Articolo metodologico

Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura

DOI:

10.3791/53797

⸱

5 marzo 2016

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine-Phoenix, 2Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Le colture a bassa densità di neuroni primari dell'ippocampo di solito richiedono uno strato di alimentazione della glia per fornire fattori neurotrofici e sostenere la longevità. Descriviamo qui un metodo semplificato per coltivare neuroni a bassissima densità su vetrini coprioggetti in presenza di uno strato di alimentazione neuronale ad alta densità, che facilita lo studio di specifici meccanismi neuronali-autonomi.

Abstract

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La coltura neuroni dell'ippocampo primari in vitro facilita interrogatori meccanicistica di molti aspetti dello sviluppo neuronale. Dissociati neuroni dell'ippocampo embrionali possono spesso crescere con successo su vetrini ad alta densità in condizioni di libero-siero, ma le culture a bassa densità in genere richiedono una fornitura di fattori trofici da loro co-coltura con uno strato alimentatore glia, preparazione che può richiedere molto tempo e laborioso. Inoltre, la presenza di cellule gliali può confondere l'interpretazione dei risultati e degli studi ostino sui meccanismi specifici neuroni. Qui, un metodo semplificato è presentato per ultra-bassa densità (~ 2.000 neuroni / cm 2), a lungo termine (> 3 mesi) cultura neurone dell'ippocampo primaria che è in condizioni di libero siero e senza supporto di cellule gliali. neuroni a bassa densità sono coltivate su vetrini rivestiti di poli-D-lisina, e capovolte sui neuroni ad alta densità coltivate in una piastra da 24 pozzetti. Invece di utilizzare punti paraffina per creare uno spazio between i due strati neuronali, gli sperimentatori possono semplicemente incidere il fondo in plastica del pozzo, in cui i neuroni alta densità risiedono, per creare un microspazio favorevole alla crescita neurone bassa densità. Il co-coltura può essere facilmente mantenuta per> 3 mesi senza significativa perdita di neuroni bassa densità, facilitando così lo studio morfologico e fisiologico di questi neuroni. Per illustrare questa condizione culturale di successo, i dati vengono forniti per mostrare la formazione di sinapsi profusa nelle celle a bassa densità dopo la cultura prolungato. Questo sistema di co-coltura facilita anche la sopravvivenza dei neuroni individuali sparse coltivate in isole di substrati poli-D-lisina e quindi la formazione di connessioni autaptic.

Introduzione

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Crescita neuroni ippocampali in condizioni in vitro consente osservazione e manipolazione sperimentale di questi neuroni che altrimenti non sarebbero possibili in vivo. Questo approccio sperimentale è ampiamente usato per rivelare i meccanismi neuronali della crescita, della polarità, le specifiche dei neuriti, il traffico e localizzazione subcellulare delle proteine, formazione di sinapsi e la maturazione funzionale 1. Questi in vitro in coltura neuroni dell'ippocampo, quando raccolto dalle fasi tardo embrionali, sono relativamente puro (> 90%), le cellule glutamatergiche della morfologia piramidale 2. Poiché i ne....

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Protocollo

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Tutte le procedure sperimentali di topi sono stati approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali della University of Arizona, e conformi alle linee guida NIH.

1. Tissue sorgente per ippocampale Neuron Cultura

  1. Per generare cuccioli di topo prenatali per la cultura neuroni dell'ippocampo, usare i topi tempo in stato di gravidanza (C57Bl6 / J) che vengono allevati in casa 17. La giornata con rilevazione spina vaginale è designato come E0.5. Il tempo del raccolto previsto per la cultura è E16.5-E17.5.
    Nota: Questo protocollo descrive le culture di due piastre da 24 pozzetti di due neuroni ad al....

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Risultati

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Il protocollo qui descritto consente successo densità ultra-bassa, coltura a lungo termine di neuroni glutamatergici puri senza la necessità di cellule gliali che servono come strato alimentatore. Il protocollo è diagramed in Figura 1, che prevede la preparazione di alta densità (su poli-D-lisina rivestite 24 pozzetti) e neuroni bassa densità (su poli-D-lisina vetrini rivestiti) separatamente, e successiva co-coltura che possono essere mantenuta fino a tre mesi.

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Discussione

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Vi presentiamo un protocollo dettagliato per la cultura a lungo termine di ultra-bassa densità di neuroni dell'ippocampo glutamatergici in condizioni di libero siero. A ~ 2000 neuroni / cm 2, la densità è almeno due volte inferiore rispetto maggior parte dei preparati 'basse densita' di cultura, con o senza il supporto glia riportato dalla letteratura esistente 2,3,11,13,14. Oltre ad essere ultra-bassa densità, questo protocollo è nuovo e significativo altri due modi. In primo luogo, no.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato da una sovvenzione NIH/NIMH a S.Q. (R00MH087628).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Medium neurobasaleLife Technologies21103-049Protect from light
integratore di B27Life Technologies17504-044aliquota, conservare nel formato da 0,6 ml
GlutaMAX-ILife Technologies35050-061diluito 100X 
antibiotico-antimicotico (AA)Life Technologies15240-096diluito 100X 
di coltura completoTerreno neurobasale con 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Terrenodi lavaggio uguale al 'Terreno neurobasale'Terreno
di alimentazioneNeurobasale con 1X integratore di B27
DNAse ISigma-AldrichD5025preparare 100X stock a 0,6 mg/ml
di poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407M.W. 70000-150000
tampone boratoSigma-AldrichB6768 (acido borico); 71997 (borace)1,24 g di acido borico e 1,9 g di borace in 400 ml di H2O, pH fino a 8,5 utilizzare
vetrini coprioggetti rotondi in vetro HCl da 12 mmGlasswarenfabrik Karl Hecht GmbH1001/12No. 1 vetro, acquistare da Carolina Biological Supply
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anticorpo anti-GluR1 Anticorpopoliclonale di coniglioMilliporeAB1504
salina bilanciata di HankThermoFisher14025092formato da 500 ml
Terreno Soluzione

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banker, G. Cultureing Nerve Cells. , 2nd edition, 339-370 (1998).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  3. Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G.

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