Articolo metodologico

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato

DOI:

10.3791/53796

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18 maggio 2016

 ,  ,  , 
1Unité de Biologie et Génétique du Paludisme, Institut Pasteur, 2Unité dImmunobiologie des Cellules Dendritiques, Institut Pasteur

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo qui un protocollo per isolare le cellule mieloidi dalla pelle di topo e drenare i linfonodi dopo l'iniezione intradermica di sporozoiti di Plasmodium. La citometria a flusso delle cellule raccolte fornisce un test affidabile per caratterizzare la risposta infiammatoria della pelle e drenante dei linfonodi al parassita.

Abstract

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Malaria inizia quando la fase sporozoite di Plasmodium è inoculata in pelle di un mammifero ospite attraverso una puntura di zanzara. Il parassita altamente mobili non raggiunge solo il fegato per invadere epatociti e la trasformazione in forma eritrociti-infettiva. Si migra anche nella pelle e per il linfonodo drenante prossimale sito di iniezione, dove può essere riconosciuto e degradato da residenti e / o di cellule mieloidi reclutate. L'imaging intravitale ha riferito l'assunzione precoce di fluorescenza brillante Lys-GFP leucociti positivi nella pelle e le interazioni tra sporozoiti e CD11c + cellule del linfonodo drenante. Presentiamo qui una procedura efficiente per recuperare, identificare e contare i sottoinsiemi di cellule mieloidi che vengono reclutati per la pelle del mouse e drenanti linfonodi dopo l'iniezione intradermica di immunizzare dosi di sporozoites in un modello murino. La caratterizzazione fenotipica usando flusso multi-parametrica fornisce citometriaun test affidabile per valutare i primi cambiamenti cellulari dinamiche durante la risposta infiammatoria alle infezioni Plasmodium.

Introduzione

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La malaria è una delle più letali malattie infettive in tutto il mondo, uccidendo più di mezzo milione di persone all'anno. Infezione da Plasmodium, l'agente causale della malattia, inizia una fase di pre-eritrocitaria (PE). Durante questa fase, sporozoiti iniettati nella pelle ospitante da una femmina anopheline zanzara raggiungono il fegato attraverso il flusso sanguigno e si differenziano epatociti all'interno nelle forme parassiti che infettano i globuli rossi e causano i sintomi della malattia.

Le fasi PE di Plasmodium rappresentano un bersaglio privilegiato per la vaccinazione anti-malaria. In effetti, i vaccini vivi attenuati contro queste fasi, come la radiazione di attenuazione sporozoiti (RAS), parassiti geneticamente arrestati (GAP) o chemioprofilassi e sporozoiti (CPS) hanno dimostrato la loro capacità di proteggere sia roditori e ospiti umani 1-9. Nel modello di roditore, la maggior parte degli studi di vaccinazione sono condotti utilizzando l'immunizzazione per via endovenosa, Che è lo standard in termini di efficacia protettiva. Tuttavia, la descrizione di una fase pelle e l'importanza del linfonodo pelle associata drenante (DLN) nell'elicitazione protezione ha cambiato la nostra percezione della fase PE e sottolineato l'importanza della somministrazione intradermica di iniezione. L'imaging intravitale di P. sporozoiti berghei iniettati nella pelle dei roditori ha dimostrato che solo ~ 25% dell'inoculo raggiunge il fegato attraverso il flusso sanguigno. Il restante 75% ~ distribuisce tra prossimale DLN (~ 15%) e la pelle (~ 50%) 10,11, dove una piccola percentuale può trasformare e rimanere in vita per settimane all'interno delle cellule della pelle 12,13. Inoltre, studi successivi descrivono che l'istituzione di un'efficace immunità protettiva dopo la vaccinazione intradermica avviene principalmente nella pelle-DLN, in cui si attivano specifiche cellule parassita T CD8 +, e solo marginalmente nella milza o del fegato-dLNs 14,15.

Mentrela maggior parte degli studi si sono concentrati sulla caratterizzazione delle cellule effettrici implicati nella creazione di risposta immunitaria protettiva, e tanto meno si sa circa il destino dei parassiti vivi attenuati iniettati nella pelle, in particolare le loro interazioni con il sistema immunitario innato. In particolare, la caratterizzazione di cellule presentanti l'antigene coinvolti nella parassita antigene captazione, l'elaborazione e la presentazione di cellule T CD8 + è di importanza critica, sapendo che l'acquisizione di antigene PE può avvenire sia nella pelle e scomparti DLN. Precedenti studi di imaging intravitale descritto un afflusso iniziale di cellule positive fluorescenza brillante Lys-GFP nella pelle in seguito ad un morso di zanzara infettiva 16 mentre i primi interazioni tra sporozoiti e cellule dendritiche sono stati osservati nel DLN 10,17. Più recentemente, è stato riportato che sporozoiti inoculati nella pelle dalle zanzare aumenta la motilità sia delle cellule T dendritiche e regolamentari nella pelletopi, mentre è stata osservata una serie diminuzione di cellule presentanti l'antigene nel DLN 18.

Si è voluto identificare e quantificare più precisamente i sottoinsiemi di leucociti reclutati nella pelle e corrispondenti DLN nonché coloro che interagiscono con il parassita dopo iniezione intradermica di immunizzare dosi di RAS 19. In questo contesto, abbiamo isolato le cellule mieloidi (CD45 + CD11b +) da entrambi i tessuti e caratterizzato sottopopolazioni di interesse da parte di più = flusso parametrico citometria. Coerentemente con la risposta immunitaria descritto nella fase iniziale della Leishmania importante infezione della pelle 20, la risposta dell'ospite principale per sporozoite iniezione è costituito da una assunzione successiva di neutrofili polimorfonucleati (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguita da monociti infiammatorie (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) che sono identificate in base ad DifferentiAl espressione dei marcatori di superficie Ly6G e Ly6C.

Descriviamo qui un protocollo per isolare cellule mieloidi dalla pelle del mouse e DLN dopo l'iniezione intradermica di immunizzare dosi di RAS estratti da infetti ghiandole salivari delle zanzare. iniezioni intradermiche riproducibili e lavorazione dei tessuti sono passi fondamentali per quantificare i cambiamenti fenotipici di infiltrazione popolazione di cellule all'interno dei tessuti infetti. L'approccio seguito dettagliato fornisce un test affidabile per valutare la pelle e la risposta infiammatoria DLN al Plasmodium parassita e può essere esteso a vari sistemi sperimentali.

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Protocollo

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Tutte le procedure sono state approvate dal comitato dell'Istituto Pasteur e dal Comitato Etico locale sulla sperimentazione animale (comitato etico IDF-Paris 1, Paris, France; numero di contratto: 2.012-0.015) ed eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti applicabili.

1. Materiali e reagenti

  1. Utilizzare femmina Anopheles zanzare stephensi (ceppo Sda500) che si nutrono di topi infetti 3-5 giorni dopo la nascita e posteriore come descritto in precedenza 21.
  2. Utilizzare i parassiti Plasmodium berghei ANKA clone che esprime il gene Green Fluorescent Protein (GFP) sotto il controllo del costitutiva Heat Shock Protein 70 (HSP70) promotore. Questo produce fluorescenza durante tutto il ciclo di vita del parassita 22.
  3. topi C57BL / 6JRj uso femminile (7 settimane di età).
    Nota: Tutti i reagenti utilizzati nel protocollo descritto sono elencati nella T in grado di Materiali / attrezzature.
_title "> 2. Radiation-attenuato sporozoite isolamento dalla zanzara ghiandole salivari

  1. Tra 18-25 giorni dopo il pasto di sangue infetto, raccogliere e freddo anestetizzare le zanzare in una provetta da 15 ml su ghiaccio come descritto in precedenza 21. trasferirli attenzione su un piatto Petri invertendo la provetta. Mantenere gli insetti su ghiaccio ed esporre le zanzare ad una dose 12 krad di γ- o x-irradiazione.
  2. Isolare sporozoiti attenuati da irradiati ghiandole salivari delle zanzare come descritto in precedenza 21. Raccogliere ghiandole salivari infetti in un piccolo volume (circa 15 ml) di tampone fosfato salina di 1x Dulbecco (DPBS) su ghiaccio e delicatamente schiacciare loro di rilasciare sporozoiti.
    NOTA: L'iniezione di una sospensione parassita altamente concentrata in un piccolo volume essere critico, è quindi essenziale per raccogliere un numero sufficiente di ghiandole salivari da un elevato numero di preselezionati zanzare ben infette, come dimostra il loro robusta espressioneverde-fluorescenza.
  3. Filtrare la sospensione sporozoite attraverso un tappo colino cella 35 micron atto ad un'adesione 1,5 tubo partire ml microcentrifuga per eliminare grumi e detriti zanzara.
  4. Contare il numero totale di sporozoiti isolate come precedentemente descritto 21 e regolare la concentrazione della sospensione parassita freddo 1x DPBS avere 83.000 sporozoiti / microlitro. Conservare i parassiti sul ghiaccio, pur continuando i prossimi passi.
  5. Raccogliere il numero equivalente di ghiandole salivari di zanzare infette che verranno utilizzati come controllo negativo e processano il campione come descritto nei punti 2.2 e 2.3. Diluire il campione come indicato sopra per ottenere analoga concentrazione di estratti ghiandole salivari nella sospensione.
    NOTA: sporozoiti possono essere memorizzati su ghiaccio per un massimo di 2 ore. Tuttavia, idealmente vengono iniettati nel giro di un'ora dopo la pigiatura delle ghiandole salivari.

3. L'iniezione di sporozoiti nella Dermal Layer del Ear

  1. Anestetizzare animali mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (50 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) della miscela. Attendere 5-8 minuti per il mouse di essere in uno stato di incoscienza e applicare pomata oftalmica per gli occhi per evitare l'essiccazione della cornea. Valutare la profondità di anestesia eseguendo un pizzico punta dolce su entrambi i piedi posteriori.
    NOTA: La dose di anestesia dura meno di 20 minuti, in modo che i prossimi passi deve essere fatto in fretta.
  2. Stabilizzare il padiglione auricolare del mouse fissando il lato ventrale con nastro adesivo trasparente precedentemente posto sotto uno stereomicroscopio (Figura 1A). Premere delicatamente l'orecchio per evitare danni del sistema vascolare.
  3. Caricare un / 35 gauge smussato 10 microlitri siringa con 0,6 ml di parassiti risospese 10.
  4. Consegnare la sospensione sporozoite in 4 siti di iniezione (0,15 ml per sito) inserendo con cautela l'ago sul lato dorsale dell'orecchio (Figura 1A), sotto l'epidermide, conlo smusso up, avendo cura di evitare i vasi sanguigni. Lasciare l'ago di rimanere nel derma per pochi secondi per impedire il riflusso del injectant prima di rimuoverla. Osservare una papula caratteristico ciascun sito di iniezione al termine della procedura (Figura 1B e 1C).
  5. Dopo l'iniezione, rimuovere con attenzione l'orecchio dal nastro.
  6. Iniettare dell'orecchio controlaterale con la stessa dose di parassiti seguendo la procedura 3,2-3,4.
  7. Iniettare 2 topi supplementare sia con 0,6 ml di 1x DPBS o 0,6 ml di 1x DPBS + estratto di ghiandola salivare dalle zanzare infettate per valutare la risposta infiammatoria mediata dalla sola iniezione e la deposizione di materiale zanzare nel derma.
  8. Monitorare il recupero del mouse dall'anestesia prima di metterlo nuovamente dentro la gabbia.
    NOTA: La deposizione sporozoite corretta nella pelle può essere monitorato mediante microscopia a fluorescenza (Figura 2A e 2B), Il mouse che viene preparato come descritto previsously 23.

4. Pelle e drenante dissezione linfonodale

  1. Preparare mezzo standard (SM) come segue: Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) supplementato con 400 U / ml di collagenasi e 50 ug / ml deossiribonucleasi (DNasi) .
  2. Preparare due 6 piastre di coltura dei tessuti ben a fondo piatto sul ghiaccio con 4,5 ml di SM + 70 micron cella filtro per bene per i campioni DLN (tavola A) e 4,5 ml di SM per bene per i campioni di pelle (piastra B).
  3. Al punto di tempo desiderato dopo l'inoculazione sporozoite, profondamente anestetizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (125 mg / kg) / xilazina (12,5 mg / kg) miscela prima dislocazione cervicale. Assicurarsi che il mouse dimostra segni di morte clinica e iniziare subito la dissezione.
    NOTA: La cinetica di reclutamento delle cellule mieloidi possono essere esaminate in tempi diversi dopo injessione (cioè 2 ore, 4 ore e 24 ore come descritto in precedenza 14).
  4. Disinfettare l'orecchio inoculato e la regione del collo corrispondente con il 70% di etanolo per ridurre la possibilità di contaminazione.
  5. Utilizzando forbici e pinze sterili, in modo asettico sezionare il prossimale auricolare DLN senza raccogliere il grasso circostante. Eseguire una prima incisione nel solco giugulo-carotidian e rimuovere i peli dal campo operatorio. Stretch l'incisione con 2 pinze per esporre il DLN che appare grigio rispetto al tessuto circostante.
  6. Pizzicare i tessuti connettivi attenzione sulla parte superiore del DLN con una pinza per facilitarne la rimozione. Estrarre il DLN mettendo una pinza sotto il tessuto linfoide (Figura 3A e 3B). Posizionare il DLN in un pozzo contenente colino cella 4,5 ml SM + 70 micron (tavola A).
  7. Raccolto l'intero orecchio inoculato usando forbici affilate sterili e pinze (Figura 4A). Separmangiato gli aspetti dorsale e ventrale dell'orecchio da pizzicare e distanziare il taglio termina con due pinze (Figura 4B - 4E). Mettetele in un pozzo contenente 4,5 ml di SM (tavola B) assicurandosi che entrambi i tessuti sono completamente immersi nel mezzo.
    NOTA: Al fine di migliorare l'affidabilità dell'esperimento e aumentare il numero di cellule di interesse, pool 2 iniettato orecchie o 2 dLNs dallo stesso animale per campione.
  8. Raccolta e processo in parallelo le orecchie e dLNs di topi inoculati sia con 1x DPBS o estratti delle ghiandole salivari. Include 2 ulteriori campioni per le orecchie e linfonodali raccolte da un mouse ingenuo per i controlli di compensazione colorazione negativa e singole.

5. isolamento delle cellule da linfonodi

  1. Incubare i linfonodi (tavola A) a 37 ° C + 5% di CO 2 per 15 minuti sotto agitazione. Aggiungere etilendiamminotetraacetico 10 mM finale (EDTA) per pozzetto per neutralizzare collagenasi e DNase actività. Eseguire i prossimi passi sul ghiaccio.
  2. Dissociare linfonodi utilizzando l'estremità superiore di una siringa stantuffo 5 ml. Press con movimenti circolari contro il filtro fino a quando non rimane che tessuti connettivi bianchi.
  3. Risciacquare il filtro delle cellule due volte con 500 ml DPBS 1x + 2% di siero fetale bovino (FBS) + 2mM EDTA. Trasferire intero volume del pozzetto in una provetta da 15 ml.
  4. Lavare il ben due volte con 500 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA e trasferire il volume nel tubo 15 ml. Mantenere i tubi in ghiaccio.

6. isolamento delle cellule dalla pelle del Ear

  1. Incubare i volantini per le orecchie (tavola B) a 37 ° C + 5% di CO 2 per 1 ora sotto agitazione.
    NOTA: Dopo 20 min di incubazione, tagliare i volantini per le orecchie con le forbici in piccoli pezzi per facilitare la digestione dei tessuti e mettere il campione di nuovo in incubatrice per il restante 40 min. Singole cellule possono essere osservati in mezzo al termine del tempo di incubazione.
  2. Aggiungere 10 mM finale EDTA per pozzetto per neutralizzare le attività collagenasi e DNasi. Eseguire i prossimi passi sul ghiaccio.
  3. Trasferire i frammenti di tessuto dell'orecchio e l'intero volume del mezzo in un nuovo pozzo contenente un filtro cella 70 micron con una pipetta 1 ml. Tagliare 2 a 3 mm dall'estremità della punta per raccogliere i frammenti di tessuto dell'orecchio più facilmente.
  4. Dissociare frammenti di tessuto dell'orecchio con l'estremità superiore di una siringa stantuffo 5 ml. Press con movimenti circolari contro il filtro fino a quando non rimane che tessuti connettivi bianchi.
  5. Lavare le cellule due volte con filtri 500 DPBS microlitri 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
  6. Trasferire l'intero volume del pozzo in 50 ml-tubo attraverso un colino cella 70 micron.
  7. Risciacquare pozzo con 500 microlitri 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA e trasferire il volume nel tubo 50 ml. Mantenere la provetta in ghiaccio.
    NOTA: Le diverse fasi di isolare cellule totali dalla pelle e tessuti DLN sono riassunti nella Figura 5.
title "> 7. Conte e la vitalità delle cellule raccolte

  1. Centrifugare la pelle e campioni DLN per 5 min a 450 xg a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet con 300 ml DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
  2. Raccogliere un piccolo volume di ogni campione per contare il numero totale di cellule isolate dalla pelle e DLN con un emocitometro. Aggiungere 0,04% trypan blu per determinare la vitalità cellulare.

8. Blocco di non antigene-specifica Binding

  1. Aggiungere 10 ug / ml di CD16 non marcato / CD32 Fc-block anticorpi. Incubare 20 minuti a 4 ° C (può andare più).
  2. Aggiungere 2 ml di freddo 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Centrifugare il campione per 5 minuti a 450 xga 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet con 300 ml DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA e mantenere i campioni in ghiaccio.

9. macchie sulla pelle e le cellule mieloidi Linfonodo

  1. Incubare sci precedentemente bloccaton e DLN isolato cellule con Live / inseguitore Morto (cioè 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole o DAPI), anti-CD45 e anti-CD11b anticorpi specifici.
    NOTE: Al fine di arricchire le sottopopolazioni di cellule mieloidi di interesse, in particolare quelli rari, le cellule e linfociti CD45 + possono essere, rispettivamente, purificati dalla pelle o impoverito dal DLN dal tallone magnetica ordinamento delle cellule di facilitazione. Poiché la maggior parte delle cellule isolate dal DLN sono CD45 +, l'uso di anti-CD45 non è obbligatoria. Altri marcatori possono essere inclusi per identificare sottopopolazioni di cellule mieloidi di interesse dalla strategia positiva o negativa-gating. In questo protocollo, le cellule mieloidi reclutate nel DLN sono stati arricchiti escludendo cellule CD8α + (tutto il compartimento di cellule T può essere bersaglio di utilizzare anti-CD3 anticorpo specifico).
  2. Incubare 30 minuti a 4 ° C al buio. Aggiungere 500 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA, centrifugare il campione 5 min a 450 xg a 4 ° C e scartare il supernatant. Ripetere la fase di lavaggio due volte.
  3. Risospendere i campioni con 300 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. Trasferire l'intero volume in un tubo FACS attraverso un colino cella 35 micron. Lavare il filtro con 100 microlitri DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA.
  4. Eseguire le cellule colorate in un citometro di flusso. Porta di vivere celle singole (DAPI -, FSC-W) di ​​escludere le cellule morte e doppiette. Trama CD45 + CD11b + eventi per la pelle (figura 6A) e (CD45 +) CD8α - CD11b + eventi per il DLN (Figura 6B).

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Risultati

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Abbiamo recentemente dimostrato che l'ago-siringa per iniezione di immunizzare dosi di P. berghei sporozoiti nella pelle del mouse induce un reclutamento successiva di neutrofili polimorfonucleati seguite da monociti infiammatorie della pelle e DLN 19. La Sezione protocollo descritto in dettaglio la procedura utilizzata per isolare con successo cellule mieloidi dal vivo da entrambi i tessuti seguenti iniezioni multiple di gran numero di sporozoiti nel derma dell&#...

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Discussione

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Nella prospettiva della vaccinazione su larga scala degli esseri umani utilizzando un intero vaccino contro la malaria sporozoite, una delle principali sfide da superare è quello di sviluppare percorsi e metodi di somministrazione parassita ottimizzati per garantire l'immunizzazione e la protezione 24,25 successo. Negli esseri umani, la valutazione della efficacia protettiva mediata da parassiti vivi attenuati (LAP) sono seguite zanzara naturale morde 2, nonché intradermica, sottocutanea 2...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge per la lettura critica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge aiuto per scattare foto e Pauline Formaglio per l'insegnamento imaging in vivo di sporozoite motilità nella pelle del mouse. Vorremmo anche ringraziare Marek Szatanik e il Centro di Produzione e infezione di Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) per l'allevamento di zanzare. Questo studio è stato sostenuto dal Fondo AXA Ricerca e fondi dal Laboratoire d'Excellence "Biologia Integrativa di Emerging Infectious Diseases" (Grant no. ANR-10-LabX-62-IBEID).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ketamina: Imalgene® 1.000Merial-50mg/kg: precedente iniezione di sporozoite 125 mg/kg: sacrificio precedente
Xilazina: Rompun® 2%Bayer-5mg/kg: precedente iniezione di sporozoite 12,5 mg/kg: sacrificio precedente
siringa NanoFil + ago calibro 35World Precision Instruments --
Omnican® 50 Siringa da insulina 0,5 ml/50 U.I.B. Braun Medical Piastra per
coltura tissutale 9151125-MultiwellTM a 6 pozzetti... Fondo piattoBD Falcon 353046-70
µ filtro cellulare m BD Falco352350-Siringa
da 2 mlTerumoSS-02S-BLUE
MAXTM 15 ml Tubo conico in polipropileneBD Falcon352097-BLUE
MAXTM 50 ml Tubo conico in polipropileneBD Falcon352098-5
ml di tubo a fondo tondo in polistirene con 35 µ m Tappo Filtro CellulareBD Falcon
1x CaCl2- e MgCl2--freeLife Technologies14190-094-DMEM
1x + GlutaMAXTMLife Technologies31966-021-Collagenasi
da Clostridium histolyticum, Tipo IV 0,5-5,0 unità FALGPA/mg solido Sigma-Aldrich C5138400 U/ml 
Desossiribonucleasi I da pancreas bovino, tipo IVSigma-Aldrich D502550 & micro; g/ml
di sale disodico EDTASigma-Aldrich E-513410 mM o 2,5 mM
FBSBiowestS1810-500-HEPES
soluzione tampone (1M)Gibco15630-05625 mM
Trypan blue Stain (0,4%)Life Technologies15250-061Diluizione 1:10 
Anti-topo CD16/CD32 (clone 2.4G2)BD Biosciences55314210 µ g/ml finale (1:50)
DAPI FluoroPureTM gradoLife TechnologiesD214901 µ g/ml finale
Anti-topo CD45 (clone 30-F11)BD Biosciences559864  Diluizione 1:200
Anti-topo CD11b (clone M1/70)BD Biosciences557657  Diluizione 1:400
Anti-topo CD8&alfa; (clone 5H10)Tecnologie per la vitaMCD0830  Diluizione 1:100
Topi femmina C57BL/6JRj (7 settimane) Laboratori Janvier--
352235-DPBS

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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