È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Coltivare cellule primarie epiteliali nasali da bambini e riprogrammare in cellule staminali pluripotenti indotte

11K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/53814

⸱

10 marzo 2016

 ,  ,  ,  , 
1Pyrosequencing Core, Cincinnati Children's Hospital, 2Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital, 3Division of Pulmonary Medicine, Seattle Children's Hospital, 4Division of Asthma Research, Cincinnati Children's Hospital

In questo articolo

Sommario

Questa pubblicazione dimostra metodi per il campionamento e la coltura di successo della mucosa epiteliale nasale dai bambini e per la riprogrammazione di queste cellule in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC).

Abstract

Le cellule epiteliali nasali (NEC) sono la parte delle vie aeree che risponde agli inquinanti atmosferici e sono le prime cellule infettate da virus respiratori. Sono anche coinvolti in molte malattie delle vie aeree attraverso la loro risposta immunitaria innata e l'interazione con le cellule stromali immunitarie e delle vie aeree. I NEC sono di particolare interesse per gli studi sui bambini grazie alla loro accessibilità durante le visite cliniche. Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) sono state generate da diversi tipi di cellule e sono un potente strumento per modellare lo sviluppo umano e la malattia, nonché per le loro potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa. Questo è il primo protocollo a delineare metodi per la generazione di successo di iPSC da NEC derivate da partecipanti pediatrici per scopi di ricerca. Descrive come ottenere cellule epiteliali nasali dai bambini, come generare colture primarie di NEC da questi campioni e come riprogrammare le NEC primarie in iPSC ben caratterizzate. I campioni di mucosa nasale sono utili negli studi epidemiologici relativi agli effetti dell'inquinamento atmosferico nei bambini e forniscono uno strumento importante per lo studio delle malattie delle vie aeree. Le cellule nasali primarie e le iPSC da esse derivate possono essere uno strumento per fornire materiale illimitato per la ricerca specifica del paziente in diverse aree della biologia epiteliale delle vie aeree, compresa la ricerca sull'asma e sulla BPCO.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti indotte da campioni umani (hiPSCs) sono una tecnologia in rapido sviluppo della ricerca sulle cellule staminali. Essi offrono un'alternativa alle cellule staminali embrionali (hESC) ricerca con molti meno inconvenienti etici e morali 1,2. Anche se non sono identici a epigeneticamente hESC 3-5, hiPSCs offrono un modo unico per modello di sviluppo e di malattia fenotipi, e possono essere derivati ​​da tessuti rilevanti per lo stato di malattia 5-8. Nuovi metodi di hiPSCs elettrogeni sono costantemente in fase di studio per identificare i tipi di cellule ottimali per cominciare, come un modo per preparare iPSCs GMP qualità adatte per il trapianto, e anche per aumentare la tempestività e l'efficienza del processo di riprogrammazione 6,9-11.

Cellule epiteliali delle vie aeree sono fondamentali per lo sviluppo di infiammazione allergica 12, e l'epitelio è una delle principali cause di reazioni allergiche e rimodellamento delle vie aeree attraverso l'interazione con immunE e stromali cellule. L'epitelio delle vie aeree gioca un ruolo essenziale nella genesi e la persistenza di malattie polmonari come asma. Tuttavia, più bassa delle vie aeree cellule epiteliali sono difficili da ottenere in un ambiente clinico, soprattutto da pazienti sani di controllo e bambini. I dati provenienti da diversi studi supportano la premessa che le cellule epiteliali da mucose nasali sono un proxy valido e pratico per vie aeree inferiori cellule epiteliali 13-20, soprattutto quando si studiano le risposte alle sostanze inquinanti e allergeni. La mucosa nasale si compone di oltre il 90% di cellule epiteliali ciliate delle vie aeree e di campionamento queste cellule epiteliali nasali (NEC) può essere facilmente effettuata in bambini di età quattro o cinque, in quanto è meno invasivo rispetto ad altre tecniche di campionamento di cellule / tessuti ed è associato con un rischio minimo di effetti collaterali come l'infezione 20-23. Esso offre un modo veloce e semplice per assaggiare sia i bambini sani e malati senza lunghe, inutili, e spesso doloroso Operazi broncoscopiares che necessitano di sedazione. Studi precedenti hanno dimostrato che i sottotipi di malattia correlati alla gravità dell'asma possono distinguere sia nella mucosa nasale e campioni di cellule bronchiali prelevati da bambini asmatici, e l'espressione genica tra i due tipi di tessuto era simile in circa il 90% dei geni non onnipresenti 22 , 24. Come fonte per iPSCs, NEC offrono vantaggi rispetto ad altri tipi di cellule utilizzate di frequente. I fibroblasti sono spesso utilizzati per la generazione COPSI, ma anche se queste cellule possono essere facilmente coltivate da una biopsia cutanea, questo processo richiede tipicamente anestesia locale, una incisione e suture, ed è associata con qualche rischio di infezione. Pertanto, ottenendo consenso informato dai pazienti per questo tipo di biopsia può essere difficile 25. Una alternativa al fibroblasti è cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Tuttavia, può essere difficile ottenere sangue sufficiente per la generazione COPSI da pazienti pediatrici. In aggiunta, ci sono limitazioni di ap vallecomplicanze di fibroblasti e cellule del sangue iPSCs derivate, in particolare la loro capacità di differenziazione di alcuni tipi di cellule 5,26. Pertanto, data la relativa accessibilità e il basso rischio di effetti collaterali a seguito della loro raccolta, NEC rappresentano una fonte di cellule ideale per la generazione iPSC da popolazioni pediatriche.

iPSCs hanno ricevuto molta attenzione recentemente come una piattaforma per lo studio dello sviluppo umano, la generazione di modelli di malattia romanzo, e come una potenziale fonte di cellule per le terapie personalizzate. Prima di tutto il potenziale di questa tecnologia può essere realizzato, le basi molecolari del processo di riprogrammazione hanno bisogno di essere chiariti, ma per ora questo protocollo e le procedure descritte nel potranno chiarire gli studi di ricerca focalizzati sulle esposizioni delle vie respiratorie, oltre a fornire una piattaforma per studiare gli effetti della medicina personalizzata che coinvolgono iPSCs.

Il lavoro di collaborazione di diversi laboratori ha portato alla generation di una tecnica efficace non solo per campionare la mucosa nasale, ma anche coltura NEC, e riprogrammare queste cellule per iPSCs 23. Questo articolo fornisce uno schema di un protocollo per il campionamento ottimale, coltura e condizioni di riprogrammazione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Il seguente protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana istituzioni.

1. Campionamento la mucosa nasale

NOTA: ottenere campioni da soggetti che sono liberi di segni di infezione virale delle vie respiratorie.

  1. Preparare un 15 ml fresca conica prima della visita partecipante e aggiungere 2 ml BEGM (epiteliali bronchiali Media cellulare crescita) più 20 ml sterile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
  2. spazzola di citologia aperto poco prima di prendere il campione, ed essere sicuri di mantenere il pennello sterile e non toccare a tutte le superfici oltre alle superfici nasali.
  3. Chiedi partecipante a stare fermo e inclinare la testa verso soffitto. Avere più piccolo o più figli irrequieti siedono sulle loro mani e / o sdraiati per evitare di schiacciare la spazzola via.
  4. Puntare pennello nella parte posteriore del naso dove il passaggio si restringe (Sembra un piccolo buco nero). Far scorrere la spazzola verso il basso e ruotare i polsi come il pennello viene rimosso dal Nostril.
  5. Mettere pennello in conica e immergere in BEGM. Tagliare pennello in eccesso e rimettere il tappo sul tubo. NON FARE VORTEX.
    NOTA: Se il partecipante è disposto, ottenere una seconda spazzola nello stesso modo ma nella seconda narice. Ottenere una spazzolatura di entrambe le narici si tradurrà in una maggiore probabilità che il campionamento avrà successo. Campionamento stessa narice può provocare sanguinamento e non sarà probabilmente migliorare il campione.
  6. I campioni più vicino a 37 ° C possibile durante il trasporto utilizzando un becher con acqua calda.

2. numero di celle e Cytospin

  1. Agitare delicatamente il pennello in BEGM e prendere 10 ml di campione per un conteggio di cellule utilizzando un emocitometro. Aggiungere 10 ml di una macchia live / morti e contare solo vivere cellule al microscopio.
  2. Introdurre 50 ml di campione e portare a 200 ml con PBS 1x. Aggiungi a imbuto cytospin attaccato al vetrino e far girare a 300 giri al minuto per 2 minuti. Lasciate scorrere secca O / N e macchia scivolo followinle istruzioni del produttore g. Lasciare asciugare O / N, preferibilmente al buio.
  3. Far scorrere macchia con Hema 3 Stain
    1. Trasferire ogni soluzione (Hema fissativo, la luce blu; Hema 3 Soluzione, rosa; e Hema 3 Solution II, blu scuro) in un piatto colorazione; Mantenere coperto quando non in uso. Inserire diapositive in slitta barca colorazione
    2. Immergere i vetrini continuamente in fissativo per 30 secondi, quindi permettono in eccesso di defluire. Dip scorre continuamente in Solution I per 30 secondi, quindi lasciare in eccesso di defluire. Dip scorre continuamente in Solution II per 30 secondi, quindi lasciare in eccesso di defluire
    3. Risciacquare con acqua deionizzata fino a quando l'acqua è pulita. Lasciare asciugare O / N, preferibilmente al buio
  4. Guardate slitta sotto le cellule al microscopio e conteggio, determinare la percentuale di cellule epiteliali. Dovrebbe essere del 90% o superiore, se il campionamento è buono.

3. Cellule Seeding

NOTA: Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare in una cultura adeguata e certificata dei tessutiCappuccio con tecnica sterile.

  1. Piastre cappotto con Bovine Collagen Dermal (BDC), digitare 1. Aggiungere 0,5 ml di 3 mg / ml BDC diluiti in 49,5 ml di PBS 1x. Preparare meno se verranno utilizzati solo pochi piatti. Coat un pallone T25 con 2 ml BDC e incubare sterile cappa O / N oa 37 ° C per 2 ore, se necessario.
  2. Dopo l'incubazione, aspirare il liquido rimanente. Esporre fiaschi a luce UV per 30 minuti in cappa sterile. palloni Conservare fino a un mese a 4 ° C, ma portarli a RT o 37 ° C prima della semina cellule.
  3. Mantenere pennello e le cellule in BEGM a 37 ° C fino al momento di seminare. Delicatamente pennello swish all'interno conica, ma non fare vortice.
    1. Tavola 7 x 10 5 cellule in un pallone T25. Se c'è meno, utilizzare un contenitore più piccolo, come un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Questa piastra dimensioni richiede circa 3 x 10 5 cellule.
      NOTA: Se non ci sono questo molte cellule, non è consigliabile per continuare.
  4. Sotto una cappa sterile, prendere pennello di tubo e gente ruotare pennello sulla superficie del pallone rivestito, facendo attenzione a non graffiare il rivestimento. Scartare pennello in un contenitore adeguato rischio biologico.
  5. Lentamente pipettare le cellule rimanenti BEGM fuori dalla conica e nel pallone T25. Osservare le cellule sotto il microscopio. Verrà osservato un numero di cellule galleggianti e ci possono essere alcuni detriti dal naso, che è accettabile in questa fase (Figura 3A).

Cultura 4. cellulare

  1. Dopo la semina delle cellule, far loro accontentarsi di 48 ore senza interruzioni (Figura 3). Dopo 48 ore, lentamente e delicatamente con 2 ml di caldo BEGM e 20 ml sterile penicillina / streptomicina / Fungizone (P / S / F).
    NOTA: NON aspirare l'originale 2 ml di media.
  2. Al 4 ° giorno dopo la semina, aspirare accuratamente tutto il liquido, e sostituirlo con 4 ml freschi, riscaldati BEGM più 1x Pen / Strep (Fungizone non è più necessario). Modificare i media ogni due giorni e valutare le cellule per attaccaremento, la crescita, e la confluenza. Quando le cellule raggiungono ~ 80% di confluenza, di solito in 2-3 settimane, sono pronti per essere diversi passaggi.
  3. Un pallone T25 (circa 2,5 x 10 6 cellule quando confluenti) possono essere diversi passaggi in tre palloni T25 o di un pallone T75. Dopo il primo passaggio, le cellule devono essere robusti e sani, raggiungendo confluenza circa ogni tre giorni.

5. Le cellule passaging

  1. Aspirare delicatamente il supporto dal piatto. Aggiungere 1 ml di soluzione 0,05% tripsina per bombola T25 alla piastra e posto in incubatrice per circa 4 min, o fino a quando le cellule si staccano dal piatto. Controllare il livello di distacco delle cellule ogni 2 minuti e non lasciare tripsina su più di 10 min.
  2. Aggiungere 5 ml di tripsina soluzione neutralizzante (TNS), o un supporto siero contenente per neutralizzare l'enzima. Rimuovere tutto il liquido e le cellule dal pallone e mettere in un tubo da 15 ml.
  3. Centrifugare a 200 xg (accelerazione 0 decelerazione 0) per 5 minuti per ottenere un pellet di cellule. Aspirare SupernaTant cellule e risospendere in BEGM + P / S nel volume richiesto per i nuovi palloni (4 ml per un pallone T25, 10 ml per un pallone T75)
  4. Eseguire conteggio delle cellule con una macchia Live / Dead come descritto sopra (2.1). Aggiungere la quantità appropriata di BEGM e cellule per i fiaschi rivestiti e tornare alla incubatore. Mantenere come dettagliato sopra o cryopreserve a congelamento medio (70% BEGM, 20% FBS e 10% DMSO) ad una concentrazione di 0,5-2 x 10 6 cellule per ml.

6. Riprogrammazione a iPSCs

NOTA: Prima di generare iPSCs, assicurare il rispetto di tutte le prescrizioni istituzionali che regolano la generazione e l'uso di iPSCs umani. tecnica sterile è particolarmente importante per le culture IPSC, come terreno di coltura non di routine contiene antibiotici. E 'fondamentale che CNE appaiono in buona salute e sono robusto proliferativa per la riprogrammazione di successo.

  1. Piastra 5 x 10 5 CNE per pozzetto di una piastra di coltura tissutale 6 bene. Dopo 24 ore, aggiungere polibrenea BEGM ad una concentrazione finale di 8 mg / ml e trasdurre NEC con l'aggiunta di particelle lentivirali che esprimono Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc ai media. Lo scopo di raggiungere una molteplicità di infezione (MOI) di ~ 5 27.
    1. Per la determinazione del MOI, preparare diluizioni seriali del magazzino concentrato-lentivirali e trasdurre cellule HT1080 con queste diluizioni. Dopo la prima inequivocabile individuazione di espressione dTomato nelle cellule HT1080, calcolare il numero di "unità di trasduzione / ml" segnando il numero di cellule dTomato-positivo / piccoli grumi di cellule in ogni diluizione.
      NOTA: in genere, ci saranno le diluizioni che sono troppo alti (tutto è dTomato positivo) e troppo bassa (nessuno o solo un paio di cellule positive).
    2. Eseguire punteggio da diluire che viene identificato cellule positive discreti / piccoli grumi di cellule. Determinare il titolo correggendo il numero di trasduzione unità / ml con il fattore di diluizione appropriata. MOI è allora il rapporto del numerodi trasdotte cellule al numero di particelle virali 27.
      NOTA: Ogni dTomato cellulare positiva / piccolo ciuffo si presume che derivare da una singola particella di virus.
  2. Circa 3 ore post-trasduzione, rimuovere il supporto e sostituirlo con fresco BEGM. Eliminare i media lentivirali contenenti utilizzando procedure istituzionalmente approvati. Rientro CNE trasdotte per l'incubatore per 3 giorni.
  3. Il giorno 3, sostituire il supporto con fresco BEGM, e poi incubare per altri 3 giorni. Aspirare speso media, lavare le cellule con PBS 1x e aggiungere 1 ml di soluzione 0,05% tripsina al pozzo. cellule Passage con tripsina come scritto in precedenza (sezione 5). Con attenzione aspirare le cellule surnatante e risospendere in 4 ml BEGM + P / S. Le celle possono essere diversi passaggi di un nuovo pozzo di una piastra 6 e rivestito con BDC, o aggiunti alle culture MEF, se pronto (vedi punto successivo).
  4. Preparare MEF piastre rivestite. Il giorno 4 aggiungere soluzione di gelatina 0,1% (1 ml / pozzetto) a 2 pozzetti di una 6 pozzo (per eseguire +/- Thiazovivin (SPT) vedi punto 6.6). Nella successivagiorno, scongelare una fiala di MEF inattivati ​​28.
  5. Mettere MEF in 10 ml di media MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% DFCS). Spin a 200 g per 5 minuti per far sedimentare. Risospendere in mezzi MEF. Aspirare la gelatina da 6 pozzetti e aggiungere 1,87 x 10 5 MEF per pozzetto della piastra 6 bene la gelatina rivestite. Incubare O / N a 37 ° C, o per un minimo di 24 ore.
  6. Trasferire 2 ml di BEGM contenenti trasdotte cellule per pozzetto in 2 pozzetti di una piastra 6 bene precedentemente ricoperto e incubare O / N. Il giorno successivo, sostituire BEGM con 2,5 ml per pozzetto di mezzi hESC standard contenenti 4 ng / ml fattore di crescita dei fibroblasti di base. Nutrire le cellule con i media hESC fresca +/- SPT giorno per 10 giorni
    NOTA: È possibile aggiungere un cocktail di piccole molecole (SB431542, PD0325901, e Thiazovivin () cocktail SPT) per migliorare l'efficienza e la cinetica di riprogrammazione per NEC 23.
  7. Dopo dieci giorni, continuare ad alimentare ogni giorno con hESC media senza SPT. Nutrire culture ogni giorno fino colonie hESC-like(Figura 5A, P0 colonia). Identificare le colonie che ospitano iPSCs putativi per la loro alta nucleo: rapporto citoplasma e nucleoli prominenti.
  8. Manualmente accise e trasferire le colonie con morfologia hESC simil-pozzetti per la cultura e l'espansione come linee separate in un sistema di libero alimentatore. colonie asportato devono adattarsi rapidamente a queste condizioni.
    1. Dopo colonie placcatura asportato queste linee IPSC putativi discrete sono ormai considerati passaggio 1 (p1). culture giornaliera di mangime con mTeSR1. Passage ed espandere le linee IPSC utilizzando le procedure standard. Potrebbero essere necessari diversi giorni a una settimana per le colonie P1 per raggiungere la dimensione in cui devono essere diversi passaggi.

7. Mantenere iPSCs in cultura

  1. Alimentare e valutare le culture quotidiana. Manualmente aree accise esibendo differenziazione palese raschiando con una pipetta di vetro sterile o micro punta della pipetta. Cambiare media dopo la raccolta quotidiana.
  2. cellule Passage dopo approssitamente ogni quattro giorni: Gently mezzi aspirato, aggiungere 1 ml dispasi calda (1 mg / ml) per pozzetto di un 6-pozzetti (metà del volume di alimentazione), poi incubare a 37 ° C per circa 4 minuti. I bordi delle colonie cominceranno a sollevare, che appare come un contorno bianco intorno alla colonia. Delicatamente aspirare il dispasi e lavare 3x con riscaldato DMEM / F12.
  3. Aggiungere 2 ml mTeSR1 e utilizzare un sollevatore cella per sollevare le colonie dalla piastra. Utilizzare una pipetta da 5 ml sierologico o P1000 micropipetta per triturare delicatamente le cellule fino a quando le colonie sono suddivisi in gruppi più piccoli.
    1. Evitare di produrre molto piccoli gruppi o singole cellule, come la sopravvivenza e la successiva proliferazione saranno sub-ottimale. Quando le colonie ri-placcatura, un 1: 4 a 1: 6 spaccatura manterrà densità ottimale colonia. Rimuovere delicatamente colonie e dei media dal piatto e aggiungere nuovi pozzi Matrigel rivestite.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La parte iniziale del naso, chiamato il vestibolo nasale, è l'area circondata da cartilagine 29. La spazzola deve andare liscio passato questa zona del naso, oltre la valvola nasale (ostium internum, o "buco nero" visto sul retro della nare), e il campione è ottenuta dalla turbinato inferiore (Figura 1). I turbinati nasali sono strutture ossee che aumentano la superficie del naso 29, che li rende un luogo ideale per il campionamento. L...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Cellule epiteliali nasali (NEC) sono una piattaforma accessibile per studiare le malattie delle vie respiratorie, e NEC-iPSCs offrono un viale emozionante di esplorare lo sviluppo della malattia, il trattamento e la terapia 1,31,32. NEC può essere facilmente ottenuto senza procedure nocive stressanti o potenzialmente 6,23. Nella nostra esperienza, il campionamento della mucosa nasale come descritto in questo protocollo appare meno stressante e meglio percepita di raccolta sangue per i bambini. Pert...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero riconoscere il pluripotenti cellule staminali strumento e la Confocale Imaging Nucleo presso l'Ospedale dei bambini di Cincinnati. Questo lavoro è stato sostenuto da R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) e 2U19AI70235 (GKKH).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
15 ml conicoFisher Scientific14-959-49DProtocollo Passaggio 1.1.
Protocollo BEGMLonzaCC-3170Passaggio 1.1.
Penn/Strep/FungicideLife Technologies15240-062Protocollo Passaggio 1.1.
Penn/StrepLife Technologies15140-122Protocollo Passaggio 4.a.
pennello citologico cytosoftFisher Scientific22-263-357Protocollo Passaggio 1.2.
tripano bluFisher ScientificMT-25-900-CIProtocollo Passaggio 2.1.
ematocitometroFisher Scientific02-671-54Protocollo Passaggio 2.1.
PBSFisher ScientificBP2438-4Protocollo Passaggio 2.2.
Clip a imbuto citologicoFisher Scientific10-357Protocollo Passaggio 2.2.
Citospin imbutoScientific23-640-320Protocollo Passaggio 2.2.
Cytospin 4Fisher Scientific A78300003Protocollo Passaggio 2.2.
vetrino vuotoFisher ScientificS95933Protocollo Passaggio 2.2.
kit di colorazione hema 3Fisher Scientific22-122-911Protocollo Passaggio 2.2.
Colagen dermico bovino, tipo 1Life TechnologiesA1064401Protocollo Passaggio 3.2.
Pallone T25Fisher Scientific08-772-45Protocollo Passaggio 3.3.
Protocollo TrypsinLonzaCC-5012Passaggio 5.2.
Soluzione neutralizzante della tripsinaLonzaCC-5002Protocollo Passaggio 5.2.
Siero fetale bovino (FBS), sterilizzato a caldo a 65 ° grado; C per 30 minutiSigma-AldrichF2442Passaggio 5.5.
Dimetilsolfossido Hybri-Max, filtrato sterile, BioReagent, adatto per ibridomi, ≥ 99,7%Protocollo Sigma-AldrichD2650Passaggio 5.5.
lentivirus policistonico*ad es. MilliporeSCR511Protocollo Passaggio 6.4.
Viene elencata una fonte commerciale di vettore di riprogrammazione. Utilizziamo abitualmente il plasmide 4-in-1 riportato da Voelkel et al (PMID: 20385817) per generare internamente lentivirus di riprogrammazione policistronica pseudotipizzato VSV-G. Questo plasmide può essere ottenuto contattando 
polybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220Protocollo Passaggio 6.4.
CF1 MEF irradiatiGlobalStem Passaggio 6.4 del protocolloGSC-6301G
Supporti hESCVedere la ricetta inclusa nel protocolloPassaggio del protocollo 6.11.
SB431542Protocollo Stemgent04-0010Passaggio 6.11.
PD0325901Stemgent04-0006Protocollo Passaggio 6.11.
TiazovivinaStemgent04-0017Protocollo Passaggio 6.11.
Protocollo MatrigelBD Biosciences354277Passaggio 6.13.
Piastra di corning, 6 pozzettiFisher Scientific08-772-1BProtocollo Passaggio 6.13.
Protocollo mTeSR1StemCell5850Passaggio 6.13.
Pallone filtrante monouso da 250 ml (0,22 & micro; m)FisherSCGP-U02-RE 
dispaseStemCell7923Protocollo Passaggio 7.3.
DMEM/F12Life Technologies11320-033Protocollo Passaggio 7.3.
sollevatore cellulareFisher Scientific08-100-240Protocollo Passaggio 7.4.
Fase6.11.
i componenti devono essere miscelati e quindi sterilizzati con filtro. I supporti possono essere mantenuti a 4 ° C per un massimo di due settimane. Quando si riscaldano i fluidi, non lasciare a 37 gradi C più lungo di 15 min
DMEM-F12 50/50 mediaInvitrogen  11330-032Concentrazione finale
Siero sostitutivo KO (KO-SR)Invitrogen10828-0280,2
200 mM L-glutamminaInvitrogen25030-0811 mM
55 mM ß-mercaptoetanoloInvitrogen21985-0230,1 mM
100x aminoacidi non essenzialiInvitrogen11140-0501x
2 &; g/ml Fattore di crescita basico dei fibroblasti (b-FGF)Invitrogen13256-0294 ng/ml
Fisher Protocollo . qualificato hESC

Riferimenti

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  2. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Guenther, M. G., et al. Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).
  5. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).
  6. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PloS one. 7 (8), e42855(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).
  10. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 322 (5903), 945-949 (2008).
  11. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).
  12. Kuperman, D. A., et al. Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).
  13. Braunstahl, G. J., et al. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).
  14. Compalati, E., et al. The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease. Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).
  15. Crimi, E., et al. Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis. Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).
  16. Djukanovic, R., et al. Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).
  17. Gaga, M., et al. Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).
  18. Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD. Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).
  19. Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. Upper and lower airways: similarities and differences. European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).
  20. Lopez-Guisa, J. M., et al. Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors. J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).
  21. Doi, A., et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts. Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).
  22. Poole, A., et al. Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease. J Allergy Clin Immunol. , (2014).
  23. Ji, H., et al. Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).
  24. Guajardo, J. R., et al. Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma. The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).
  25. Yamanaka, S. Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible. Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).
  26. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  27. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).
  28. Wicell. Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols. , (2003).
  29. Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium. Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).
  30. Allegrucci, C., Young, L. E. Differences between human embryonic stem cell lines. Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).
  31. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  32. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  33. Lai, P. S., et al. Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies. J Allergy Clin Immunol. , (2015).
  34. Shi, Y., et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).
  35. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature. 8 (5), 409-412 (2011).
  36. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  37. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  38. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
  39. Marchetto, M. C., et al. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. PloS one. 4 (9), e7076(2009).
  40. Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas. Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).
  41. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. 'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  42. Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).
  43. Jandial, R., Levy, M. L. Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory. World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).
  44. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  45. Ohi, Y., et al. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Coltura cellulare primariaTrasduzione lentiviraleProtocollo di riprogrammazioneCampionamento delle vie aeree pediatricheTerreno per hESCRivestimento con MEFEspansione delle colonieSistema feeder free
Coltivare cellule primarie epiteliali nasali da bambini e riprogrammare in cellule staminali pluripotenti indotte
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.