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Articolo metodologico

Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti

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⸱

DOI:

10.3791/53829

⸱

26 febbraio 2016

 ,  , 
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, 2School of Life Sciences, University of Sussex

In questo articolo

Sommario

La tecnica elettrofisiologica di registrazione intracellulare è dimostrato e utilizzato per determinare la sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli nell'occhio composto di una farfalla.

Abstract

registrazione intracellulare è una tecnica potente usato per determinare come una singola cellula può rispondere ad un dato stimolo. Nella ricerca visione, la registrazione intracellulare è stata storicamente una tecnica comune usata per studiare la sensibilità di cellule visive individuali a diversi stimoli luminosi che è ancora in uso oggi. Tuttavia, rimane una carenza di metodologia dettagliata nella letteratura per i ricercatori che desiderano replicare gli esperimenti di registrazione intracellulare negli occhi. Qui vi presentiamo l'insetto come modello per l'esame fisiologia dell'occhio, più in generale. fotorecettori insetti si trovano vicino alla superficie dell'occhio e sono quindi facilmente raggiungibili, e molti dei meccanismi coinvolti nella visione si conservano tutta phyla animali. Descriviamo la procedura di base per la registrazione in vivo intracellulare di cellule visive negli occhi di una farfalla, con l'obiettivo di rendere questa tecnica più accessibile ai ricercatori con poca esperienza precedente in electrophysiology. Introduciamo l'attrezzatura di base, come preparare una farfalla reale per la registrazione, come inserire un microelettrodo di vetro in una singola cella, e infine la procedura di registrazione stessa. Spieghiamo anche l'analisi di base dei dati di risposta prime per determinare la sensibilità spettrale di tipi di cellule individuali. Sebbene il protocollo concentra sulla determinazione sensibilità spettrale, altri stimoli (ad esempio, la luce polarizzata) e variazioni del metodo sono applicabili a questa configurazione.

Introduzione

Le proprietà elettriche delle cellule come i neuroni si osservano misurando il flusso di ioni attraverso le membrane cellulari come un cambiamento di tensione o corrente. Una varietà di tecniche elettrofisiologiche sono state sviluppate per misurare eventi bioelettrici nelle cellule. I neuroni trovati nelle occhi degli animali sono accessibili e loro circuiti è spesso meno complesso nel cervello, rendendo queste cellule buoni candidati per lo studio elettrofisiologico. Le applicazioni più comuni di elettrofisiologia negli occhi includono elettroretinografia (ERG) 1,2 e microelettrodi registrazione intracellulare. ERG prevede il posizionamento di un elettrodo o sull'occhio di un animale, applicando un stimolo luminoso, e misurando la variazione di tensione come somma delle risposte di tutte le celle vicine 3-6. Se uno è specificamente interessati a caratterizzare sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli, spesso contemporaneamente più tipi di cellule rispondono a diversi punti di forza per un dato stimolo; cosìpuò essere difficile determinare la sensibilità di specifici tipi cellulari a partire da dati ERG soprattutto se ci sono diversi tipi di fotorecettori spettralmente-simili negli occhi. Una possibile soluzione è quella di creare transgenici Drosophila con il fotorecettore (opsina) gene di interesse espressa nelle cellule di maggioranza R1-6 negli occhi e quindi eseguire ERGs 7. I potenziali svantaggi di questo metodo includono non a bassa espressione della proteina fotorecettore 8, e il periodo di tempo lungo per la generazione e lo screening di animali transgenici. Per gli occhi con un minor numero di tipi di fotorecettori spettralmente distinti, l'adattamento dell'occhio con filtri colorati può aiutare con la riduzione del contributo di alcuni tipi di cellule per l'ERG, in tal modo consentendo la stima della sensibilità spettrale massimi 9.

registrazione intracellulare è un'altra tecnica nella quale un elettrodo multa infilza una cella e viene applicato uno stimolo. I record elettrodi solo indivLa risposta di cellule idual in modo che la registrazione e l'analisi più celle individuali può produrre sensibilità specifiche delle fisiologicamente diversi tipi di cellule 10-14. Anche se il nostro protocollo si concentra sulla analisi della sensibilità spettrale, i principi fondamentali della intracellulare registrazione con elettrodi appuntiti sono modificabili per altre applicazioni. Usando una differente preparazione di un campione, per esempio, e utilizzando elettrodi quarzo taglienti, si può registrare dalla profonda nel lobo ottico o altre regioni del cervello, a seconda della domanda viene chiesto. Ad esempio, i tempi di risposta dei singoli fotorecettori 15, attività cellulare nell'ottica lobi 16 (lamina midollare o lobula 17), cervello 18 o altri gangli 19 possono anche essere registrati con tecniche simili, o stimoli di colore potrebbe essere sostituito con polarizzazione 20 -22 o movimento sTIMOLI 23,24.

Fototrasduzione, il processo attraverso il quale la lucel'energia viene assorbita e convertita in un segnale elettrochimico, è un antico tratto comune a quasi tutti i presenti il giorno 25 phyla animali. Il pigmento visivo trovato nelle cellule fotorecettori e responsabile per l'avvio fototrasduzione visivo è rodopsina. Rhodopsins in tutti gli animali sono costituiti da una proteina opsin, membro del 7 transmembrana G famiglia dei recettori accoppiati alle proteine, e un cromoforo associato che deriva dalla retina o una molecola simile 26,27. Opsina sequenza di aminoacidi e la struttura cromofori influenzare l'assorbanza della rodopsina a diverse lunghezze d'onda della luce. Quando un fotone viene assorbito dal cromoforo rodopsina viene attivato, avviando una cascata proteina G nella cella che conduce verso l'apertura dei canali ionici di membrana 28. Diversamente dalla maggior parte dei neuroni, le cellule fotorecettori subiscono potenziali cambiamenti graduali che possono essere misurati come una variazione relativa di ampiezza risposta con il cambiamento stimolo luminoso. Tipicamente un determinatoTipo fotorecettore esprime un solo gene opsina (anche se esistono eccezioni 8,10,29-31). visione del colore sofisticata, del tipo presente in molti vertebrati e artropodi, si ottiene con un occhio complesso di centinaia o migliaia di cellule visive ogni esprimono uno o più tipi di tanto in tanto rodopsina. informazioni Visual viene catturato confrontando risposte oltre il mosaico fotorecettore tramite complesso segnalazione neurale valle nell'occhio e nel cervello, provocando la percezione di un'immagine completa di colori e movimento.

Dopo aver misurato le risposte grezzi di una cellula fotorecettore a diverse lunghezze d'onda della luce tramite registrazione intracellulare, è possibile calcolare la sua sensibilità spettrale. Questo calcolo è basato sul principio di Univariance, che afferma che la risposta di una cellula fotorecettore è dipendente dal numero di fotoni assorbe, ma non sulle particolari proprietà dei fotoni assorbe 32. Ogni fotone che è Absorbed da rodopsina indurrà lo stesso tipo di risposta. In pratica, ciò significa che l'ampiezza risposta grezzo di una cella aumenterà dovuti a un aumento dell'intensità della luce (più fotoni per assorbire), o ad un cambiamento nella lunghezza d'onda verso la sua sensibilità di picco (maggiore probabilità di rodopsina assorbire quella lunghezza d'onda). Noi facciamo uso di questo principio nel relativo risposte cellulari ad intensità nota e la stessa lunghezza d'onda di risposte a diverse lunghezze d'onda e la stessa intensità ma sconosciuto sensibilità relativa. Le cellule sono spesso identificati dalla lunghezza d'onda alla quale loro picchi di sensibilità.

Qui vi mostriamo un metodo per la registrazione e l'analisi di sensibilità spettrale dei fotorecettori negli occhi di una farfalla intracellulare, con una particolare attenzione per rendere questo metodo più accessibile alla comunità di ricerca più ampia. Sebbene registrazione intracellulare tuttora comune in letteratura, in particolare relativamente alla visione dei colori in insetti, abbiamo trovato that descrizioni di materiali e metodi sono generalmente troppo breve per consentire una riproduzione della tecnica. Presentiamo questo metodo in formato video allo scopo di consentire la replicazione facile. Descriviamo anche la tecnica utilizzando attrezzature facilmente reperibili ea prezzi accessibili. Ci rivolgiamo avvertimenti comuni che spesso non sono segnalati, che rallentano la ricerca quando l'ottimizzazione di una nuova e complessa tecnica.

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Protocollo

Tutti gli animali sono stati trattati come umanamente possibile. Gli insetti sono stati spediti come pupe da Costa Rica entomologica di alimentazione, Costa Rica.

1. Heliconius Pupe Cura

  1. Hang tutto pupe distanziati di 2-3 cm di distanza in una camera umidificata con perni di insetti.
  2. Dopo eclosion, consentono ali per asciugare poi mantenere le farfalle in vita per almeno 1 giorno in una camera umidificata e alimentano una soluzione diluita di miele al giorno prima della registrazione.
    1. Diluire il miele con acqua fino a circa una soluzione di miele 20% in volume, e versare in un piatto fondo di Petri.
    2. Portare singoli farfalle al piatto Petri, uno per uno. Al momento di toccare la soluzione con il loro tarsi anteriore, le farfalle si estenderanno automaticamente le loro proboscidi e bere dalla piastra di Petri. Se la loro proboscide non si estende automaticamente, usare il forcipe per tirare le proboscide fuori e introdurlo alla soluzione miele.

2. ottica di fondo, di taratura, e measurement di sperimentali condizioni di luce

  1. Posizionare una lampada allo xeno W 150 arco con alloggiamento e alimentazione universale ed un gruppo lente condensatore collegato su una estremità di un tavolo di almeno un metro di lunghezza per fornire luce bianca.
    ATTENZIONE: lampada allo xeno producono luce estremamente luminoso con forti intensità UV. occhiali protettivi devono essere indossati in ogni momento e la lampada deve essere usato secondo le istruzioni del produttore per evitare l'accumulo di ozono causata dalla interazione della luce UV con l'ossigeno atmosferico.
  2. Impostare un ottica traccia un metro di lunghezza per la luce che esce dal gruppo alloggiamento di passare attraverso (Figura 1).
    1. Inserire nel seguente ordine in pista ottico con distanze approssimate a parte: 1) una silice convessa o la lente di quarzo 40 cm dal gruppo condensatore, 2) una ruota filtro a densità neutra (senza filtri attualmente nel percorso della luce) 22 cm Maggiori lungo la pista, 3) un otturatore con l'unità motrice 14 cm dal filtro NDs, 4) una lente di silice o quarzo concava immediatamente adiacente dopo l'otturatore, e 5) una collimazione sonda fascio 6 cm lungo la estremità della pista.
    2. Fissare un cavo in fibra ottica 600 micron di diametro alla sonda fascio di collimazione.
      Nota: a seconda dell'intensità della luce, un cavo in fibra ottica di diametro 5-10 mm può essere richiesto di fornire abbastanza luce per altre preparazioni e può essere sostituito per questo.
    3. Regolare la distanza, altezza e l'angolo di ciascun elemento ottico in modo che il fascio di luce che esce dal gruppo è alla massima intensità possibile.
    4. Come elementi di pista ottici possono differire leggermente con diverse applicazioni, in modo che tutti gli elementi trasmettono luce nella gamma UVA e visibile (315-700 nm).
  3. Una volta che la traccia ottico è montato, misurare la luce che passa attraverso la configurazione utilizzando uno spettrometro. Calibrare lo spettrometro prima utilizzando una lampada calibrazione con uno spettro noto e software del produttore.
    Nota: Descriviamo il seguente configurato con Ocean Optics prodotti per chiarezza, ma altri produttori (ad esempio, Avantes) vendiamo prodotti comparabili.
    1. Accendere la lampada di calibrazione tungsteno almeno 45 minuti prima di prendere le misure.
    2. Per calibrare, collegare lo spettrometro via USB a un computer con il software associato installato. Quindi collegare lo spettrometro alla lampada calibrazione tungsteno con una trasmissione del coseno correttore UV-visibile.
    3. Selezionare "Nuovo assoluta irraggiamento misura" dalla scheda "File" e selezionare lo spettrometro come "Sorgente".
    4. Seguire le istruzioni per creare un nuovo file di calibrazione "CAL". Quando richiesto, caricare il file di dati forniti per lo spettro nota della lampada di calibrazione tungsteno nella gamma della luce visibile (300-800 nm) nel software, che calcola automaticamente lo spettro corretto dall'uscita spettrometro.
    5. Salvare il file di calibrazione. Caricare questo file quando initializing il software per tutte le future misure di spettri di luce utilizzando lo spettrometro.
  4. Una volta che lo spettrometro è stato calibrato, utilizzare questo per registrare gli spettri di luce dal setup sperimentale. D'ora in avanti quando il software si apre, selezionare "Nuovo assoluta irraggiamento di misura" e caricare il file di calibrazione precedentemente salvato. Poi prendete uno spettro scuro, bloccando tutta la luce allo spettrometro.
    1. Con lo spettrometro attualmente misurare le condizioni di luce sperimentali desiderati, regolare il tempo di integrazione (4 msec), scansioni a media (5), e la larghezza Boxcar (5), in modo lo spettro sia correttamente ridimensionate e smussate. Mantenere le impostazioni lo stesso per tutte le misurazioni spettrali, in modo che le intensità di luce di diverse misurazioni possono essere confrontati.
  5. Misurare spettri di luce bianca non attenuato, per tutti i filtri a densità neutra da utilizzare durante gli esperimenti, e per ogni filtro di interferenza passa-banda (figura 2).
    1. Misura spettro della luce bianca senza alcun filtro nel percorso ottico apponendo l'estremità libera del cavo in fibra ottica da punto 2.2.2 allo spettrometro. Con il file di calibrazione caricato dal punto 2.3, salvare il spettro di luce bianca utilizzando il software del spettrometro come file di testo.
      Nota: Spectra salvato come elencare la lunghezza d'onda file di testo (coordinate x) in una colonna e l'intensità della luce (y coordinate) nella seconda colonna, in modo che i dati possono essere caricati in un foglio elettronico per passo 2.6.
    2. Utilizzando la stessa messa a punto come punto 2.5.1, registrare lo spettro di ogni densità ottica (OD) (0-3,5 OD) utilizzato durante gli esperimenti ruotando la densità neutra (ND) ruota portafiltri nella traccia ottica, e salvare il file di testo per ogni OD.
    3. Utilizzando la stessa configurazione come punto 2.5.1, posizionare filtra l'nm interferenza metà larghezza di banda 10 uno per uno nel percorso ottico e registrare lo spettro osservata per ogni filtro. Ripetere questa procedura per ciascuno dei 41 diversi filtri interferenziali wtrasmittanze esimo picco spaziate ogni 10 nm 300-700 nm. Filtri distanziati più distanti (20 nm) sono accettabili per la maggior parte delle applicazioni (per gli spettri, vedi Figura 2).
  6. Correggere le differenze di intensità della luce quando filtri interferenziali sono collocati nel percorso ottico. Ogni filtro interferenziale consente un numero totale diverso di fotoni di passare, e la bassa trasmissione di alcuni filtri rende difficile attenuare ulteriormente intensità in modo che tutti i filtri permettono uguale numero di fotoni.
    1. Per calcolare l'intensità relativa (I) per ogni 10 nm filtro di interferenza banda, risolvere per I nell'espressione, I = T / sec, dove T è l'area sotto la curva spettrale di ciascun filtro di interferenza 10 nm (da 2.5.3) e s è l'assoluto irradianza (valore Y di file di testo salvato da 2.5.1) massimo di luce bianca alla lunghezza d'onda di picco di ciascun filtro (vedi figura 2 per un esempio a 520 nm).
    2. Dividere tutti intesità calcolatoi nel valore di intensità massimo calcolato 2.6.1 per normalizzare a uno, e prendono il reciproco dei valori normalizzati relativi per uso come un fattore di correzione applicato alla sensibilità grezzo ad ogni lunghezza d'onda (vedere il punto 6.4).
  7. Eseguire i passaggi da 2.1 a 2.6 solo una volta prima di una serie di esperimenti. Nel corso di un esperimento registrare periodicamente l'irradianza assoluto della lampada allo xeno sotto luce e filtri di densità neutri, per assicurarsi che l'intensità dello stimolo luminoso non cambia.
  8. Nel corso di un esperimento eventuale risposta cellulare a luce trasmessa attraverso i filtri interferenziali avvicina l'ampiezza massima risposta, utilizzare i filtri ND per attenuare il segnale. Se si utilizzano filtri ND durante un esperimento, rappresentano la corrispondente diminuzione dell'intensità durante il calcolo di sensibilità spettrale.
  9. Installare la pista ottica, la calibrazione e filtri giorni o settimane prima esperimenti iniziare. mantenere i filtricoperto per evitare l'accumulo di polvere.

Setup 3. Apparecchiatura di registrazione

  1. Feed stesso cavo a fibre ottiche utilizzate per la taratura attraverso una gabbia di Faraday e montare su un dispositivo goniometrico quale un perimetro braccio cardanico (vedere Figura 3 per lo schema). Il cavo sarà di circa 10 cm di distanza dall'occhio del campione.
  2. Inserire un palco metallo su una tavola vibrazionalmente isolato con una porta elettrodo montato direttamente sopra la fase sotto il controllo di un micromanipolatore (Figura 4). Posizionare il braccio cardanico in modo che la testa del campione è al centro della sfera creata dal movimento di rotazione del braccio.
  3. Utilizzando un sistema preamplificatore intracellulare, che comprende un amplificatore (all'esterno della gabbia di Faraday) e preamplificatore (headstage, vicino al prep all'interno della gabbia di Faraday) montare headstage sopra la fase di metallo dove verranno posizionati i campioni.
    1. Collegare un cavo coassiale alla headstage tramite unconnessione BNC. Split aperto solo la punta sull'altra estremità del cavo coassiale, e separare la guaina metallica esterna del cavo dal filo interno.
    2. Saldare la guaina esterna (mantenuto al potenziale di massa) ad un'estremità di un filo di rame isolato con un coccodrillo sull'altra estremità. Questo coccodrillo attribuirà alla elettrodo di riferimento di metallo sulla piattaforma del campione (punto 5.1.4).
    3. Saldare il filo interno del cavo coassiale ad un filo di argento sottile, per servire come l'elettrodo di registrazione. Questo filo deve essere sufficientemente sottile per essere immessa nella elettrodo di vetro soluzione riempito nel passaggio 5.2.3.
  4. Inserire un stereomicroscopio collegato a un braccio oscillante e base sulla panca di legno all'esterno della gabbia di Faraday, in modo che possa essere spostato in per abbassare l'elettrodo nell'occhio, e oscillato uscire di nuovo dopo l'elettrodo è nell'occhio.
  5. Assicurarsi che tutto in metallo all'interno della gabbia di Faraday messa a terra.
  6. Al di fuori della gabbia di Faraday, collegare il preamplifer all'ingresso di un 50-60 Hz riduttore di rumore (opzionale), e collegare l'uscita ad un canale di un oscilloscopio utilizzando un adattatore a T BNC.
  7. Utilizzando l'altra estremità del T-adattatore, collegare il segnale che passa attraverso l'oscilloscopio ad un canale dell'hardware. Fissare questo hardware a un computer tramite un cavo USB, che permetterà risposte registrate con il preamplificatore per essere letti da un software sul computer.
  8. Attaccare il driver otturatore dalla pista ottica al secondo canale dell'oscilloscopio utilizzando un altro T-adattatore e collegarlo ad un generatore di impulsi che controllerà la frequenza e la durata di lampi di luce consegnato ad occhio (Passo 5.5).
    Nota: il programma di installazione della piattaforma stessa deve solo bisogno di essere fatto una volta. Pausa qui fino al momento di iniziare la registrazione.

4. Prep sul giorno di registrazione

  1. Accendere la lampada allo xeno, almeno 45 minuti prima dell'esperimento e accendere il vetro microelettrodo estrattore almeno 30 minuti prima di pulelettrodi di vetro Ling.
  2. Accendere tutte le apparecchiature di registrazione (otturatore, amplificatore, eliminatore di rumore, generatore di impulsi, oscilloscopio, e l'acquisizione dei dati hardware) e assicurarsi che l'otturatore è chiuso per impostazione predefinita in modo che nessuno la luce passa attraverso il cavo in fibra ottica.
  3. Tirare borosilicato fine (o alluminosilicato) microelettrodi di vetro (100-250 MW resistenza è l'ideale) con un estrattore di vetro microelettrodo. Utilizzare elettrodi di vetro all'interno di solo pochi ore di essere tirato.
  4. Backfill gli elettrodi con 3 M di cloruro di potassio (KCl). Si noti che questa soluzione può essere modificato in base alle esigenze del ricercatore, per esempio tingere iniezione.

5. campione Prep e Procedura di registrazione

  1. Preparare il campione
    1. Fissare una farfalla individuo all'interno di un piccolo tubo di plastica con cera calda così la testa è immobile e sporgente da una estremità del tubo. Cera giù proboscide, antenne e ali (Figura 5).
    2. Tenere premuto tegli addome con un pezzo secco di cera e mantenere il tubo umidificata inserendo un tessuto bagnato all'interno del tubo dietro l'addome. Assicurarsi che il campione è completamente immobile.
    3. Montare il tubo con un piccolo pezzo di cera su una piccola piattaforma con uno snodo sferico-e-zoccolo che è collegato a una base magnetica.
    4. Sotto un microscopio da dissezione, inserire un filo d'argento del diametro di 0,125 millimetri nella testa via boccale da utilizzare come elettrodo di riferimento. Prima dell'esperimento, fissare stabilmente il filo alla piattaforma in modo tale che il filo di rame nel passaggio 3.3.2 può agganciare ad esso una volta la piattaforma è posto sulla fase per la registrazione.
    5. Una volta che l'elettrodo di riferimento è in una posizione adatta, potrebbe essere mantenuto in posizione da fusione rapido e raffreddando quindi la cera intorno al filo.
    6. Utilizzando una lama di rasoio in acciaio al carbonio frangibile, presa parte della lama con un portalama e rompere un piccolo pezzo da utilizzare per tagliare la cornea.
    7. Tagliare un piccolo foro (~ 10 ommatidiun diametro) nella cornea sinistra utilizzando lametta e sigillare il foro con vaselina per prevenire l'essiccamento.
  2. Una volta che la cornea viene tagliata, inserire l'elettrodo di registrazione nell'occhio più rapidamente possibile perché emolinfa nell'occhio rapidamente indurire e rendere impossibile l'aggiunta di un elettrodo. Se possibile eseguire la dissezione nella piattaforma, dove la registrazione avrà luogo.
    Nota: vaselina non deve essere spalmato sul resto dell'occhio come questo defocus l'ottica.
    1. Se non è già sul palco, posizionare il campione e la piattaforma montata sul palco nel rig registrazione. Collegare il cavo di terra headstage dal punto 3.3.2 per l'elettrodo di riferimento sulla piattaforma provino con morsetti a coccodrillo.
      Nota: Se possibile utilizzare un filtro rosso per illuminare l'animale.
    2. Utilizzare una sorgente di luce con allegati collo d'oca alla luce brevemente il campione sotto uno stereoscopio, riducendo al contempo l'elettrodo di registrazione nell'occhio.
    3. InSERT il filo d'argento collegato al headstage dal punto 3.3.3 nella soluzione KCl nel retro di un microelettrodo di vetro. Montare l'elettrodo di vetro sulla porta elettrodo.
    4. Regolare il portaelettrodo modo microelettrodo è direttamente sopra il foro precedentemente tagliato nella cornea, circa un millimetro sopra la cornea. Abbassare il microelettrodo nell'occhio utilizzando micromanipolatore fino a quando un circuito è completato, come mostrato da una grande variazione di potenziale (mV) sull'oscilloscopio.
  3. Una volta negli occhi, oscillare lo stereoscopio di fuori della gabbia di Faraday, e spegnere la fonte di luce che illumina il campione. La stanza deve essere tenuto buio così l'occhio diventa scuro adattato.
  4. Controllare la resistenza dell'elettrodo applicando una corrente 1 nA dall'amplificatore e rilevando la variazione di tensione. La resistenza dovrebbe essere tipicamente nell'intervallo compreso tra 100-250 MW. resistenze superiori sono indicativi di ostruzione o piegatura dell'elettrodo e basse resistenze di elettrola rottura ode.
  5. Attivare il generatore di impulsi così l'otturatore apre consentendo un lampo di luce con una durata msec 50 ogni 0,5 secondi, e permettono di continuare a lampeggiare per tutta la durata dell'esperimento.
    1. Regolare il generatore di impulsi in modo da permette lampi di fino a 50 msec durata. Tale durata e la pausa di 0,5 secondi tra lampi mantiene il campione il più vicino allo scuro adattato il più possibile durante l'esperimento. Cinquanta msec è vicino alla durata del flash più breve che suscitare la stessa ampiezza in risposta alle durate flash prolungato.
    2. Rimisurare risposte sia all'inizio e alla fine dell'esperimento (passo 5.16). Nel corso di circa un esperimento ventina minuto, queste impostazioni del flash non degradano la risposta nel tempo. Diverse preparazioni possono richiedere un aggiustamento a queste impostazioni del flash.
  6. Posizionare il braccio cardanico modo che il cavo a fibre ottiche è diretta verso l'occhio.
  7. Controllare l'oscilloscopio per la variazione di tensione tra luce flash.Una variazione negativa di tensione significa che l'elettrodo non è ancora entrata in una cellula.
  8. Spostare il braccio cardanico attorno campione fino a posizionarlo in un angolo a occhio in cui vi è una risposta massima tensione.
  9. Ruotare micromanipolatore avanti e indietro, provocando molto piccoli movimenti verticali della elettrodo in entrambe le direzioni, mentre leggermente toccando la base del porta elettrodo o utilizzando la funzione Buzz sul preamplificatore. Continuare fare piccoli aggiustamenti fino a quando appare una risposta chiara depolarizzante sull'oscilloscopio (Figura 6).
  10. Regolare nuovamente il braccio cardanico per trovare l'angolo di incidenza, dove un lampo di luce produce il grande segnale di depolarizzazione. Fare piccoli aggiustamenti con micromanipolatore e utilizzare la funzione Buzz dell'amplificatore come necessario per assicurarsi che l'elettrodo è stabile registrando il cellulare e che rimarrà in cella per l'intero esperimento (vedere il punto 5.11).
  11. Una volta che l'installazione è stabile, iniziare recording. Una registrazione stabile dovrebbe avere poco o nessun cambiamento nel potenziale, a basso rumore di fondo, e di un sempre grande risposta depolarizzante di riposo (almeno un 10: 1 del segnale di rumore).
    1. Eseguire il software sul computer, e iniziare un "nuovo esperimento", che si aprirà una finestra pop-up con quattro canali.
    2. Regolare la scala di tensione in alto a destra della finestra del software a 500 mV. Il primo canale visualizza le risposte registrate dall'elettrodo in tempo reale, mentre il secondo canale registrerà l'onda quadra prodotta dal generatore di funzione, se il segnale viene alimentato al hardware di acquisizione dati tramite l'oscilloscopio, mostrando quando l'otturatore è aperto . Gli altri due canali sono necessari.
    3. Fare clic su "Start" in basso a destra per avviare la registrazione, e consentire al software di funzionare per tutta la durata dell'esperimento. Regolare lo zoom della x (tempo) e y (tensione) assi in modo che le risposte sono chiare.
  12. In primo luogo, con luce bianca, di registrare fino a 10 risposte individuali con la ruota filtro ND a 3,5 OD (circa 5-10 sec).
  13. Risultato successivo lo stesso numero di risposte a 3,3 OD, quindi 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1, ecc in ogni combinazione fino 0.0 OD. Queste ampiezze di risposta alla serie filtro ND fornirà la curva di intensità di risposta-log nella Sezione 6. Se si verifica sbianca, utilizzare meno lampi di stimoli luminosi nel corso dell'esperimento.
  14. Registrare la risposta della cella a tutte le lunghezze d'onda, utilizzando i filtri interferenziali.
    1. In primo luogo trovare la lunghezza d'onda di picco. Senza filtri ND nel percorso della luce (0,0 OD), inserire un filtro di trasmissione UV nel percorso ottico e brevemente osservare l'ampiezza di risposta. Ripetere con un filtro blu trasmittente, un filtro di trasmissione verde, ed un filtro di trasmissione rosso, che dovrebbe dare un'idea di dove la risposta di picco sarà.
    2. Utilizza i filtri a circa 350, 450, 550, 650 nm per trovare la regione in generale della sensibilità picco nelpasso 5.14.1. La lunghezza d'onda esatta non ha importanza in questa fase di ricerca iniziale, perché tutte le lunghezze d'onda saranno registrati nella fase successiva. Se le stime esistono delle sensibilità di picco, o che sono stati precedentemente registrato, uso conosciuto lunghezze d'onda di identificare rapidamente la risposta di picco.
    3. Una volta che la risposta di picco o vicino ad esso è identificato, record a questa lunghezza d'onda per 10 risposte (circa 5 sec).
    4. Dopo la registrazione alla lunghezza d'onda di risposta di picco, registrare con gli altri filtri interferenziali, dai 300-700 nm a 10 nm passi. Inizia dal picco e uscire verso entrambe le lunghezze d'onda più corte e più a lungo scambiando i filtri fuori dal percorso della luce uno dopo l'altro (ad esempio, se la risposta di picco è a 520 nm, registrare le risposte a questa lunghezza d'onda, poi 510 nm, seguita da 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm, e così via fino a quando non vi è alcuna risposta).
    5. Lasciare per un massimo di 10 risposte per filtro (5 sec ciascuno). Quando lo scambio di filtri interferenziali, permettono alla cellula di rispond a 1-2 lampi di luce bianca senza alcun filtro nel percorso ottico, che è utile per controllare se la risposta di picco è degradante nel corso del tempo. Ridurre il numero di risposte o aumentare il diametro esterno in caso di sbiancamento.
  15. Se la risposta sotto qualsiasi filtro di interferenza è troppo vicino alla risposta massima sotto luce bianca a 0 OD, quindi attenuare con filtri ND. I filtri di interferenza e dimensioni del cavo in fibra ottica utilizzati in questo esperimento attenuano notevolmente l'intensità della luce e quindi non sono in genere necessari filtri ND.
  16. Se la registrazione rimane stabile, ri-registrare lunghezze d'onda intorno alla risposta di picco, che serve come pseudoreplicate per confermare precedenti ampiezze di risposta e contribuisce a garantire la risposta non è degradato nel tempo. Una volta che tutte le lunghezze d'onda sono registrati, ri-registrare le risposte sotto la serie ND, come nel passo 5.12.
  17. Una volta che la registrazione è completa clicca "Stop" sul software, e salvare la registrazione per l'analisi.
  18. Dopo un esperimento, sacrificare l'individuo mediante congelamento o raffreddamento per alcuni minuti seguiti da rapidamente tagliare la testa e schiacciamento del torace.
  19. Spegnere tutte le apparecchiature. Pausa qui, se necessario, prima di fare l'analisi.

6. spettrale Sensitivity Analysis

  1. Con il software utilizzato per registrare le risposte prime, calcolare l'ampiezza risposta media di 10 risposte individuali per ciascun filtro della serie ND e per ciascun filtro di interferenza.
  2. Creare una funzione di risposta-log intensità (VlogI) della serie filtro ND registrata nei passaggi 5,12-5,13 (Figura 7). Eseguire questa riportando unità log di intensità (OD) sull'asse X e risposta a ciascuna intensità sull'asse y.
    1. Per ricavare sensibilità spettrale della cella a diverse lunghezze d'onda, misura tipicamente l'equazione Naka-Rushton ai dati dal punto 6.2, e usare questa equazione di mettere in relazione le risposte spettrali sperimentali ottenuti su diverse lunghezze d'onda tO fotoni relative richieste per provocare la risposta in una lunghezza d'onda costante (in questo caso la luce bianca).
      Nota: L'equazione Naka-Rushton è: V / V max = I n / (I n + K n), dove I è l'intensità dello stimolo, V è l'ampiezza di risposta, V max è la massima ampiezza di risposta, K è lo stimolo intensità dando ½ V max, e n è la pendenza esponenziale. Vari metodi possono essere usati per adattare questa equazione ai dati VlogI, tra cui la curva del software di montaggio, o pacchetti statistici basati su codice.
    2. Per adattare l'equazione Naka-Rushton utilizzando calcoli semplici e un foglio di calcolo, di trasformare i dati di risposta VlogI per ogni intensità dello stimolo: log [(V max / V) - 1]. Quindi eseguire una regressione lineare sui dati trasformati per ottenere l'equazione della linea di best fit.
      Nota: V max deve essere maggiore di tutte le risposte misurate; mantenere questa costante, questo metodo stima V max come 1% greater che la risposta misurata più alta.
    3. Dalla equazione della linea di regressione, stimare l'esponente (n) prendendo la pendenza negativa, e log (K) = y intercetta / n.
  3. Una volta che i parametri di V max, n, e K sono stati stimati, determinare il numero relativo di fotoni necessari per suscitare la risposta spettrale della cella in ogni lunghezza d'onda collegando risposta spettrale misurata ad una data lunghezza d'onda (V) e solving per I.
  4. Moltiplicare l'intensità dello stimolo calcolato (I) dal punto 6.3 per il fattore di correzione per ogni filtro di interferenza (dal punto 2.4.3) ad ogni lunghezza d'onda.
  5. Per ottenere la sensibilità, tutte le intensità devono essere correlate alla curva V log-I in modo che possano essere confrontati. A tale scopo, relative ciascuna lunghezza d'onda di intensità a ½ V max o K, calcolata al punto 6.2.3.
    1. Sottrarre ogni lunghezza d'onda di intensità corretto (punto 6.4) da K.
    2. Poi per ogni intensità di lunghezza d'onda, aggiungere questo "distanza dal valore di K "di K, e moltiplicare per (-1).
    3. Successivo portare tutti i punti dati positivi aggiungendo il valore assoluto del punto dati più basso nella serie per ogni lunghezza d'onda.
  6. Trova sensibilità ad ogni lunghezza d'onda prendendo il reciproco di tutte le intensità di recente calcolata dal punto 6.5.1. Trasformare i dati in modo che lo spettro di sensibilità compresa tra 0 e 1.
  7. Dopo aver registrato da più di una cella dello stesso tipo media le risposte finali e la trama con barre di errore standard o il 95% intervallo di confidenza (Figura 8).

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Risultati

Per molti elementi della configurazione di registrazione, una descrizione scritta non fornisce dettagli sufficienti. Figura 1 è una schematica dei componenti coinvolti nella configurazione registrazione completa. In figura 2, spettri sono tracciate per luce bianca e ciascun filtro di interferenza a dare un senso del perché è necessario un fattore di correzione e ciò che è necessario per calcolare la correzione. La Figura 3 mostra foto e un diagramma del braccio...

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Discussione

registrazione intracellulare può essere una tecnica difficile da padroneggiare a causa dei molti passaggi tecnici coinvolti. Per gli esperimenti di successo devono essere considerati diversi punti importanti. In primo luogo, è importante avere una tabella correttamente vibrazionalmente-isolato su cui viene eseguita l'esperimento. Molti ricercatori utilizzano le tabelle d'aria, che separano completamente il tavolo dalla base, dando isolamento dalle vibrazioni superiori. La nostra messa a punto prevede un tavolo d...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo il ritardo Rudy Limburgo per fabbricare le perimetro del braccio cardanici, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate per averci prestato attrezzature, e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, per incoraggiamento. Questo lavoro è stato sostenuto da una National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship per KJM e Grant NSF IOS-1.257.627 a ADB

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Diversespecie locali disponibili, necessitano di permessi USDA per la spedizione. Carolina Bio Supply ha diverse specie di insetti che possono essere ordinate negli Stati Uniti senza la necessità di ulteriori permessi Grande
cilindroQualsiasi camera che rimane umidificata funzionerà
Perni per insetti, misura 2BioQuip1208B2
100% Desert Mesquite Honey TraderJoe'sQualsiasi soluzione di miele o saccarosio funzionerà
Xenon ArcLamp Oriel Instruments66003Oriel fa ora parte di Newport Corporation
Universal PowerSupply Oriel Instruments68805Oriel fa ora parte di Newport Corporation
Optical TrackOriel Instruments11190Oriel fa ora parte di Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x)Oriel Instruments11641Oriel fa ora parte di Newport Corporation
Rail Carrier, piccolo (4x)Oriel Instruments11647Oriel fa ora parte di Newport Corporation
Adattatore filettato, da 8-32 maschio a 1/4-20 maschio, confezione da 10Newport CorporationTA-8Q20-10
Perno di montaggio ottico, 1,0 pollici, 0,5 pollici Ø inossidabile, 8-32 e 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
per perno ottico antiscivolo, 2 pollici, 0,5 pollici. Diametro perni, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
Attacco obiettivo fisso, 50,8 mmNewport CorporationLH-2
Attacco obiettivo fisso, 25,4 mmNewport CorporationLH-1
Gruppo obiettivo condensatoreNewport Corporation60006
Lente convessa in silice, 50,8 mmNewport CorporationSPX055
Ruota portafiltri a sei posizioni, x2Newport CorporationFW1X6
Mozzo per montaggio su ruota portafiltriNewport CorporationFWM
Lente concava in silice, 25,4 mmNewport CorporationSPC034
Supporto collimatoreNewport Corporation77612
Sonda a fascio di collimazioneNewport Corporation77644
Convertitore a ghiera, terminazione SMA a ghiera standard da 11 mmNewport Corporation77670Questo adattatore consente alla fibra ottica di inserirsi nel supporto del collimatore 
600 μ m diametro cavo obtico in fibra UV-visOriel Instruments78367Oriel è ora una parte di Newport Corporation
Otturatore con unità di azionamentoUniblitz100-2B
Filtro ND metallico in silice fusa UV, 0,1 ODNewportFRQ-ND01
Filtro ND metallico in silice fusa UV, 0,3 ODNewportFRQ-ND03
Filtro ND metallico in silice fusa UV, 0,5 ODNewportFRQ-ND05
Filtro ND metallico in silice fusa UV, 1.0 ODNewportFRQ-ND10
Filtro ND metallico in silice fusa UV, 2.0 ODNewportFRQ-ND30
Filtro ND metallico in silice fusa UV, 3.0 ODNewportFRQ-ND50
LS-1-Cal lampadaOcean OpticsLS-1-Cal
SpectrometerOcean OpticsUSB-2000
SpectraSuite SoftwareOcean Optics
Filtro passa-banda di interferenza, 300 nm Edmund Optics67749
Filtro passa-banda di interferenza, 310 nm Edmund Optics67752
Filtro passa-banda di interferenza, 320 nm Edmund Optics67754
Filtro passa-banda di interferenza, 330 nm Edmund Optics67756
Filtro passa-banda di interferenza, 340 nm Edmund Optics65614
Filtro passa-banda di interferenza, 350 nm Edmund Optics67757
Filtro passa-banda di interferenza, 360 nm Edmund Optics67760
Filtro passa-banda di interferenza, 370 nm Edmund Optics67761
Filtro passa-banda di interferenza, 380 nm Edmund Optics67762
Filtro passa-banda di interferenza, 390 nm Edmund Optics67763
Filtro passa-banda di interferenza, 400 nm Edmund Optics65732
Filtro passa-banda di interferenza, 410 nm Edmund Optics65619
Filtro passa-banda di interferenza, 420 nm Edmund Optics65621
Filtro passa-banda di interferenza, 430 nm Edmund Optics65622
Filtro passa-banda di interferenza, 440 nm Edmund Optics67764
Filtro passa-banda di interferenza, 450 nm Edmund Optics65625
Filtro passa-banda di interferenza, 460 nm Edmund Optics67765
Filtro passa-banda di interferenza, 470 nm Edmund Optics65629
Filtro passa-banda di interferenza, 480 nm Edmund Optics65630
Filtro passa-banda di interferenza, 492 nm Edmund Optics65633
Filtro passa-banda di interferenza, 500 nm Edmund Optics65634
Filtro passa-banda di interferenza, 510 nm Edmund Optics65637
Filtro passa-banda di interferenza, 520 nm Edmund Optics65639
Filtro passa-banda di interferenza, 532 nm Edmund Optics65640
Filtro passa-banda di interferenza, 540 nm Edmund Optics65642
Filtro passa-banda di interferenza, 550 nm Edmund Optics65644
Filtro passa-banda di interferenza, 560 nm Edmund Optics67766
Filtro passa-banda di interferenza, 570 nm Edmund Optics67767
Filtro passa-banda di interferenza, 580 nm Edmund Optics65646
Filtro passa-banda di interferenza, 589 nm Edmund Optics65647
Filtro passa-banda di interferenza, 600 nm Edmund Optics65648
Filtro passa-banda di interferenza, 610 nm Edmund Optics65649
Filtro passa-banda di interferenza, 620 nm Edmund Optics65650
Filtro passa-banda di interferenza, 632 nm Edmund Optics65651
Filtro passa-banda di interferenza, 640 nm Edmund Optics65653
Filtro passa-banda di interferenza, 650 nm Edmund Optics65655
Filtro passa-banda di interferenza, 660 nm Edmund Optics67769
Filtro passa-banda di interferenza, 671 nm Edmund Optics65657
Filtro passa-banda di interferenza, 680 nm Edmund Optics67770
Filtro passa-banda di interferenza, 690 nm Edmund Optics65659
Filtro passa-banda di interferenza, 700 nm Edmund Optics67771
di FaradayFunzionerà qualsiasi struttura metallica che possa essere collegata a terra e che si adatti alla configurazione sperimentale.
Stereomicroscopio, ingrandimento 6X, 12X, 25X, 50XWild HeerbruggWild M5Qualsiasi stereomicroscopio andrà bene
Supporto per microscopio con braccio oscillante e base pesanteStrumentiQualsiasi base pesante con braccio farà
braccioCostruito su misura, Vedi Figura 4
Illuminatore ad alta intensità Fiber-liteDolan-JennerMI-150Per l'esempio di illuminazione
Guida luminosa a collo d'oca in fibra otticaDolan-JennerEEG 2823Qualsiasi guida luminosa a collo d'oca andrà bene
Tavolo
TavoloIl foro deve essere tagliato attraverso questo tavolo in modo che la sabbiera possa poggiare sul tavolo in marmo sottostante
Scatola di legno riempita di sabbiacostruita su misura, qualsiasi scatola con sabbia
ManipolatoreCarl Zeiss - Jena
Portaelettrodo
Stadio
Fili a coccodrillo per la messa a
Filo
Filo d'argento, diametro 0,125 mmWorld Precision InstrumentsAGW0510
caviBNC
Preamplificatore con headstageDagan CorporationIX2-700
Riduttore di rumore HumbugQuest ScientificHumbug
Oscilloscopio, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, senza sondaEZ Digitalos-5030
BNC T-adapter
Powerlab hardware 2/20ADI instrumentsML820
Software LabchartStrumenti ADIChart 5
impulsi da 10 MHzBK Precision4030
Estrattore per pipette in vetroSutter InstrumentsP-87
Capillari in vetro borosillicato con filamentoWorld Precision Instruments1B120F-4
Cloruro di potassio, 3 M
di plastica scanalato
Cera
SaldatoreWeller
Piattaforma con base magnetica a sfera e presaHama foto e video
acciaio al carbonio a doppio taglio, lama di rasoio fragileScienze al microscopio elettronico72004
Vaselina
Microsoft ExcelMicrosoft
di plastica Supporto Gabbia McBain il cardanico in marmo in legno rialzato per campioniterradi rame isolatoGeneratore di Tubo a bassa temperatura di fusione in

Riferimenti

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