Este procedimento descreve como encapsular citocromo C (cyt. C) em sílica (SiO2) de sol-gel, processos esses géis para formar bioaerogels, e utilizar estes bioaerogels reconhecer rapidamente óxido nítrico (NO) por meio de uma reacção em fase gasosa. Este tipo de protocolo pode ajudar no futuro desenvolvimento de biossensores ou outros dispositivos bioanalíticos.
As aplicações, tais como sensores, baterias e pilhas de combustível foram melhoradas através da utilização de aerogeles altamente porosos compostos funcionais quando são encapsulados dentro dos aerogeles. No entanto, poucos relatos sobre encapsular proteínas dentro de sol-gel que são processados para formar aerogéis de existir. Um processo para a encapsulação de citocromo C (cyt. C) em sílica (SiO2) de sol-geles que são super-criticamente processados para formar bioaerogels com actividade de fase gasosa para o óxido nítrico (NO) é apresentada. Cit. C é adicionado a uma solução coloidal de sílica misturado sob a concentração de proteína e tampão controlada condições de resistência. A mistura é, então, gelificada Sol e o líquido de enchimento dos poros do gel é substituído por uma série de intercâmbios de solventes com dióxido de carbono líquido. O dióxido de carbono é levado ao seu ponto crítico e ventilado fora para formar aerogels secos com cit. C encapsulado dentro. Estes bioaerogels são caracterizados com uma espectroscopia de UV-visíveld espectroscopia de dicroísmo circular e pode ser usado para detectar a presença de óxido nítrico na fase gasosa. O sucesso deste procedimento depende da regulação da concentração de C cit. E a concentração de tampão e não necessita de outros componentes, tais como as nanopartículas metálicas. Pode ser possível encapsular outras proteínas utilizando uma abordagem semelhante tornando este procedimento importante para o futuro desenvolvimento potencial dispositivo bioanalítico.
Citocromo C (cyt. C) é uma proteína de transferência de electrões chave envolvida em reacções de respiração celular do organismo. Tem sido demonstrado estar envolvida na apoptose, uma forma controlada de morte celular, e ele pode detectar pequenas moléculas tais como tóxicos de óxido nítrico e de monóxido de carbono 1-3. O óxido nítrico (NO) desempenha um papel numa variedade de processos fisiológicos que ocorrem nos sistemas nervosos, cardiovasculares e imunes. Enquanto cit. C normalmente requer um ambiente aquoso tamponado a valores de pH neutro para permanecer estruturalmente intacta e ativa, a pesquisa mostrou que cit. C pode manter a sua estrutura e função em materiais sólidos conhecidos como aerogels sob certas condições 4-9.
Os aerogéis são materiais altamente porosos, muitas vezes formadas por óxidos metálicos sintetizar sol-gel (Enquanto os aerogéis de óxido de metal são muito comuns, o carbono e outros tipos de aerogel foram sintetizados. Um exemplo é InP aerogels) 10 e a secagem destas sol-gel, de tal forma que a matriz sólida porosa é deixado inalterado 11-14. Todos os poros aerogels sólidos resultar em muito aerogels disponíveis área de superfície tornando extremamente útil para todas as aplicações onde as reações de superfície são importantes. Quando química ou bioquímica funcionalidade é montado dentro do nanoarquitetura aerogel, demonstrou-se que a porosidade e área de superfície física melhorada dos aerogeles ajudar a melhorar sensores, bem como eléctrodos para baterias, células de combustível, e aplicações supercapacitores 11,15-23 . A fim de secar aerogéis de um modo que deixa a matriz sólida porosa inalterada, é típico para remover o solvente que permanece nos poros após a síntese de sol-gel através de extracção com solvente supercrítico. Qualquer colapso de poros que pode ser causado por forças de tensão superficial como um solvente se evapora a partir do gel são minimizadas por causa de secagem supercrítica, uma interface líquido-vapor nunca formas.
<p class="jove_content"> Há muitos relatos de proteínas heme como cit. c sendo encapsulada em sol-gel que foram mantidos molhados ou que foram secas ambientalmente 24-30. Relatórios de encapsular biomoléculas em sol-geles que são depois secos super-criticamente para formar aerogeles são mais raros devido ao processamento necessário que pode ser prejudicial para a estrutura de muitas proteínas. No caso de cit. C, certas condições tornam possível manter a capacidade de cit. C para detectar e responder a óxido nítrico na fase gasosa dentro de aerogéis. Uma vez estabilizado, no aerogel, a estrutura de poros de elevada qualidade do aerogel facilita a reacção entre cit. C 4,8,9 e óxido nítrico. Cit. C pode ser encapsulado dentro de aerogeles pela primeira associando-o em várias camadas à volta de nanopartículas de prata ou de ouro na solução de 4-8. Estes superestruturas de várias camadas servem para proteger a proteína na matriz de aerogel. No Approac mais recenteh que nós desenvolvemos, quando a concentração de proteína e tampão de força são controlados juntamente com outras condições sintéticas, cit. c mantém integridade dentro dos aerogéis mesmo sem metal de nanopartículas associação inicial 9.A síntese começa como muitas sínteses de aerogel começar pela mistura de precursores de sílica sol-gel por um determinado período de tempo. É depois de um tempo definido que cit. C é adicionado como uma solução tamponada na mistura de mistura. A gelificação ocorre, em seguida, de modo a formar uma estrutura de sílica sólido poroso em que os poros são cheios com água, metanol, restantes reagentes e subprodutos. Este líquido que preenche os poros podem ser enxaguadas com vários solventes através de uma série de intercâmbios de solventes, as últimas trocas com dióxido de carbono líquido que ocorre dentro de um aparelho de ponto crítico de secagem mantidos a baixa temperatura. Unindo os géis acima da temperatura crítica (31,1 ° C) do dióxido de carbono facilita a formação de quantoupercritical fluido pressurizado no interior do aparelho que pode ser ventilado de modo a formar, aerogéis altamente porosos secos. A temperatura relativamente baixa requerida para o dióxido de carbono para formar um fluido supercrítico é vantajosa em relação a outros solventes, pois mantém a proteína abaixo de uma temperatura à qual pode desnaturar.
A nossa abordagem livre de nanopartículas de metal para encapsular cit. C em aerogéis é vantajoso, porque é um processo simples que pode levar ao desenvolvimento de um protocolo mais geralmente aplicável para a encapsulação de outras proteínas bem. Muitas proteínas podem não interagir com nanopartículas de metal, da mesma forma que CYT. C faz a síntese de metal e de nanopartículas ou compra acrescenta tempo e custos adicionais ao processo. Os poucos relatos sobre encapsular proteínas em aerogéis de tornar o desenvolvimento deste processo um passo significativo para a frente para encontrar um procedimento mais geral para encapsular outras proteínas no aerogels que podem ajudar in potenciais futuros dispositivos bioanalíticos.
A seção de protocolo deste manuscrito descreve como sintetizar sol de sílica-gel, encapsular cit. C para estas sol-gel, secar estas sol-gel compostas para formar aerogeles, caracterizar estas bioaerogels usando espectroscopia UV-visível e circular dicroísmo e detectar a presença de óxido nítrico na fase gasosa com estes bioaerogels. Cit. C foi encapsulada com sucesso em aerogéis quando primeiro dissolvido em 4,4 a 70 mM de soluções aquosas de tampão de fosfato. No entanto, a estrutura da proteína optimizado em aerogéis foi encontrada para resultar quando da encapsulação de 40 mM de fosfato de soluções tamponadas de cit. Cit c produzindo aerogel carregado. C concentrações na gama de 5 a 15 ^ M 9. Portanto, o protocolo é dada a seguir para sintetizar os aerogéis utilizando soluções tamponadas de fosfato 40 mM de cit. C, resultando numa cit carregado. Concentração c nos aerogéis de 15 uM. </ P>
Como descrito, este procedimento produziu consistentemente cit viável. C encapsulado dentro aerogels. A concentração de cit. C dentro dos aerogeles podem ser variou de 5 a 15 ^ M e a concentração da solução tampão c inicial cit. Encapsulado dentro dos aerogeles podem ser variadas entre 4,4 e 70 mM de fosfato sem graves efeitos prejudiciais na viabilidade proteína. No entanto, o centro de pico e largura do pico do cit característica. C Soret pico em aerogéis são mais próximo do que eles são para cit. C na solução quando cit. C é encapsulado em aerogéis de soluções de 40 mM tampão 9.
A síntese do cit. C -SiO 2 aerogéis é afectada pela idade de alguns dos reagentes de partida. Metanol, tetrametoxissilano, e solução de hidróxido de amónio são higroscópicos e deve ser substituído cada mês de um-para-dois. O aumento da água que se acumula noestes reagentes ao longo do tempo afecta as características estruturais de gel e o tempo de transição sol-a-gel.
Ao realizar a secagem supercrítica, barco transferência do aparelho de secagem ponto crítico do pode conter até dezoito 0,5 cm de espessura, 1 géis cm de diâmetro. Conforme descrito na seção de protocolo, um enchimento específica e procedimento de drenagem deve ser seguido para transferir dióxido de carbono em processo sol-gel. É importante notar que, no início do protocolo de drenagem, a mistura a drenagem do dióxido de carbono e acetona flui a uma taxa tão elevada que o tubo de drenagem congela rígida com a humidade de condensação de gelo no lado de fora. A mistura contém a drenagem para fora um pouco de água uma vez que a acetona não é anidro e esta água pode, ocasionalmente, congelar a um ponto em que o tubo de drenagem, na verdade, bloqueia. É necessário prestar atenção para essas obstruções e para ouvir uma interrupção do fluxo. A válvula de drenagem devem ser fechados por alguns minutos de forma a obstrução vai derreter se uma obstrução for detectado. Dentroo pior cenário, se a válvula de drenagem não está fechada, uma obstrução pode causar tanta pressão para construir que o tubo de drenagem com força aparece fora do aparelho. Após os primeiros períodos de drenagem, a maior parte da acetona terá sido lavado para fora do aparelho, e a ocorrência de pedaços de gelo molhado irá diminuir dramaticamente. A descarga será semelhante progressivamente gelo seco como o protocolo de drenagem continua com qualquer evidência residual da presença de acetona (como perfume) tornando-se indetectável no final do processo de drenagem.
Depois de o dióxido de carbono no aparelho tem a transição do estado líquido para o fluido supercrítico e o processo de ventilação tiver começado, é necessário para libertar o fluido a uma taxa lenta durante pelo menos 45 min, tal como indicado no processo 9. Um aumento da taxa de libertação pode diminuir a viabilidade de cit. C (como mostrado na Figura 9) dentro dos aerogéis e os aerogéis podem-se realmente se separam como the fluido corre para escapar dos géis. Em geral, mesmo quando os aerogéis permanecer intacto depois de abrir a porta do aparelho, é importante para segurá-los cuidadosamente e suavemente como eles são quebradiços e podem romper facilmente.
Os géis de controlo de sílica que se precipitam ao lado do citocromo c. -SiO 2 géis são utilizados após secagem super-critica para determinar se a transferência de dióxido de carbono nos géis foi bem-sucedida. Por vezes, a cit. C -SiO 2 géis podem aparecer turva e é importante para determinar se este é devido à transferência incompleta solvente ou se pode ter a ver com a concentração de a cit. C ou tampão encapsulado dentro dos geles. Se os géis de sílica, sem cit. C parecem ter uma aparência homogénea e translúcida todo, esta pode ser tomada como evidência de que a transferência de solvente ocorrido completamente, mesmo se o cit. C -SiO 2 géis têm alguma turvação a eles. Turvação nos geles de sílicasem cit. C, após secagem indica que um pouco de acetona permaneceu dentro dos geles durante a ventilação.
Como indicado na seção de protocolo, as precauções de segurança importantes precisam ser tomadas quando se trabalha com o óxido nítrico (NO). Para detectar NÃO usando os aerogeles, é necessário vedar a cuvete muito bem e para descarregar o gás que flui ao longo dos aerogéis num exaustor de fumos. Em alternativa, todo o espectrofotómetro pode ser movido para um exaustor de fumos, juntamente com o cilindro de gás de NO como precaução adicional para limitar a exposição ao gás de. Em contato com o ar NO irá imediatamente produzir o dióxido de azoto, tetróxido de nitrogênio altamente venenosas ou ambos. NO também pode reagir com água para produzir calor e corrosivos fumos. Portanto, a exposição sustentada para o NO pode resultar em toxicidade direta dos tecidos.
Quando se utiliza o cit. C -SiO 2 aerogéis para detectar a presença do óxido nítrico, a banda Soret será inicialmente em ~ 408 nm e vai deslocara ~ 414 nm na presença de óxido nítrico. Depois de voltar para azoto, a banda Soret deve reverter de volta a estar centrado em ~ 408 nm. Pode também ser possível usar o cit. C -SiO 2 aerogéis para detectar a presença de outros ligandos, tais como o monóxido de carbono 27.
Diferentes processos publicados incluir um passo adicional de combinação de nanopartículas de ouro ou prata com cit. C em solução antes de se misturar com o Sol e super-criticamente a secagem para formar aerogeles 4-8. Comparando-se a espectroscopia de UV-visível de cit. C encapsulado em aerogeles com nanopartículas metálicas para que de cit. C encapsulado em aerogéis sem nanopartículas metálicas mostra que estes dois tipos de técnicas de encapsulação produzir cit. C de viabilidade semelhante dentro dos aerogéis (Figura 5) . No entanto, o cit. C encapsulado com nanopartículas metálicas é um pouco mais estável do que cit. C encapsulard sem nanopartículas metálicas dentro dos aerogéis 9. Os espectros de CD de ambos os tipos de citocromo c. Aerogéis também são semelhantes, embora ambos diferem do espectro de cit. C em tampão indicando algum desdobramento de cit. C dentro dos aerogéis (Figura 7). Os anteriores relatórios sobre cit. C encapsulados em aerogéis sugerem que a espectroscopia de dicroísmo circular é mais provável avaliar a camada mais externa da proteína, desdobrado em contacto com o gel de sílica, dentro de um ou outro metal cit várias camadas nanopartícula-nucleada. Estruturas c ou estruturas fracamente organizadas que formam quando não nanopartículas metálicas estão presentes em aerogéis de 4,9. A maioria do cit. C dentro de um ou outro tipo de estrutura de auto-organizados dentro dos aerogéis permanece dobrado, tal como medido por espectroscopia de UV-visível, embora. A vantagem do protocolo descrito aqui sans nanopartículas é que compra cara ou síntese demorado de metaisnanopartículas não é necessário. As proteínas não têm sido encapsulados com sucesso dentro de aerogeles, e de modo que este procedimento é importante na medida em que podem levar ao desenvolvimento de um método para a encapsulação de mais geral outras proteínas com significância no aerogéis potencial para futuros dispositivos bioanaliticas.
The authors have nothing to disclose.
O suporte para este trabalho e / ou publicação foi fornecido pelo Instituto de Ciências da Faculdade de Artes da Universidade de Fairfield e Ciências, Faculdade Research Grant da Universidade de Fairfield, um Prêmio de Ciência Cottrell Colégio da Corporação de Pesquisa para a Ciência Avanço da Faculdade de Artes e Ciências da Universidade de Fairfield e Química & Bioquímica Departamento da Universidade de Fairfield. Agradecemos Jean Marie Wallace para a introspecção muito útil e aconselhamento no que diz respeito a esta área geral de pesquisa. Além disso, estendemos um agradecimento muito especial a todos passados, atuais e futuros pesquisadores de graduação da Harper-Leatherman Research Lab.
Potassium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic) |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic) |
Water | Millipore Direct-Q | 18 MΩ cm | |
pH meter and electrode | Denver Instrument | UB-10 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma Aldrich | C7752-100MG | ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C |
Glass scintillation vials | Wheaton | 03-341-25J | 20 mL, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm |
Disposable cuvette | Fisher Scientific | 14-955-126 | methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm |
Ultraviolet Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-1800 | Uses UVProbe v 2.33 software |
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) | JASCO | J-810 | |
Isotemp Laboratory Refrigerator | Fisher Scientific | ||
Polypropylene disposable beakers | Fisher Scientific | 01-291-10 | 50 mL |
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) | Sigma Aldrich | 218472-500G | 98% purity |
Methanol | Fisher Scientific | A457-4 | GC Resolv grade |
Ammonium hydroxide solution | Sigma Aldrich | 221228-25ML-A | ACS reagent, 28.0-30.0% |
General purpose polypropylene scintillation vials | Sigma Aldrich | Z376825-1PAK | 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor |
generic plastic wrap | various | ||
Parafilm M laboratory wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
Plastic syringe plunger | various | use syringe plunger from 3 mL syringe | |
Ethyl alcohol | Acros | 61509-0040 | Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent |
Acetone | Fisher Scientific | A949-4 | HPLC grade |
Critical point drying apparatus | Quorum Technologies | E3000 Series | |
Circulator | Fisher Scientific | Isotemp 3016 | |
Carbon dioxide cylinder | Tech Air | siphon tube | |
Micrometer | Central Tool Company | ||
GRAMS/AI 8.0 software | Thermo Electron Corporation | ||
Nitrogen cylinder | Tech Air | Another inert gas could be substituted | |
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder | Airgas | ||
Tygon tubing | various | ||
T-switch valve | various | ||
syringe needles | various |