Questa pubblicazione dimostra metodi per il campionamento e la coltura di successo della mucosa epiteliale nasale dai bambini e per la riprogrammazione di queste cellule in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC).
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Articolo metodologico
Coltivare cellule primarie epiteliali nasali da bambini e riprogrammare in cellule staminali pluripotenti indotte
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule epiteliali nasali (NEC) sono la parte delle vie aeree che risponde agli inquinanti atmosferici e sono le prime cellule infettate da virus respiratori. Sono anche coinvolti in molte malattie delle vie aeree attraverso la loro risposta immunitaria innata e l'interazione con le cellule stromali immunitarie e delle vie aeree. I NEC sono di particolare interesse per gli studi sui bambini grazie alla loro accessibilità durante le visite cliniche. Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) sono state generate da diversi tipi di cellule e sono un potente strumento per modellare lo sviluppo umano e la malattia, nonché per le loro potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa. Questo è il primo protocollo a delineare metodi per la generazione di successo di iPSC da NEC derivate da partecipanti pediatrici per scopi di ricerca. Descrive come ottenere cellule epiteliali nasali dai bambini, come generare colture primarie di NEC da questi campioni e come riprogrammare le NEC primarie in iPSC ben caratterizzate. I campioni di mucosa nasale sono utili negli studi epidemiologici relativi agli effetti dell'inquinamento atmosferico nei bambini e forniscono uno strumento importante per lo studio delle malattie delle vie aeree. Le cellule nasali primarie e le iPSC da esse derivate possono essere uno strumento per fornire materiale illimitato per la ricerca specifica del paziente in diverse aree della biologia epiteliale delle vie aeree, compresa la ricerca sull'asma e sulla BPCO.
Introduzione
Le cellule staminali pluripotenti indotte da campioni umani (hiPSCs) sono una tecnologia in rapido sviluppo della ricerca sulle cellule staminali. Essi offrono un'alternativa alle cellule staminali embrionali (hESC) ricerca con molti meno inconvenienti etici e morali 1,2. Anche se non sono identici a epigeneticamente hESC 3-5, hiPSCs offrono un modo unico per modello di sviluppo e di malattia fenotipi, e possono essere derivati da tessuti rilevanti per lo stato di malattia 5-8. Nuovi metodi di hiPSCs elettrogeni sono costantemente in fase di studio per identificare i tipi di cellule ottimali per cominciare, come un modo per prep....
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Protocollo
Il seguente protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana istituzioni.
1. Campionamento la mucosa nasale
NOTA: ottenere campioni da soggetti che sono liberi di segni di infezione virale delle vie respiratorie.
- Preparare un 15 ml fresca conica prima della visita partecipante e aggiungere 2 ml BEGM (epiteliali bronchiali Media cellulare crescita) più 20 ml sterile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
- spazzola di citologia aperto poco prima di prendere il campione, ed essere sicuri di mantenere il pennello sterile e non toccare a tutte le superfici oltre alle su....
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Risultati
La parte iniziale del naso, chiamato il vestibolo nasale, è l'area circondata da cartilagine 29. La spazzola deve andare liscio passato questa zona del naso, oltre la valvola nasale (ostium internum, o "buco nero" visto sul retro della nare), e il campione è ottenuta dalla turbinato inferiore (Figura 1). I turbinati nasali sono strutture ossee che aumentano la superficie del naso 29, che li rende un luogo ideale per il campionamento. L.......
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Discussione
Cellule epiteliali nasali (NEC) sono una piattaforma accessibile per studiare le malattie delle vie respiratorie, e NEC-iPSCs offrono un viale emozionante di esplorare lo sviluppo della malattia, il trattamento e la terapia 1,31,32. NEC può essere facilmente ottenuto senza procedure nocive stressanti o potenzialmente 6,23. Nella nostra esperienza, il campionamento della mucosa nasale come descritto in questo protocollo appare meno stressante e meglio percepita di raccolta sangue per i bambini. Pert.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere il pluripotenti cellule staminali strumento e la Confocale Imaging Nucleo presso l'Ospedale dei bambini di Cincinnati. Questo lavoro è stato sostenuto da R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) e 2U19AI70235 (GKKH).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 15 ml conico | Fisher Scientific | 14-959-49D | Protocollo Passaggio 1.1. |
| Protocollo BEGM | Lonza | CC-3170 | Passaggio 1.1. |
| Penn/Strep/Fungicide | Life Technologies | 15240-062 | Protocollo Passaggio 1.1. |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Protocollo Passaggio 4.a. |
| pennello citologico cytosoft | Fisher Scientific | 22-263-357 | Protocollo Passaggio 1.2. |
| tripano blu | Fisher Scientific | MT-25-900-CI | Protocollo Passaggio 2.1. |
| ematocitometro | Fisher Scientific | 02-671-54 | Protocollo Passaggio 2.1. |
| PBS | Fisher Scientific | BP2438-4 | Protocollo Passaggio 2.2. |
| Clip a imbuto citologico | Fisher Scientific | 10-357 | Protocollo Passaggio 2.2. |
| Citospin imbuto | Scientific | 23-640-320 | Protocollo Passaggio 2.2. |
| Cytospin 4 | Fisher Scientific A78300003 | Protocollo Passaggio 2.2. | |
| vetrino vuoto | Fisher Scientific | S95933 | Protocollo Passaggio 2.2. |
| kit di colorazione hema 3 | Fisher Scientific | 22-122-911 | Protocollo Passaggio 2.2. |
| Colagen dermico bovino, tipo 1 | Life Technologies | A1064401 | Protocollo Passaggio 3.2. |
| Pallone T25 | Fisher Scientific | 08-772-45 | Protocollo Passaggio 3.3. |
| Protocollo Trypsin | Lonza | CC-5012 | Passaggio 5.2. |
| Soluzione neutralizzante della tripsina | Lonza | CC-5002 | Protocollo Passaggio 5.2. |
| Siero fetale bovino (FBS), sterilizzato a caldo a 65 ° grado; C per 30 minuti | Sigma-Aldrich | F2442 | Passaggio 5.5. |
| Dimetilsolfossido Hybri-Max, filtrato sterile, BioReagent, adatto per ibridomi, ≥ 99,7% | Protocollo Sigma-Aldrich | D2650 | Passaggio 5.5. |
| lentivirus policistonico* | ad es. Millipore | SCR511 | Protocollo Passaggio 6.4. Viene elencata una fonte commerciale di vettore di riprogrammazione. Utilizziamo abitualmente il plasmide 4-in-1 riportato da Voelkel et al (PMID: 20385817) per generare internamente lentivirus di riprogrammazione policistronica pseudotipizzato VSV-G. Questo plasmide può essere ottenuto contattando |
| polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | Protocollo Passaggio 6.4. |
| CF1 MEF irradiati | GlobalStem | Passaggio 6.4 del protocollo | GSC-6301G |
| Supporti hESC | Vedere la ricetta inclusa nel protocollo | Passaggio del protocollo 6.11. | |
| SB431542 | Protocollo Stemgent | 04-0010 | Passaggio 6.11. |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006 | Protocollo Passaggio 6.11. |
| Tiazovivina | Stemgent | 04-0017 | Protocollo Passaggio 6.11. |
| Protocollo Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Passaggio 6.13. |
| Piastra di corning, 6 pozzetti | Fisher Scientific | 08-772-1B | Protocollo Passaggio 6.13. |
| Protocollo mTeSR1 | StemCell | 5850 | Passaggio 6.13. |
| Pallone filtrante monouso da 250 ml (0,22 & micro; m) | Fisher | SCGP-U02-RE | |
| dispase | StemCell | 7923 | Protocollo Passaggio 7.3. |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-033 | Protocollo Passaggio 7.3. |
| sollevatore cellulare | Fisher Scientific | 08-100-240 | Protocollo Passaggio 7.4. |
| Fase | 6.11. i componenti devono essere miscelati e quindi sterilizzati con filtro. I supporti possono essere mantenuti a 4 ° C per un massimo di due settimane. Quando si riscaldano i fluidi, non lasciare a 37 gradi C più lungo di 15 min | ||
| DMEM-F12 50/50 media | Invitrogen | 11330-032 | Concentrazione finale |
| Siero sostitutivo KO (KO-SR) | Invitrogen | 10828-028 | 0,2 |
| 200 mM L-glutammina | Invitrogen | 25030-081 | 1 mM |
| 55 mM ß-mercaptoetanolo | Invitrogen | 21985-023 | 0,1 mM |
| 100x aminoacidi non essenziali | Invitrogen | 11140-050 | 1x |
| 2 &; g/ml Fattore di crescita basico dei fibroblasti (b-FGF) | Invitrogen | 13256-029 | 4 ng/ml |
Riferimenti
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. ....
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Ristampe e permessi
