Qui, viene presentata una procedura per attivare selettivamente una proteina neuronale con un breve impulso di luce codificando geneticamente un amminoacido innaturale foto-reattivo in una proteina neuronale bersaglio espressa in neuroni in coltura o in vivo.
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Articolo metodologico
Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fotostimolazione è un modo non invasivo per controllare gli eventi biologici con un'eccellente risoluzione spaziale e temporale. Sono necessari nuovi metodi per fotoregolare le proteine endogene espresse nel loro ambiente nativo. Qui, presentiamo un approccio per controllare otticamente la funzione di una proteina neuronale direttamente nei neuroni utilizzando un amminoacido innaturale (Uaa) geneticamente codificato. Utilizzando una coppia ortogonale tRNA/amminoacil-tRNA sintetasi per sopprimere il codone ambrato, un Uaa 4,5-dimetossi-2-nitrobenzil-cisteina (Cmn) foto-reattivo è incorporato site-specific nel poro di una proteina neuronale Kir2.1, un canale del potassio rettificante verso l'interno. L'ingombrante Cmn blocca fisicamente il poro del canale, rendendo Kir2.1 non conduttore. L'illuminazione della luce converte istantaneamente Cmn in un amminoacido naturale Cys più piccolo, attivando la funzione del canale Kir2.1. Esprimiamo questi canali del potassio (PIRK) a r ettificazioneverso l'interno nei neuroni primari dell'ippocampo di ratto e dimostriamo che l'attivazione alla luce di PIRK cessa l'attivazione neuronale a causa del deflusso di corrente K+ attraverso i canali Kir2.1 attivati. Utilizzando l'elettroporazione in utero, esprimiamo anche PIRK nella neocorteccia embrionale del topo in vivo, mostrando l'attivazione della luce di PIRK nei neuroni neocorticali. La codifica genetica degli Uaa non impone restrizioni sul tipo di proteina bersaglio o sulla posizione cellulare, ed è disponibile una famiglia di Uaas fotoreattivi per modulare diversi residui di amminoacidi naturali. Questa tecnica ha quindi il potenziale per essere generalmente applicata a molte proteine neuronali per ottenere la regolazione ottica di diversi processi nel cervello. L'attuale protocollo presenta una procedura accessibile per l'incorporazione complessa di Uaa nei neuroni in vitro e in vivo per ottenere il controllo fotografico dell'attività delle proteine neuronali a livello molecolare.
Introduzione
Rispetto alla stimolazione elettrica convenzionale, fotostimolazione offre una maggiore risoluzione temporale e spaziale, con un minimo al sistema fisiologico di esemplari. Dal momento che la manifestazione di utilizzare il laser per stimolare i neuroni nel 1971 1, molti modi creativi sono stati inventati per controllare esogena attività neuronale con la luce. Rilascio ottica di agonisti photocaged è stato a lungo utilizzato per studiare la risposta fisiologica della rete neuronale di ligandi 2,3,4. Questa tecnica ha limitato specificità dovuta alla diffusione di agonisti gabbia. Specificità genetica si ottiene che esprimono canali ectopicamente....
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Protocollo
Tutte le procedure in corso di studio sono state eseguite utilizzando Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) ha approvato i protocolli per la manipolazione degli animali presso il Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA.
1. SAU incorporazione in Kir2.1 ed espressione della risultante Pirk nella cultura primarie neuronali
- DNA costruzione
- Selezionare un sito di destinazione di Kir2.1 per SAU incorporazione. Exploit conoscenza preventiva e informazioni sulla struttura e la funzione di Kir2.1, in modo che il sito scelto con il fotosensibile SAU incorporato consente la modulazione ottica del....
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Risultati
Per geneticamente incorporare un SAU in una proteina nei neuroni, il primo passo importante è quello di progettare gene appropriata costruisce per fornire ed esprimere i geni in modo efficiente in neuroni. Ci sono tre componenti genetiche per SAU incorporazione: (1) il gene bersaglio con il TAG ambra codone di stop introdotta nel sito prescelto per SAU incorporazione (2) un tRNA ortogonale riconoscere il mutato codone di stop TAG, e (3) un aminoacil ortogonali -tRNA sintetasi per caricar.......
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Discussione
Per raggiungere efficace foto-modulazione, l'importante primo passo è quello di decidere dove incorporare il fotosensibile SAU nella proteina bersaglio. informazioni strutturali e funzionali della proteina bersaglio è molto utile per guidare la selezione dei siti candidati. Allo stesso tempo, allo scopo di regolazione della luce sarebbe determinare quale sito è più adatto. Dopo aver scelto i siti candidati, si consiglia di testare i siti in linee cellulari di mammiferi come il rene embrionale umano (HEK) celle per f.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. S. Szobota per l'utile discussione sulla coltura dei neuroni e la trasfezione Ca-P. L.W. riconosce il supporto del Salk Innovation Grant, del California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1) e del National Institutes of Health (1DP2OD004744).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Occhiali di copertura, cerchi, 12 mm, spessore 0,13-0,17 mm | Carolina Biologicals | 633029 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 | |
| Soluzione di D-(+)-glucosio | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Iris Spatola-curvo | Fine Science Tool | 10092-12 | |
| Coltello da dissezione - Punta | angolata fineStrumento per le scienze fini | 10056-12 | |
| Integratore GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | |
| Estensore di siero MITO+ | BD Biosciences | 355006 | |
| Falcon 40 µ m Filtro cellulare | Corning Life Sciences | 352340 | |
| BES (N,N-Bis(2-idrossietil)-2-amminoetanosolfonico, N,N-Bis(2-idrossietil)taurina) | Sigma-Aldrich | B6420 | |
| SORGENTE LUMINOSA A LED – Nero LED 385 | Prizmatix Ltd. | ||
| Agarosio, basso punto di fusione, grado analitico | Promega | V2111 |
Riferimenti
- Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
- Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90....
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Ristampe e permessi
