La raccolta selettiva di Marginating-polmonari leucociti

Sommario

I leucociti polmonari marginanti mostrano caratteristiche uniche e funzioni immunologiche distinte rispetto ad altre popolazioni di leucociti. Qui descriviamo il prelievo selettivo di questa sottopopolazione di leucociti polmonari, mediante perfusione forzata dei polmoni in ratti e topi. I leucociti polmonari marginanti sembrano fondamentali nel determinare la suscettibilità alle malattie trasmesse per via ematica e polmonare.

Abstract

I leucociti marginanti-polmonari (MP) sono leucociti che aderiscono all'endotelio interno dei capillari polmonari. È stato dimostrato che i leucociti MP presentano una composizione e caratteristiche uniche rispetto ai leucociti di altri compartimenti immunitari. L'evidenza suggerisce una maggiore citotossicità delle cellule natural killer e un distinto profilo pro- e anti-infiammatorio della popolazione di leucociti MP rispetto agli immunociti circolanti o splenici. Il metodo qui presentato consente il prelievo selettivo di leucociti MP mediante perfusione forzata dei polmoni sia nei topi che nei ratti. A differenza di altri metodi utilizzati per estrarre i leucociti polmonari, come la macinazione dei tessuti e la degradazione biologica, questo metodo produce esclusivamente leucociti dai capillari polmonari, non contaminati da cellule parenchimali, interstiziali e bronco-alveolari. Inoltre, la tecnica di perfusione preserva meglio l'integrità e l'ambiente fisiologico dei leucociti MP, senza indurre risposte fisiologiche dovute al processamento tissutale. Questa popolazione unica di leucociti MP è posizionata strategicamente per identificare e reagire alle cellule circolanti anormali, poiché tutte le cellule maligne circolanti e le cellule infette vengono trattenute mentre passano attraverso i capillari polmonari, interagendo fisicamente con le cellule endoteliali e i leucociti residenti. Pertanto, il prelievo selettivo di leucociti MP e il loro studio in varie condizioni possono far progredire la nostra comprensione del loro significato biologico e clinico, in particolare per quanto riguarda il controllo delle cellule aberranti circolanti e delle malattie polmonari.

Introduzione

I leucociti aderenti ai capillari dei polmoni (ad esempio, marginating-polmonare (MP) leucociti) ¹ sono stati mostrati ad esporre distinti composizione dei leucociti e l'attività unico rispetto ai leucociti da altri comparti del sistema immunitario (ad esempio, la circolazione, milza, midollo osseo) ^{2- 4.} Ad esempio, mostra MP-leucociti superiore cellule natural killer (NK) citotossicità contro varie cellule tumorali, rispetto al circolanti e milza cellule NK, così come i livelli differenziati RNA messaggero (mRNA) e aumento della secrezione di citochine pro e anti-infiammatori. La composizione delle cellule è anche differenziata da leucociti circolanti come MP-leucociti hanno un rapporto più elevato di immunità innata / adattativa rispetto ai leucociti circolanti (50% contro 30%, rispettivamente). L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di consentire la raccolta selettiva di MP-leucociti, per studiare questo compartimento immunitario importante ed unico (popolazione cellulare), e elucIDATE l'impatto delle varie manipolazioni (ad esempio, attivazione immunitaria) su queste cellule specifiche.

Per comprendere il significato di questa popolazione unica, è importante notare che il sistema immunitario può controllare cellule tumorali, micrometastasi e malattia residua che circola attraverso funzioni in vivo di immunità cellulo-mediata (CMI). Questa capacità è evidente nonostante il fallimento precedente del sistema immunitario di controllare il tumore primario, e supportato da ampia evidenza in vivo in pazienti oncologici e modelli animali ^5. È importante sottolineare che questi risultati sono spesso in contrasto con in vitro ed ex vivo studi che riportano che la maggior parte delle cellule tumorali autologhe sono resistenti alla citotossicità dai leucociti nei campioni di sangue che circola da esseri umani e gli animali (misurata mediante saggi di citotossicità) ^6,7. Questa discrepanza può essere attribuita alla presenza in vivo di popolazioni leucocitarie distinte, come il giàmenzionata popolazione leucocitaria MP, e in particolare la sua sottopopolazione di cellule NK attivate ^3. Infatti, le cellule tumorali singenici (MADB106), che sono risultati essere resistenti alla circolazione e leucociti splenici, hanno dimostrato di essere lisate dalle cellule MP-NK ^3,8. Così, le cellule MADB106 presumibilmente 'NK-resistenti "che metastatizzano polmoni di fischer344 (F344) ratti sono controllati da cellule MP-NK, ma non da cellule NK spleniche, comunemente studiato a causa della loro facilità di accesso circolante o.

Purificata e attivi MP-leucociti sono inaccessibili attraverso i metodi di raccolta standard dei leucociti dai polmoni, che si basano sulla macinazione tessuto polmonare o degradazione biologica ^9. Il nostro approccio ha due grandi vantaggi rispetto agli approcci di lavorazione dei tessuti. Innanzitutto, l'approccio perfusione raccoglie selettivamente MP-leucociti, separandole da altre cellule che provengono dal parenchima polmonare, interstiziale, e compar bronco-alveolaretments. In secondo luogo, la tecnica di perfusione meglio preserva l'integrità e l'ambiente fisiologico MP-leucociti, a differenza della macinazione e trasformazione biologica approcci che danneggiano le cellule, alterano la morfologia e inducono la produzione e il rilascio di vari fattori che modulano l'attività immunitaria e specificamente sopprimono NK citotossicità ^10.

I polmoni sono un importante organo bersaglio per le metastasi del cancro e per varie malattie infettive. Tutte le cellule maligne circolanti e cellule infettate passano attraverso i capillari polmonari, dove devono deformarsi e interagire con le cellule endoteliali dei capillari e leucociti residenti. In queste condizioni, le cellule circolanti possono essere facilmente bersaglio di MP-leucociti residenti. Sembra quindi biologicamente vantaggioso avere leucociti attivati ​​in questo compartimento immunitario, ed è importante studiare questo unico MP-popolazione in impostazioni biologici, sperimentali e clinici differenti. E 'degno di nota che syattivazione stemic immune dai vari risposta modificatori biologici (ad esempio, l'acido polyinosinic-policitidilico (poli I: C) o di tipo C CpG oligonucleotidi (CpG-C ODN)) hanno dimostrato di attivare la MP-leucociti più di leucociti circolanti ^{3, 8,11.}

Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) a Tel-Aviv.

1. Protocollo Rat

1. preparativi
   1. Disporre 2 farfalla 21 aghi G. Facoltativamente, preparare 2 farfalla 21 aghi smussati G taglio presentando il bordo tagliente dell'ago.
   2. Sterilizzare strumenti chirurgici: 2 paia di forbici, pinze smussato-taglio, emostatico, forcipe dente-tessuto sterilizzati in autoclave a 121 ° C per almeno 30 minuti su impostazione gravità (a secco).
   3. Preparare eparinizzato PBS (30 unità / ml) aggiungendo 30 unità di eparina per ml di soluzione di tampone fosfato (PBS 1x). Utilizzare a temperatura ambiente. 35 ml è il volume minimo necessario per animale.
   4. Streaming eparina PBS nelle linee pompa peristaltica e gli aghi a farfalla per evitare bolle d'aria.
2. Perfusione dei polmoni e la raccolta di MP-leucociti
   1. Eutanasia l'animale da una dose eccessiva di 8% isoflurano. Confermare l'eutanasia dal monitoraggio respirazione cessazione.
   2. Al momento della cessazione della respirazione, aprire immediatamente le cavità peritoneale e al torace con le forbici sterili e pinze dente-tessuto. Effettuare una incisione addominale mediana lungo l'addome fino al processo xifoideo.
   3. Sollevare lo sterno con le pinze, con cautela tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati, senza pungere qualsiasi organo interno o grandi vasi sanguigni. Bloccare una pinza emostatica sullo sterno, e rostralmente piegare la gabbia toracica per esporre il complesso cardiopolmonare.
   4. Inserire un ago a farfalla nel ventricolo destro del cuore, ed entro circa un minuto raccogliere il massimo volume di sangue in una siringa (~ 6 ml da 250 g animale).
   5. Bloccare la vena cava con un emostatico per evitare la perfusione a ritroso del fegato (vedi la discussione).
   6. Tenere l'ago a farfalla nel ventricolo destro durante la sostituzione della siringa contenente il sangue con il tubo di efflusso della ppompa eristaltic.
   7. Inserire un secondo ago a farfalla collegato ad una siringa da 5 ml raccolta nel ventricolo sinistro, evitando la penetrazione del setto interventricolare.
   8. Accendere la pompa peristaltica ad una velocità di circa 5 ml / min e raccogliere delicatamente nella siringa la prima porzione di perfusato che sono contaminati con il sangue. Continuare fino a quando il colore si trasforma perfusato dallo scuro al rosso pallido. (Scartare il perfuste sangue contaminato).
   9. Senza cessazione della pompa peristaltica, rapidamente sostituire la raccolta siringa da 5 ml con una siringa da 20 ml raccolta e raccogliere 20 ml di perfusato polmone impiegando una maggiore velocità di perfusione (fino a 7 ml / min). Monitorare continuamente il flusso perfusato nella siringa raccolta, evitando la formazione di vuoto.
   10. Cessare la portata della pompa peristaltica.
3. I leucociti Estrazione
   1. Centrifugare il perfusato per 10 minuti a 400 × g.
   2. Aspirare il fluido.
   3. Aggiungere 10 ml di PBS o medie, centrifugare a 400 xg per 10 min, e aspirare il liquido. Ripetere questa operazione due volte. L'uso di PBS o mezzo dipende il conseguente impiego del campione.
   4. Aggiungere 20 ml di PBS o medie, centrifugare a 400 xg per 10 min, e aspirare il liquido.
   5. Ricostituire cellule alla concentrazione desiderata, basati sull'utilizzo campione (FACS, PCR, etc.).

2. Il protocollo del mouse

1. preparativi
   1. Disporre 2 farfalla 25 aghi G. Facoltativamente, preparare 2 farfalla 25 aghi smussati G taglio presentando il bordo tagliente dell'ago.
   2. Sterilizzare strumenti chirurgici: 2 paia di forbici, pinze smussato-taglio, emostatico, forcipe dente-tessuto sterilizzati in autoclave a 121 ° C per almeno 30 minuti su impostazione gravità (a secco).
   3. Preparare eparinizzato PBS (30 unità / ml) aggiungendo 30 unità di eparina per ml di soluzione di PBS 1x. Utilizzare a temperatura ambiente. 25 ml è il volume minimo necessario per animale.
   4. stream eparinizzato PBS nelle linee pompa peristaltica e gli aghi a farfalla per evitare bolle d'aria.
2. Perfusione dei polmoni e la raccolta di MP-leucociti
   1. Eutanasia l'animale da una dose eccessiva di 8% isoflurano. Confermare l'eutanasia dal monitoraggio respirazione cessazione.
   2. Al momento della cessazione della respirazione, aprire immediatamente le cavità peritoneale e al torace con le forbici sterili e pinze dente-tessuto. Effettuare una incisione addominale mediana lungo l'addome fino al processo xifoideo.
   3. Sollevare lo sterno con le pinze, con cautela tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati, senza pungere qualsiasi organo interno o grandi vasi sanguigni. Bloccare una pinza emostatica sullo sterno, e rostralmente piegare la gabbia toracica per esporre il complesso cardiopolmonare.
   4. Bloccare la vena cava con un emostatico per evitare la perfusione a ritroso del fegato (vedi la discussione).
   5. Inserire un ago a farfalla collegato al tubo di efflusso della pompa peristaltica nel ven destratricle del cuore, ed un secondo ago a farfalla collegato ad una raccolta siringa da 2 ml nel ventricolo sinistro del cuore, avoidingpenetration del setto interventricolare.
   6. Accendere la pompa ad una velocità di circa 2 ml / min e raccogliere i primi millilitri di perfusato sangue contaminato nella siringa di raccolta fino a quando il perfusato si trasforma dallo scuro al chiaro rosso (Scartare il perfuste sangue contaminato).
   7. Senza cessazione della pompa peristaltica, rapidamente sostituire la raccolta siringa da 2 ml con una siringa da 10 ml raccolta e raccogliere 10 ml di perfusato polmone impiegando una maggiore velocità di perfusione (fino a 4 ml / min). Monitorare continuamente il flusso perfusato nella siringa raccolta, evitando la formazione di vuoto.
   8. Cessare la portata della pompa peristaltica.
3. I leucociti Estrazione
   1. Centrifugare il perfusato per 10 minuti a 400 × g.
   2. Aspirare il fluido.
   3. Aggiungere 10 ml di PBS o mezzo, centrifugare a 400xg per 10 min, e aspirare il liquido. Ripetere questa operazione tre volte. L'uso di PBS o mezzo dipende il conseguente impiego del campione.
   4. Aggiungere 10 ml di PBS o medie, centrifugare a 400 xg per 10 min, e aspirare il liquido.
   5. Ricostituire cellule alla concentrazione desiderata, basati sull'utilizzo campione (FACS, PCR, etc.).

Risultati

La mostra MP-vano una diversa composizione dei leucociti sottoinsieme rispetto ai leucociti circolanti. Citometria a flusso di analisi, sottopopolazioni di leucociti sono stati identificati e quantificati per caratterizzare la composizione sia del circolante e leucociti MP. Granulociti e linfociti sono stati identificati sulla base disperde in avanti e laterali. All'interno dei linfociti, NKRP-1 le cellule ^luminose sono stati identificati come cellule NK, CD3 ^+,...

Discussione

Il metodo qui presentata consente la raccolta selettiva e studiando della popolazione unica di MP-leucociti. Rispetto al circolante o leucociti splenici, la popolazione MP è caratterizzata da una diversa composizione delle sottopopolazioni di leucociti, livelli di attivazione superiori, maggior rilascio di varie citochine, e più elevati livelli di mRNA di pro- e citochine antinfiammatorie ^2,3. In particolare, abbiamo dimostrato che le cellule MP-NK sono più citotossico cellule NK circolatori contro varie cell...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Autoclud Pompa
Ago a farfalla	OMG		26G
Ago a farfalla	OMG		21G*3/4"
Siringa	Pic soluzione		1 ml
Siringa	Pic soluzione		2,5 ml
Siringa	Pic soluzione		5 ml
Siringa	Soluzione Pic	10 ml

peristalticaSiringa Soluzione Pic 25 ml Pinza a taglio smussato Emostatico a forbice Pinza tissutale Eparina sodica mucosa suina (senza conservazioni)Sigma Aldrich