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Articolo metodologico

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

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⸱

DOI:

10.3791/53806

⸱

3 marzo 2016

 ,  , 
1The Center for Stem Cell Biology, Developmental Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Cancer Biology and Genetics Program, Gerstner Sloan-Kettering Graduate School, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 3Thermo Fisher Scientific

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro descrive un protocollo in vitro la differenziazione di produrre pigmentate, i melanociti maturi da cellule staminali pluripotenti umane tramite una cresta neurale e melanoblast fase intermedia utilizzando un protocollo senza alimentatore 25 giorni.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) rappresentano una piattaforma per studiare lo sviluppo umano in vitro sia in condizioni normali che di malattia. I ricercatori possono dirigere la differenziazione delle hPSC nel tipo di cellula di interesse manipolando le condizioni di coltura per ricapitolare i segnali osservati durante lo sviluppo. Uno di questi tipi di cellule è il melanocita, una cellula produttrice di pigmenti di origine cresta neurale (NC) responsabile della protezione della pelle dall'irradiazione UV. Questo protocollo rappresenta un'estensione di un protocollo di differenziazione in vitro delle creste neurali attualmente disponibile dalle hPSC per differenziare ulteriormente le NC in melanociti completamente pigmentati. I precursori dei melanociti possono essere arricchiti dal protocollo Neural Crest tramite un'esposizione temporizzata agli attivatori della segnalazione WNT, BMP e EDN3 in condizioni di doppia inibizione SMAD. I precursori dei melanociti risultanti vengono quindi purificati e maturati in melanociti completamente pigmentati mediante coltura in un mezzo selettivo. I melanociti risultanti sono completamente pigmentati e si colorano in modo appropriato per le proteine caratteristiche dei melanociti maturi.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) forniscono una piattaforma per imitare la differenziazione normale in un modo scalabile per la modellazione della malattia, lo screening di stupefacenti, e le terapie di sostituzione cellulare 1-6. Di particolare interesse, hPSCs aprono strade per studiare difficili da isolare o tipi di cellule rare / transitori in cui i campioni dei pazienti sono scarse. Cellule staminali pluripotenti Inoltre, indotte (iPSCs) permettono ai ricercatori di studiare lo sviluppo e la modellazione della malattia in modo specifico paziente a svelare i meccanismi unici 1,2,7-11. Il protocollo precedentemente pubblicato per la differenziazione dei melanociti da hPSCs richiede fino a 6 settimane di differenziazioni e coinvolge le cellule di coltura con medium condizionato dalle cellule L-Wnt3a 12. Il protocollo prima presentata da Mica et al. E qui descritto produce cellule pigmentate in tre settimane e rimuove l'ambiguità e incoerenze associate a mezzo condizionato.

I melanociti are derivati ​​dalla cresta neurale, una popolazione di cellule migratoria unici per vertebrati. La cresta neurale è definita durante gastrulation e rappresenta una popolazione di cellule sul bordo della piastra neurale, al confine tra la ectoderma neurale e non neurale. Durante neurulazione, il tessuto nervoso evolve da una piastra neurale per formare pieghe neurali, che convergono sulla linea mediana dorsale, con conseguente 13,14 tubo neurale.

Le cellule della cresta neurale emergono dalla piastra tetto del tubo neurale, di fronte alla notocorda, e subiscono una transizione epitelio mesenchimale prima di migrare via per dare luogo ad una popolazione eterogenea di cellule differenziate. I destini delle cellule della cresta sono definite in parte dalla posizione anatomica della lamiera del tetto lungo l'asse del corpo dell'embrione. Derivati ​​di cellule della cresta neurale includono linee caratteristiche di entrambi mesoderma (cellule muscolari lisce, osteoblasti, adipociti, condrociti) e le cellule ectoderma (melanociti, Schwann cells, neuroni) 14. Le cellule staminali della cresta neurale upregulate il fattore di trascrizione SOX10 e possono essere isolate da cellule di fluorescenza-attivato l'ordinamento con anticorpi anti p75 e HNK1.

Le cellule della cresta neurale destinato a diventare melanociti passare attraverso una fase melanoblast e upregulate KIT e MITF (fattore di trascrizione microftalmia-associato) 6,21 MITF è un regolatore Master di Sviluppo melanociti ed è un fattore di trascrizione responsabile del controllo gran parte dello sviluppo melanociti 22- 24. melanoblasts umani migrano allo strato basale dell'epidermide dove risiedono sia nel ringrosso capelli o circondato da cheratinociti nell'epidermide (unità formanti pigmentazione) da utilizzare come precursori delle maturi, melanociti pigmentati. La differenziazione e la maturazione delle melanoblasts in melanociti pigmentati avviene in concomitanza con la colonizzazione del bulbo pilifero e l'espressione della filiera di produzione di melanina (TYRP1, TYR, OCA2 ePMEL) 25,26.

Isolare melanociti umani e melanoblasts da pazienti è costoso, difficile e limitante nella quantità. Questo protocollo consente ai ricercatori di differenziare hPSCs (indotta o embrionali) in melanociti o precursori melanociti in un metodo ben definito, rapida, riproducibile, scalabile ed economica, senza l'ordinamento delle cellule. Il protocollo è stato utilizzato in precedenza per identificare i difetti malattie specifiche quando differenziare iPSCs da pazienti con disturbi della pigmentazione.

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Protocollo

NOTA: Il protocollo di melanociti qui delineato è stato dimostrato da Mica et al.

1. Preparazione del terreno di coltura, patinata Piatti e manutenzione di hPSCs

  1. Media Preparazione
    Nota: Conservare tutto media a 4 ° C al buio fino a 2 settimane. Filtro di medie per la sterilizzazione.
    1. Preparare DMEM / 10% FBS. Mescolare 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep e 5 ml di L-glutammina. Filtro per la sterilizzazione.
    2. Preparare hESC-media. Mescolare 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml di L-glutammina, 10 ml minimo indispensabile soluzione MEM aminoacidi, 1 ml di beta-mercaptoetanolo, e 5 ml Pen / Strep. Dopo filtrazione aggiungere 10 ng / ml FGF-2.
    3. Preparare medio KSR-differenziazione: Mescolare 820 ml Knockout DMEM, 150 ml di KSR, 10 ml di L-glutammina, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimo indispensabile soluzione aminoacidi e 1 ml di β-mercaptoetanolo. Filtro per la sterilizzazione.
    4. Preparare medio N2-differenziazione. Sciogliere 12 g DMEM / F12 in polvere in 980 ml ​​dH 2 O. Aggiungere 1,55 g di glucosio, 2 g di sodio bicarbonato e 100 mg apo transferrina umana. Mescolare 2 ml dH 2 O con 25 mg di insulina umana e 40 microlitri 1 N NaOH; una volta sciolto, aggiungere il composto al mezzo. Aggiungere 100 ml dicloridrato putrescina, 60 microlitri selenite, 100 ml progesterone. Portare il volume finale di 1 litro con dH 2 O prima della filtrazione.
    5. Preparare medio melanociti completa. Combinare il 50% medio Neurobasal, il 30% DMEM bassa di glucosio, e il 20% MCDB201. Per questo componente aggiuntivo: 0,8% ITS +, 250 Nm L-glutammina, 100 micron Acido ascorbico (L-AA), 50 ng / ml tossina colerica, 50 ng / ml SCF, 0,05 micron desametasone, 100 nM EDN3, 4 ng / FGF2 ml . filtro sterile quindi aggiungere i reagenti rimanenti: 2% B27 supplemento, 25 ng / ml BMP4, 3 micron CHIR99021, 500 micron cAMP.
  2. Rivestimento di cultura Piatti
    1. Effettuare rivestimento utilizzando proteine ​​gelatinosa come Matrigel. All'apertura, aliquota e congelare Matrigel in 1 ml parti per evitare il congelamento ripetitivo disgelo cycles. Scongelare e risospendere un 1 ml un'aliquota congelato con 19 ml DMEM / F12. Tavola 5 ml su un piatto 10 cm. Incubare i piatti per 1 ora a RT. Aspirare la proteina gelatinosa immediatamente prima placcatura le cellule e lavare con DMEM / F12.
    2. Effettuare il rivestimento utilizzando Poli-L ornitina hydrobromide / mouse laminina-I / fibronectina (PO / Lam / FN). piatto Cappotto con PBS contenente 15 mg / ml Poly-L ornitina bromidrato. Incubare O / N a 37 ° C in un incubatore umidificato. Aspirare la soluzione e lavare le piastre con PBS per tre volte prima del rivestimento con PBS contenente 1 mg / ml di mouse laminina-I e 2 mg / ml fibronectina. Incubare le stoviglie O / N a 37 ° C in un incubatore umidificato.
      1. Prima di placcatura cellule, aspirare la soluzione e lasciare le piastre asciugare completamente senza coperchio nella cappa coltura tissutale. Lasciare le piastre ad asciugare per circa 10-15 min.
        Nota: I piatti sono asciutto e pronto per la placcatura cella quando strutture cristalline affiorano ad occhio. il plates possono essere mantenuti con PBS contenente LAM / FN in incubatrice per due settimane, fino a quando il liquido non evapori. Le piastre possono essere conservati essiccati a temperatura ambiente per qualche ora.
  3. Manutenzione di hPSCs
    Nota: hPSCs sono mantenuti sul 0,1% di gelatina e mouse mitoticamente inattivato fibroblasti embrionali (MEF) in hESC-media. Le cellule devono essere divisi ogni 6-8 giorni.
    1. Coat un piatto 10 centimetri con 0,1% di gelatina in PBS a temperatura ambiente per 5 min.
    2. Scongelare MEF congelati rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C.
    3. Aspirare la gelatina e piastra le cellule. MEF piastra a una densità di ~ 50.000 cellule / cm 2 in DMEM / 10% FBS. Incubare MEF a 37 ° CO / N prima di aggiungere hPSCs.
    4. Aspirare il% FBS DMEM / 10 dalla piastra MEF preparato, lavare piatto con PBS e aggiungere 10 ml di hESC-media con hPSCs. Passaggio le hPSCs in un rapporto di 1: 5/10 seconda densità prima passaging.
      Nota: Se i hPSCs vengono scongelati o diversi passaggi come singole cellule, supcomplemento con 10 mM Y-27632 dicloridrato (Rocki) fino al primo passaggio.
    5. Nutrire le cellule quotidianamente con fresco 10 ml di hESC-media.
    6. Prima di iniziare una differenziazione rimuovere eventuali colonie pluripotenti che sembrano contenere cellule differenziate, bordi irregolari, o centri trasparenti 28. Meccanicamente rimuovere e aspirare le colonie irregolari con una pipetta sotto una cappa a flusso laminare con un microscopio da dissezione.

2. placcatura di hPSCs per la differenziazione

Nota: le condizioni di differenziazione sono descritti per 10 piatti cm.

  1. Preparare 10 cm piatti Matrigel prima di iniziare la differenziazione come descritto al punto 1.3.1.
  2. Quando placcatura hPSCs per una differenziazione iniziano con un piatto di hPSCs ad una densità pronto per il passaggio (~ 80% confluenti) aspirare il hESC-media, lavare con PBS e aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA alle cellule.
  3. Agitare vigorosamente il horizontall piattoy per 2 minuti, mentre la visualizzazione al microscopio fino a quando il MEF sollevare come singole cellule. Le colonie HPSC devono rimanere attaccati come colonie.
  4. Aspirare il tripsina dopo i MEF hanno sollevato, ma prima che le colonie hPSCs staccano.
  5. Aggiungere 10 ml di hESC-mezzo contenente 10 mM Y-27632 dicloridrato alla piastra e staccare le cellule pipettando su e giù per le colonie.
  6. Aspirare la soluzione Matrigel dal 10 centimetri piatto preparato al punto 2.1 e lavare con DMEM / F12 per eliminare grumi. Piastra le hPSCs in un rapporto 1: 2 sulla piastra Matrigel. Aggiungere hESC-mezzo contenente 10 mM Y-27632 dicloridrato fino a 10 ml. Incubare a 37 ° CO / N.
    Nota: Questo rivestimento dovrebbe tradursi in circa 100.000 cellule / cm 2.

3. Induzione di differenziazione neurale

Nota: La differenziazione deve essere iniziata (giorno 0) quando le hPSCs sono 80% confluenti. Le cellule possono essere alimentati quotidianamente con hESC-mediumcontenente 10 mM Y-27632 dicloridrato fino all'inizio della differenziazione.

  1. Il giorno 0 e 1 giorno, nutrire le cellule con 10 ml di terreno KSR-differenziazione contenente 100 nM LDN193189 e 10 micron SB431542.
  2. Il giorno 2, nutrire le cellule con 10 ml di terreno KSR-differenziazione contenente 100 nM LDN193189, 10 micron SB431542 e 3 micron CHIR99021.
  3. Il giorno 3, nutrire le cellule con 10 ml di terreno KSR-differenziazione contenente 10 mM SB431542 e 3 micron CHIR99021.
  4. Nei giorni 4 e 5 nutrire le cellule con 15 ml di 75% medio KSR-differenziazione e il 25% di media N2-differenziazione contenente 3 micron CHIR99021.
    Nota: non essere allarmato per vedere una grande quantità di morte cellulare in termini di cellule galleggianti. Questo è normale e prevedibile.
  5. Nei giorni 6 e 7 di alimentazione delle cellule con 15 ml di 50% medio KSR-differenziazione e il 50% di media N2-differenziazione entrambi contenenti 3 micron CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.
  6. Nei giorni 8e 9 nutrire le cellule con 20 ml di 25% medio KSR-differenziazione e il 75% di media N2-differenziazione entrambi contenenti 3 micron CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.
  7. Nei giorni 9 e 10 preparare piatti PO / Lam / FN, come indicato al punto 1.2.2 per ri-placcatura delle cellule il giorno 11.
  8. Il giorno 10 celle di alimentazione con 20 ml di terreno N2-differenziazione contenente 3 micron CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, e 100 nM EDN3.

4. replating in gocce per NC Specification

  1. Il giorno 11 aspirato Lam / FN dal Po / LAM / piastre preparate FN e asciugare completamente.
  2. Rimuovere media a partire dal giorno 11 cellule, lavare con PBS e aggiungere la soluzione di distacco delle cellule 4 ml come Accutase per 10 cm piatto. Incubare per 25 minuti a 37 ° C.
  3. Aggiungere 5 ml di terreno completo Melanocita al piatto e risospendere le cellule pipettando manualmente su e giù con una pipetta 10 ml fino a quando tutte le celle hanno tolto la piastra. Trasferire la sospensione in una provetta da 15 ml.
  4. Gira lacellule scorrimento per 5 minuti a 200 xg e risospendere le cellule a 2 x 10 6 cellule per ml in mezzo completo Melanocyte. Contare le cellule utilizzando l'esclusione blu trypan su un emocitometro o tecnica equivalente.
  5. goccioline piastra 10 microlitri vicine tra loro (senza toccarle) sulle secche PO / Lam / FN 10 cm piatti. Se la piastra è stata sufficientemente asciugato, le goccioline dovrebbero essere ben bordi definiti e non correre.
    Nota: Questo crea un ambiente locale ad alta densità per le cellule, il che è importante quando replating cellule, mantenendo camera entro il piatto per l'espansione.
  6. Lasciare le goccioline riposare a temperatura ambiente per 10-20 minuti per consentire alle cellule di aderire, poi lentamente (per non disturbare le cellule attaccate) aggiungere 10 ml di terreno pieno melanociti. Spostare piatto per l'incubatore.

5. Espansione melanocita Progenitori

  1. Continuare l'alimentazione con il mezzo Melanocyte completa ogni 2 o 3 giorni.
    Nota: Pigmentazione dovrebbe iniziare ad essere visibile well'ambito gruppi di cellule dalla fine della prima settimana e diventare molto chiaro dalla seconda settimana. Osservando la lastra su uno sfondo bianco, quale un foglio di carta di discernere questi primi piccoli ammassi oscuri. Le cellule saranno diventano progressivamente più pigmentata nel tempo, fino a quando l'intera piastra è uniformemente pigmentata (vedere Figura 2B).
  2. cellule Passage una volta a settimana con un rapporto di circa 1: 6 (placcatura come gocce non è più necessario in questa fase). Utilizzare Accutase dissociare le cellule e lavare due volte con il mezzo Neurobasal pianura prima di ri-placcatura in media completa melanociti. Mantenere le cellule su PO / LAM / piastre FN.
    Nota: Abbiamo scoperto che il medium completa Melanocyte è più adatto per il mantenimento e l'espansione hESC e melanociti iPSC-derivati. Tuttavia, le cellule possono essere coltivate in terreno brevemente M254 disponibile in commercio ma i media semplificato aumenta il rischio di cellule morenti e sollevamento dalla piastra.

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Risultati

Questo protocollo fornisce un metodo per derivare completamente pigmentate, melanociti adulte hPSCs in un alimentatore-libera, economicamente efficiente e riproducibile modo in vitro. In contrasto con il precedentemente stabilito Fang et al. Protocollo per melanociti HPSC-derivati, il protocollo descritto non richiede terreno condizionato e diminuisce il tempo richiesto. Il protocollo Fang et al. Utilizzato mezzo condizionato da una linea di cellule murine Wnt3...

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Discussione

Per la differenziazione di successo dei melanociti da hPSCs i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Innanzitutto, è essenziale lavorare in condizioni di coltura sterili in ogni momento. Inoltre, è importante iniziare con pluripotenti, hPSCs completamente indifferenziate; se la popolazione di partenza contiene cellule differenziate del rendimento invariabilmente cadere come gli agenti inquinanti non possono essere indirizzate verso i melanociti e può anche distruggere ulteriormente le celle cor...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi in conflitto di rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio per i ricercatori di melanoma dal Joanna M. Nicolay Foundation e dal National Institutes of Health sotto Ruth L. Kirschstein Nazionale Premio Research Service F31. Questo lavoro è stato ulteriormente supportato attraverso sovvenzioni dal NYSTEM e l'iniziativa di cellule staminali Tri-istituzionale (Starr Foundation).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
apo transferrina umanaSigmaT1147
Acido ascorbico (L-AA)SigmaA4034100 mM
B27 (integratore B27)Invitrogen17504044
β-MercaptoetanoloGibco-Life Technologies21985-02310 mg/ml
BMP4R& D Systems314-bp
CHIR99021Tocris-R& D Systems44236 mM
Tossina coleraSigmaC805250 mg/ml
cAMP (AMP ciclico)SigmaD0627100 mM
DesametasoneSigmaD2915-100MG50 μ M
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco-Life Technologies11985-092
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12Gibco-Life Technologies1133--032
DMEM/F12 polvereInvitrogen12500-096
EDN3 (Endotelina-3, umana)American Peptide Company88-5-10B100 μ M
FibronectinaBD Biosciences356008200 μ g/ml
di gelatina (PBS senza Mg/Ca)in casa0,1% in PBS
GlucosioSigmaG7021
Insulina umanaSigmaI2643
ITS+ Universal Culture Supplement Premix BD Biosciences354352
KSR (sostituzione del siero knockout)Gibco-Life Technologies10828-028
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
L-glutamminaGibco-Life Technologies25030-081
LDN193189Stemgent04-0074100 mM
DMEM a basso contenuto di glucosioInvitrogen11885-084
Matrice MatrigelBD Biosciences354234Dissolvenza 1:20 in DMEM/F12
MCDB201 MediumSigmaM6770
MEM soluzione minima di aminoacidi essenzialiGibco-Life Technologies11140-080
Fibroblasti embrionali di topo (7 milioni di cellule/fiala)GlobalStemGSC-8105M
Laminina-I di topoR& D Systems3400-010-011 mg/ml
Mezzo neurobasaleInvitrogen21103049
Penicilina/StreptomicinaGibco-Life Technologies15140-12210.000 U/ml
Poly-L Omithin bromidratoSigmaP365515 mg/ml 
ProgesteroneSigmaP87830,032 g in 100 ml 100% etanolo
Putrescina dicloridratoSigmaP5780
FGF2 (FGF umano ricombinante basico)R& D Systems233-FB-001MG/CF10 mg/ml
SB431542Tocris-R& D Systems181410 mM
SeleniteSigmaS5261
Bicarbonato di sodioSigmaS5761
SCF (Fattore di cellule staminali, umano ricombinante) Peprotech Inc.300-0750 μ g/ml
TYRP1 (G-17) AnticorpoSanta Cruz104431:200
TYRP2 AnticorpoAbcam740731:200
Tripsina-EDTA (0,05%)Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 dicloridratoTocris-R& D Systems125410 mM

Riferimenti

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