar...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Tek/Metris XTH 320/225 kV	Nikon Metrology		Scanner per tomografia a raggi X
Inspect X	Nikon Metrology		Software di controllo dello strumento
CT Pro 3D	Nikon Metrology		Software di ricostruzione, versione XT 2.2
VG Studio MAX	Visual Graphics GmbH		Software di visualizzazione per volumi 3D, versione 2.1.5
ImageJ	Open-source		Software di elaborazione e analisi delle immagini, versione 1.6
RooTrak	Software di		, versione 0.3.1-b1 beta
imeshJ	EMSL		MATLAB script sviluppato dagli autori
		erba dropseed Prairie	Campione ottenuto da terreno in zona residenziale